Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

Resumen

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo en vivo gene cardiaco edición en ratones usando Virus de Adeno-Associated recombinante (rAAV)-mediado entrega de CRISPR. Este protocolo ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar cardiomiopatía distrófica en distrofia muscular de Duchenne y puede utilizarse para generar nocaut cardiaco específico en los ratones postnatales.

Resumen

Agrupado, regularmente otro, corto, palindrómico repetición (CRISPR) sistema ha facilitado enormemente ingeniería del genoma en células cultivadas y los organismos vivos de una gran variedad de especies. La tecnología CRISPR también se ha explorado como novela terapéutica para un número de enfermedades humanas. Datos de prueba de concepto son altamente alentadores ejemplificado por estudios recientes que demuestran la viabilidad y la eficacia del enfoque terapéutico basado en la edición de gene para la distrofia muscular de Duchenne (DMD) utilizando un modelo murino. En particular, intravenosa e intraperitoneal inyección de la rh.74 del serotipo del virus adeno-asociado recombinante (rAAV) (rAAVrh.74) ha permitido la entrega eficiente cardiaca de Staphylococcus aureus proteína CRISPR 9 (SaCas9) y dos Guía RNAs (gRNA) para eliminar una región genómica con un codón mutante en el exón 23 del gen Dmd de ratón. Este mismo método puede utilizarse también para noquear el gen de interés y estudiar su función cardiaca en ratones postnatales cuando el gRNA está diseñado para atacar la región codificante del gen. En este protocolo, se muestra en detalle cómo Ingeniero vector rAAVrh.74 CRISPR y cómo lograr el parto alta eficiencia cardiaca en ratones neonatales.

Introducción

El cluster regularmente otro corto palindrómico repetición (CRISPR) tecnología, representa el avance más reciente en la ingeniería del genoma y ha revolucionado la práctica actual de la genética en las células y organismos. La edición del genoma basado en CRISPR utiliza una guía única RNA (gRNA) para dirigir una endonucleasa asociada a CRISPR como proteína CRISPR 9 (Cas9) y Cpf1 con un objetivo de ADN genómico que es complementario en orden a la protospacer codificada por el gRNA con un protospacer específico motivo adyacente (PAM)^1,2. El PAM varía dependiendo de la especie bacteriana del gen Cas9 o Cpf1. El más comúnmente utilizado nucleasa Cas9 derivado de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconoce una secuencia de PAM de NGG que en el ADN genómico, en la cadena de destino no se encuentra directamente aguas abajo de la secuencia de destino. En el sitio de destino, las proteínas Cas9 y Cpf1 generan una rotura de doble cadena (DSB), que entonces se repara vía intrínseca celular ADN mecanismos de reparación incluyendo final no homólogo a (NHEJ) y vías de reparación dirigido por homología (HDR)^{3, 4}. En ausencia de una plantilla de ADN por recombinación homóloga, el OSD se repara sobre todo por la vía NHEJ propenso, que puede resultar en inserciones o deleciones (indels) de nucleótidos causando mutaciones del mutágeno ' frameshift ' si el OSD se crearon en la codificación región de un gen^5,6. Así, el sistema CRISPR ha sido ampliamente utilizado para las mutaciones de pérdida de función en varios modelos de celulares y organismos enteros, con el fin de investigar la función de un gen. Por otra parte, el catalítico inactivo Cas9 Cpf1 transcripcionalmente se han desarrollado para y epigenéticamente modulan la expresión de genes de destino^7,8.

Más recientemente, SpCas9 y SaCas9 (derivado de estafilococo áureo) han sido empaquetados en vectores de virus adeno-asociado recombinante (rAAV) para la corrección del gen postnatal en modelos animales de enfermedades humanas, en particular, Duchenne distrofia muscular (DMD)^{9,10,11,12,13,14,}la¹⁵. DMD es una enfermedad recesiva x-ligada fatal causada por mutaciones en el gen DMD , que codifica la distrofina proteína^16,17, que afecta a aproximadamente uno en 3500 nacimientos masculinos según evaluación del recién nacido^{18 , 19}. se caracteriza por debilidad muscular progresiva y pérdida. Los pacientes DMD suelen perder la habilidad de caminar entre 10 y 12 años de edad y mueren de insuficiencia respiratoria o cardiaca a la edad de 20-30 años²⁰. En particular, la miocardiopatía se convierte en > 90% de los pacientes DMD y representa la causa principal de muerte en pacientes DMD^21,22. Aunque Deflazacort (una droga antiinflamatoria) y Eteplirsen (un exón que salta medicina para salto de exón 51) se han aprobado recientemente para DMD por alimentos y drogas (FDA)^23,24, ninguno de estos tratamientos corregir el defecto genético en el nivel genomic de la DNA. El ratón mdx, que lleva una mutación de punto en el exón 23 del gene del dystrophin, ha sido ampliamente utilizado como un modelo DMD²⁵. Además, previamente demostramos que la expresión de distrofina funcional fue restablecida por la eliminación en el marco de la DNA genomic que abarca exones 21, 22 y 23 en los músculos esqueléticos de ratones mdx con entrega de Ad-SpCas9/gRNA intramuscular⁹ y en los músculos del corazón de mdx/utrophin^+- ratones con entrega rAAVrh.74-SaCas9/gRNA intravenosa e intraperitoneales²⁶.

