Determinación del nivel de expresión de la proteína en células cultivadas por Immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula

Resumen

En la actualidad, coloración inmunofluorescente en células fijas es el método de elección para la determinación de los niveles de expresión de la proteína cuando información morfológica también es necesario. Este protocolo presentada en este documento se proporciona para un método alternativo de immunocytochemistry en bloques de parafina-encajado de la célula.

Resumen

Tinción inmunofluorescente es actualmente el método de elección para la determinación de los niveles de expresión de la proteína en los sistemas de cultivo celular información morfológica también es necesario. El protocolo de immunocytochemical que manchaba en bloques de parafina-encajado de la célula, presentados en este documento, es una excelente alternativa a la tinción inmunofluorescente en células fijas parafina-encajado. En este protocolo, un bloque de parafina celular de células HeLa fue preparado usando el método de plasma thromboplastin e inmunocitoquímica se realizó la evaluación de dos marcadores de proliferación, CKAP2 y Ki-67. Los núcleos y morfología citoplasmática de las células HeLa fueron bien preservados en las diapositivas de la célula en bloque. Al mismo tiempo, los patrones de tinción CKAP2 y Ki-67 en la inmunocitoquímica eran absolutamente similares a los de immunohistochemical que manchaba en tejidos de cáncer de parafina. Con condiciones de cultivo de células modificadas, incluyendo la incubación de células HeLa en condiciones libres de suero, el efecto podría evaluarse preservando información arquitectónica. En conclusión, la inmunocitoquímica en bloques de parafina-encajado de la célula es una excelente alternativa a la tinción inmunofluorescente.

Introducción

En la mayoría de los laboratorios, bloques de parafina-encajado de la célula no se utilizan. Por el contrario, fija las células cultivadas, células no embebido en parafina, se emplean en estudios de localización subcelular. Para aquellos cultivos de células, se ha utilizado la fluorescencia en lugar de cromógeno. Por lo tanto, coloración inmunofluorescente es actualmente el método de elección para la determinación de niveles de expresión de la proteína en la investigación utilizando células culturas¹. Diapositivas preparadas para la tinción inmunofluorescente, sin embargo, pueden observarse sólo bajo microscopia inmunofluorescente, que podría mostrar imágenes muy diferentes de las indicadas en el plano microscopia². Además, preservación de portaobjetos para la tinción inmunofluorescente requiere protección contra la luz brillante y fluorescentes señales se vuelven más débiles con la exposición repetida de la proyección de imagen debido a la pérdida de la señal fluorescente³. Los resultados de inmunocitoquímica en bloques de parafina-encajado de la célula son muy similares a los de inmunohistoquímica en tejido parafina-encajado⁴, y fácilmente puede ser traducidos en información clínica. Por lo tanto, inmunocitoquímica puede ser una excelente alternativa. Sin embargo, preparación de bloque celular no ha sido popular en los laboratorios de investigación básica. En este protocolo, entonces, preparación de bloque celular y la coloración immunocytochemical se proporcionan para promover el uso de este método en el campo de los estudios de cultivo celular.

Immunocytochemistry y la preparación del bloque de la célula no son métodos únicos, y ya se han aplicado de diagnosis clínica investigación básica^4,5. Aunque la preparación de bloque celular varios métodos han sido registrados^4,6 el plasma thromboplastin método es simple, rentable y fácilmente adaptable. Por lo tanto, en el protocolo presentado en este documento, la tromboplastina-plasma método^4,5,6,7,8 se utiliza para la preparación de bloques de parafina-encajado de la célula.

En el presente estudio se demostraron los procedimientos detallados para la preparación de bloques de celdas de plasma thromboplastin y el método de inmunocitoquímica con dos marcadores de proliferación. Un marcador es citoesqueleto proteína 2 (CKAP2), que se ha divulgado recientemente como un marcador mitótico^9,10,11; el otro es Ki-67, que es el más conocido de marcador de proliferación¹². El régimen representativo se muestra en la figura 1.

Protocolo

El protocolo de estudio fue aprobado por el institucional de Junta de centro nacional del cáncer, Corea (NCCNCS-12-630).