En este protocolo, describimos en detalle cada paso en la edición de postnatal gen cardiaca para restaurar distrofina en mdx/utrophin^+- ratones utilizando vectores de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, de gRNA diseño análisis de distrofina en las secciones de músculo de corazón.

Protocolo

Los animales utilizados en el presente Protocolo se mantuvieron en recursos de animales de laboratorio de estado de Ohio la Universidad conforme a las directrices de uso de animales. Todos los estudios en animales fueron autorizados por el institucional Animal cuidado, uso y Comité de revisión de la Universidad Estatal de Ohio.

1. diseño y reproducción de gRNAs en el Vector CRISPR

1. Seleccione 2 gRNAs a distrofina intrón 20 y del intrón 23 (i20 y i23) para SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT y i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (la secuencia de PAM es subrayada y en cursiva).
   Nota: Los sitios de destino para el i20 y i23 son aproximadamente 23 kilo pares (kbp) lejos. Para interrumpir un gen de codificación, la secuencia de dos gRNAs a los exones comunes con el PAM NNGRRT para SaCas9 (preferiblemente NNGAAT, NNGGGT y NNGAGT) y se recomienda distancia dentro 20 kbp.
2. Utilice los siguientes parámetros PCR a Recueza la gRNA oligos (100 μmol/L) en el 1 x de buffer de recocido (5 x recocido existencias contiene 0,5 mol/L de acetato de K, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L de acetato de magnesio, pH7.4): 95 ° C 10 min, 90 ciclos de 95 a 59 ° C, con un 0,4 ° C disminuye por ciclo de 20 s, 90 ciclos de 59 a 32 ° C con una disminución de 0.3 ° C por ciclo de 20 s, 20 ciclos de 32 a 26 ° C con una disminución de 0.3 ° C por ciclo de 20 s.
3. Ligar los oligos gRNA recocido en el pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA con BsaI y T4 ADN ligasa en una reacción (1 μl 50 ng/μl pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 1 μl recocido oligos, 1,5 μl 10 x T4 ADN ligasa de tampón, 0,5 μl T4 ADN ligasa, 1 μl BsaI, 10 μl ddH₂O ), con la condición siguiente de la reacción en un ciclador PCR: 5 ciclos de 37 ° C 5 min y 16 ° C 10 min]; 37 º C 20 min; 80 ° C 5 min.
4. Transformar el 15 μl del producto de la ligadura en células competentes de 30 μL, placa las células en placa de agar con 100 μg/mL de ampicilina y cultura a 37 ° C durante 24 h.
5. Recoger 5-10 colonias y cultivo en medio LB con ampicilina de 100 μg/mL a 37 ° C, 250 rpm en un Incubador agitador para 3-4 h.
6. Las colonias por PCR de la pantalla: 10 μl 2 x master mix PCR 8 μl ddH₂O cultura de e. Coli de 1 μl, 1 μl 10 μmol/L U6-adelante la cartilla, cartilla reversa del gRNA i20 o i23 1 μl. Los parámetros del ciclo de PCR: 95 ° C 5 min, 35 ciclos de 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.
7. Preparar la cultura de 5 mL de los clones positivos agregando 4 mL fresco LB containing100 medio μg/mL ampicilina y cultura durante la noche a 37 ° C, 250 rpm.
8. Purificar el plásmido DNA usando el kit de extracción de plásmidos apropiados y verificar el plásmido por Sanger secuenciación con el primer avance de U6.
9. Cultura células C2C12 en DMEM suplementado con 10% FBS y 1% Pen-Strep hasta llegar a la confluencia de ~ 70% para el gene de la eficacia de la plásmidos de la edición de la prueba.
10. Electroporate un total de 5 μg SaCas9/gRNA mezcla de plásmido en relación molar 1:1 en las células 1 x 10⁶ C2C12 según protocolo del fabricante.
11. Transfección después de 48 h, después de cosechar las células C2C12 y extraer la DNA de genomic.
12. Uso 100 ng ADN genómico como plantilla para realizar la reacción de PCR para locus de distrofina de ratón: avance primer 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 μl de 10 μmol/L), reverse primer 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 μl de 10 μmol/L), 10 μl 2 x el verde PCR master mix, 7 μl ddH2O, (ADN genómico) 1 μl 100 ng). Uso de PCR ciclismo condiciones 95 ° c 5 min, 35 ciclos [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.