1. preparación (30 minutos)

1. Para el cultivo de células HeLa (CCL-2, ATCC), utilice el medio DMEM completo 10 mL (suero bovino fetal 10%, 1% pen-strep) en una placa de cultivo de 100 mm. Para preparar suero de hambre las células HeLa, incubar las células HeLa confluentes en DMEM sin suero fetal bovino durante 48 horas, como se describe en un anterior estudio¹¹.
2. Para separar las células, lavar con solución salina 2 mL con tampón fosfato (PBS) y añadir tripsina de EDTA de 0.25% de 2 mL por placa de cultivo de 100 mm. A continuación, incubar durante 2-3 minutos en un incubador de CO₂ a 37 ° C.
3. Añadir 5 mL de medio DMEM completo a la placa de cultivo para desactivar la tripsina y transferir las células separadas a un tubo de 15 mL. Luego, centrifugar las células a 300 x g durante 10 min formar un pellet.
4. Quite el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con PBS frío 2 mL por centrifugación a 300 x g durante 10 minutos.
5. Después de la eliminación del sobrenadante, agregar 1 mL de etanol al 95% para el precipitado de células y mezclar el sedimento celular con etanol con un vórtex. Mantenga las células fijas en el hielo hasta que la preparación del bloque de la célula.

2. célula-bloque preparación (1 h 30 min)

1. Para la preparación de plasma congelado alícuotas, recoja EDTA plasma de sangre de donantes sanos y centrifugar a 13.000 x g durante 10 minutos recoja el plasma sobrenadante y tubos alícuota 200-400 μL cada en microcentrífuga. Almacenar las alícuotas a-80 ° C hasta su uso. Cuando las alícuotas de plasma congelado, recuperarlos y descongelar el plasma por la incubación a 37 ° C durante 5 minutos.
2. Centrifugar las células fijadas a 700 x g durante 10 minutos, luego deseche el sobrenadante.
3. Mezclar el sedimento celular con 2 gotas (aproximadamente 200 μL) del plasma, 2 gotas de tromboplastina y 2 gotas de cloruro de calcio de 0,025 M. Luego, mezclar mediante pipeteo.
4. Deje que la mezcla formar un coágulo de células a temperatura ambiente durante 10 min, como se muestra en la figura 2A. Luego, lavar el coágulo de células con PBS dos veces vertiendo y PBS con una pipeta. El coágulo de la representante de la célula blanco se muestra en la figura 2B.
5. Humedecer un trozo de papel de filtro con formalina y envuelva el coágulo de células con el papel de filtro previamente humedecido. Luego, coloque la mezcla coagulada con un pincette en una cinta de tejido como se muestra en la figura 2.
6. Lugar el cassette de tejido en un frasco de vidrio conteniendo 50 mL de formalina tamponada (formol al 10% en PBS) durante la noche a 4 ° C para la fijación de formalina.

3. tejido procesamiento y la inclusión en parafina (noche)

1. Cargar la cinta de tejido que contiene el coágulo de células formalina-fijo en un procesador de tejido durante la noche como se describió anteriormente¹¹. El proceso de tejido es para eliminación de agua y acondicionamiento de células fijadas antes de la inclusión en parafina. Para la investigación sin procesamiento de tejidos, realizar el tejido procedimiento de procesamiento, como se muestra en la tabla 1.
2. Encienda la climatizada empotrar estación y 60 minutos más tarde, verificar que hay parafina fundida en el molde de metal en ella (Figura 2D).
3. Tome el coágulo formado de la célula del cassette de tejido y colóquelo en la parafina fundida en el molde de metal.
4. Lugar el nuevo cassette de tejido sin la tapa en el molde de metal que contiene la celda coagula en el medio de la parafina fundida y verter más parafina fundida en el cassette de tejido y en el molde de metal. Entonces, que la parafina solidifique en la placa fría durante 30-60 segundos.
5. Separar el cartucho tejido del molde de metal. Entonces, el bloque de parafina de la célula está listo para inmunocitoquímica. El coágulo de células incrustadas en el bloque de parafina-encajado de la célula es indicado por la flecha en la Figura 2E.

4. preparación de portaobjetos para inmunocitoquímica (1 h)

1. Revise el área para el coágulo de células en el bloque de la célula de la parafina y cortar el bloque de la célula con espesores de 3-4 μm utilizando un micrótomo. Coloque las secciones de parafina en portaobjetos de vidrio recubierto de silano, como se muestra en la figura 2F.
2. Coloque la sección los portaobjetos en un horno de 37 ° C durante 30 min para hacer las secciones que se adhieren a las diapositivas.

5. inmunocitoquímica de bloques de celdas (6 h)

Nota: Para immunocytochemical que manchaba en secciones de bloque celular, varios kits pueden utilizarse (véase Tabla de materiales). Todos los kits tienen diferentes sensibilidades y especificidades dependiendo de sus modificaciones.

1. Incubar las secciones en 50 mL de xileno por 4 min a-paraffinize.
2. Incubar los portaobjetos en etanol al 100% por 2 min para la deshidratación y dos veces en etanol al 95% y en etanol al 80% por 2 min. Luego, retire el etanol en agua durante 10 minutos.
3. Para la recuperación de antígeno, coloque los portaobjetos en un tarro que contiene 40 mL Tris-EDTA recuperación tampón, pH 9.0 y hervir en una olla durante 30 minutos.
4. Lavar los portaobjetos con agua corriente e incubar en etanol al 95% durante 10 min a 4 ° C. Luego, marque el área de tinción de células en el portaobjetos con un lápiz de Papanicolau para la identificación fácil.
5. Lavar los portaobjetos en solución salina tamponada con Tris que contiene 0.2% Tween 20 (TBS-T) e incubar en el bloque de peróxido de hidrógeno (véase Tabla de materiales) a temperatura ambiente durante 15 min eliminar cualquier actividad de la peroxidasa de remanente. Luego, lave las diapositivas en TBS-T tres veces de 2 minutos cada uno.
6. Preparar la solución de anticuerpo diluido por diluir el anticuerpo primario en el bloque de proteína (véase Tabla de materiales). Por ejemplo, el CKAP2 anticuerpo primario puede ser diluido 1: 100 y el Ki-67 anticuerpos 1: 500. Luego, incubar los portaobjetos en 100 μl de solución de anticuerpo diluido durante 1 hora.
7. Después del lavado en TBS-T cinco veces por 2 minutos, incubar los portaobjetos en el reforzador de anticuerpo primario en el juego por 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
8. Después del lavado en TBS-T cuatro veces por 2 minutos, añadir 2 gotas de polímero HRP (un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano) e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos.
9. Después del lavado en TBS-T cinco veces por 2 minutos, agregar 100 μl de solución de diaminobenzidina (DAB) (véase Tabla de materiales) e incubar el portaobjetos durante 3 minutos.
10. Después del lavado en TBS-T dos veces, añada 100 μl de solución de hematoxilina (la mezcla de 100 μl de la hematoxilina y 600 μl de agua destilada) e Incube los portaobjetos durante 1 minuto.
11. Después de lavar los portaobjetos en TBS-T una vez, deshidratar por incubando en etanol al 95% por 2 min, inmersión en etanol al 95% una vez e inmersión en etanol al 100% dos veces. Luego, incubar el portaobjetos en xileno de 40 mL en un frasco de vidrio durante 5 minutos.
12. Cuando las diapositivas estén secas de xileno, Monte el respectivo cubreobjetos.
13. Observar los patrones de tinción utilizando la microscopía de luz.

Resultados

En un portaobjetos de tinción hematoxilina y eosina del bloque parafina-encajado de la célula (Figura 3AB), la mayoría de los núcleos y el citoplasma de las células están intactas, lo que sugiere que la preservación morfológica con el actual protocolo ( Figura 3A). En la coloración immunocytochemical, coloración positiva de CKAP2 se observó en el huso mitótico y cromatina condensada y citoplasma (figura 4), previamente divulgados¹⁰. Tinción de Ki-67 se observó en los núcleos celulares, como esperado (figura 4). Sólo las células con CKAP2 tinción de cromatina condensada (ver las flechas en la Figura 4AB) eran las células mitotic. Muchas células CKAP2-positivos se muestran en las células HeLa altamente mitóticas que se habían preparadas después de una incubación en medio completo (Figura 4A). En comparación, hubo pocas células CKAP2-positivo en el suero de hambre las células HeLa (Figura 4B). La mayoría de las células HeLa altamente mitotic eran Ki-67 positivo (figura 4). En contraste, el índice Ki-67-positive en las células HeLa suero de hambre seguía siendo tan alto como 50% (figura 4). Estos resultados son absolutamente comparables a los de un anterior informe^11, que sugiere que la CKAP2 es un marcador más confiable de proliferación en células de cáncer que es Ki-67.

En bloques de celdas mal preparados, los núcleos están separados del citoplasma, y también hay, en consecuencia, mala preservación morfológica. Incubación más largo que la noche de las células fijas en un refrigerador puede hacer que estos pobres resultados. Otro problema importante es que las células no se tiñen bien por inmunocitoquímica, a pesar de la excelente morfología. Este problema se presenta más a menudo cuando el coágulo de células es pequeño. Por lo general, la intensidad de la tinción es irregular como se muestra en la figura 3B; pero cuando el coágulo de células es mayor, hay mucho menos posibilidad de tinción irregular. Por lo tanto, en este protocolo, hemos aumentado los volúmenes de plasma, tromboplastina y cloruro de calcio para formar un coágulo de células grandes.

Figura 1: esquema de preparación de bloque celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: ilustración de la preparación de parafina bloque celular. (A) coágulo de células de la tromboplastina-plasma en tubo. B coágulo de células TP después de lavado PBS. Coágulo (C) células en papel de filtro humedecido. (D) estación inclusión de tejido con cera fundida. Molde de metal (flecha) tiene cera fundida para la solidificación. E coágulo de células incluidas en parafina (flecha) embebido en parafina o bloque parafina-encajado de la célula. F sección fina de parafina sobre la parte central de un portaobjetos recubierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: preparación de bloque celular y confirmación de calidad por la hematoxilina y la eosina y el immunostaining. (A) imagen de hematoxilina-y-eosina-manchadas de células HeLa en una sección de la célula-bloque parafina-encajado. (B) irregular tinción de Ki-67 en immunocytochemistry en mal preparado sección celular-bloque parafina-encajado. Barras de escala son (A) 100 y (B) 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: coloración Immunocytochemical en bloque parafina-encajado de la célula de células HeLa. (A) CKAP2 tinción bajo condiciones altamente mitotic. (B) CKAP2 tinción bajo condiciones de escasez de suero. (C) Ki-67 tinción bajo condiciones altamente mitotic. (D) Ki-67 tinción bajo condiciones de escasez de suero. Se muestran barras de escala de 100 μm. Las puntas de flecha indican las células positivas de CKAP2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Procedimiento	Pasos	Solución	Tiempo/temperatura
Deshidratación	1	alcohol al 70%	15 min/RT
	2	80% de alcohol	15 min/RT
	3	alcohol de 95%	15 min/RT
	4	100% alcohol	15 min/RT
Claro	1	Xileno	60 min/4 ° C
	2	Xileno	10 min/RT
	3	Xileno	10 min/RT
	4	Xileno	10 min/RT
* RT, temperatura ambiente

Tabla 1. Procedimiento de elaboración del tejido.

Discusión

Tinción inmunofluorescente en células cultivadas fijadas es actualmente el método de elección para la determinación del nivel de expresión de la proteína en células conservando información morfológica¹. Sin embargo, inmunocitoquímica en bloques de parafina-encajado de la célula puede ser una excelente alternativa. Se han descrito los procedimientos detallados para la preparación de bloques de parafina-encajado de la célula e immunocytochemistry en este protocolo, y esperamos que puede facilitar la aplicación de immunocytochemistry en estudios celulares.

Immunocytochemistry tiene varias ventajas sobre coloración inmunofluorescente. Tinción inmunofluorescente de células generalmente requiere células recién cultivadas, pero bloques de parafina de la célula pueden conservarse a temperatura ambiente durante varios años¹³. Además, la inmunocitoquímica en bloques de celdas puede explorar patrones de expresión intracelular empleando el mismo anticuerpo usado en rutina inmunohistoquímica en tejidos humanos⁴. Además, pueden explorar los cambios en los niveles de proteínas o modificaciones del posttranslational por Pre incubar las células con diversos fármacos o bajo diferentes condiciones de cultivo¹¹.

En contraste con las ventajas de la coloración immunocytochemical, la preparación de bloques de parafina-encajado de la célula toma tiempo y es costoso¹⁴. Además, laboratorios de investigación de la mayoría carecen de experiencia en esta técnica, y errores técnicos en tales circunstancias son comunes. Los errores más comunes son pobre preservación de la morfología de la célula e immunocytochemical pobre o irregular, la coloración en las secciones de bloque celular de parafina. Estos y muchos otros pueden evitarse haciendo bloques de celdas en las mejores condiciones de la célula y con suficiente solución para formar coágulos de la célula.

Como una manifestación del presente Protocolo, se prepararon bloques de celdas para las células HeLa, y coloración immunocytochemical fue realizada para los dos marcadores de proliferación, CKAP2 y Ki-67, como previamente divulgados¹¹. Para inmunocitoquímica, las células fueron manipuladas por la incubación en medios con y sin suero fetal bovino y se pudo observar el efecto de la inanición de suero. Estos bloques de células de parafina-encajado preparado se pueden emplear para una gran cantidad de anticuerpos, porque muchas diapositivas se pueden preparar de un bloque de celdas usando sólo una sección μm de espesor de la célula-bloque 4-5 por diapositiva. Por lo tanto, los patrones de expresión correspondientes a dos condiciones diferentes pueden evaluarse con varios anticuerpos diferentes. Los patrones de la inmunotinción para CKAP2 y Ki-67 en el cáncer de los tejidos ya han sido reportados^9,10,11,12y la immunocytochemical que manchaba resultados puede ser evaluado fácilmente, porque la patrones de tinción fueron bastante similares a las de inmunohistoquímica.

En conclusión, immunocytochemical que manchaba en bloques de parafina de la célula puede ser una excelente alternativa a la tinción inmunofluorescente. por otra parte, puede ser fácil y fiable empleado en la investigación básica de perfiles de expresión en líneas celulares preservando información morfológica.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa Cells	ATCC	HeLa (ATCC CCL-2)
Ki-67 Antibody	Thermo Fisher Scientific	RM-9106-S1
Paraffin	Leica	39601006
Xylene	Fisher SCientific	1330-20-7,100-41-4
Ethenol	GD Chem	DJ16016
Hematoxylin	Agilent	10118581
DAB Quanto Kit	Thermo Fisher Scientific	TA-125-QHDX, QHCX 170405
Ultravision LP detection Kit	Thermo Fisher Scientific	PBQ141209, LPB141209, LPH141210	Kit for immunocytochemistry; contains protein block
TintoRetriever Pressure Cooker	Bio SB Corporation	BSB 7008
Tris-buffered saline	iNtRON Biotechnology	IBS-BT008
Tween 20	USB Corporation	115106
Thromboplastin	Neoplastin Cl Plus	NC0591432
Tris-EDTA retrival Buffer	Dignostic Biosystem	E625-A
Trypsin EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone Laboratories Inc	SH30910.03
DMEM	Hyclone Laboratories Inc	SH30243.01
Antibiotic-Antimycotic, 100X	Thermo Fisher Scientific	15240062
Ultra vision peroxide block H2O2	Thermo Fisher Scientific	02Q141212
Mounting Medium	Thermo Fisher Scientific	363313
Pap-Pen	Vector Laboratories	H-4000
Filter Paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-0155
Calcium Chloride	Sigma-Aldrich	21115-100ml
Phosphate-buffered saline	PAA Laboratories	H21-002
Formalin	Daejung	50-00-0
15 ml tube	SPL Life Sciences	50015
tissue processing cassette	Simport	M492-5
100 mm culture dishes	BD Biosciences	08-772E
Glass Slide	Muto Pure Chemicals	140712
Cover Glass	Marienfeld	2262817
Glass Zar	Hyunil Lab-Mate	HIP-1027
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Class II Laminar Flow Hood	Thermo Fisher Scientific	1300 series A2
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific	Series A2
Tissue Processor	Leica BioSystem	TP1020
Microtome	Thermo Fisher Scientific	HM340E
Microscope	Olympus	CX-21
Paraffin embedding station	Thermo Fisher Scientific	EC 350-1, EC 350-2
Tissue Section Bath (Round)	CellPath	HCP-JAW-0100-00AEU
Fume Hood	Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd.	FH-150