2. producción de rAAV

1. Para la cultura las células, las células de AD293 en 20 a 40 de platos de 15 cm de la semilla y mantener en DMEM suplementado con 10% FBS y 1% Pen-Strep hasta llegar a la confluencia de ~ 90% para la transfección.
2. Diluir 3 plásmidos con 200 μL reducción medio de suero (por plato): 1) 10 μg pHelper; 2) 5 μg pXR (rh.74 u otros serotipos) y 3) un total de 5 μg de pX601-i20 y pX601-i23 mezcla (proporción 1:1). Realizar la transfección polietilenimina (PEI) mezclando con 80 μl PEI e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos agregar la mezcla a los cultivos de células AD293 en forma de gota a gota.
3. Para la producción de AAV virus, después de transfección de 72 h post, use un raspador celular para recoger los medios de comunicación y los pellets de células AD293 por centrifugación a 1100 x g durante 10 minutos.
4. Vuelva a suspender los pellets de células en tampón de lisis de rAAV 15 mL (50 mmol/L de Tris Base, 150 mmol/L de NaCl, pH 8,5) seguidos de 3 ciclos de congelación y descongelación con alternancia de incubación en nitrógeno líquido y un baño de agua de 42 ° C. Almacenar los lysates de la célula de-80 ° C para el procesamiento futuro si ellos no se procesan inmediatamente.
5. Filtro de los medios de cultivo con un filtro de 0,45 μm y un 40% PEG8000 en 2,5 mol/L NaCl a una concentración final de 8%. Incubar la mezcla a 4 ° C por 1 h y centrifugar a 1100 x g durante 15 minutos.
6. Resuspender el pellet en buffer de lisis de rAAV y combina con los lysates de la célula en el paso 2.3, seguida por el tratamiento de benzonase (50 U/mL) a 37 ° C durante 1 hora.
7. Centrifugue el rAAV benzonase tratada que contenga mezcla 1100 x g durante 15 min a 4 ° C y guarde el sobrenadante (la preparación del crudo rAAV).

3. rAAV purificación y concentración

1. Cargar la preparación rAAV crudo en un gradiente de iodixanol en un tubo de ultracentrífuga en el siguiente orden desde arriba hacia abajo: crudo AAV lisado (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5 mL 40% Iodixanol, 5 mL 58% Iodixanol. Llenar el restante volumen vacío del tubo a la parte superior utilizando 1 x DPBS.
2. Centrifugar las muestras a 230.000 x g en un rotor de ultracentrífuga durante 120 min a 10 º C y recolectar 3-4 mL de la fracción de gradiente de 40% que contiene las partículas de rAAV con una aguja de 18 G.
3. Diluir las partículas rAAV con 1 x DPBS y centrifugar utilizando la unidad de filtración centrífugas (MWCO 100 kDa). Repita este paso para el 3 - 5 veces y finalmente la preparación de rAAV a 300-500 μl.

4. rAAV Titering

1. Extraer el ADN genómico de 2 μl concentrado rAAV, precipitado con 3 NaOAc M en etanol y resuspender en 20 μl ddH₂O.
2. Obtener la curva estándar para cuantificación de rAAV por dilución seriada del plásmido pX601: 1 x 10⁹, 1 x 10^8,1 x 10⁷, 1 x 10⁶, 1 x 10⁵ copias en cada 10 μl ddH₂O. diluir el rAAV tratados con ADNasa muestras 1:10, 1:50, 1: 100 y 1: 1000.
3. Determinar titulación rAAV por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando qPCR Kit según instrucciones del fabricante en un sistema de PCR en tiempo real: 1 μl de 10 μmol/L de cada primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC y 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 μl de 2 x master mix PCR, 1 μl diluidas muestras de rAAV y 2 μl ddH₂O. ejecutan la reacción con los siguientes parámetros ciclismo: 95 ° C 3 min, 45 ciclos de 95 ° C 5 seg y 61 ° C 20 seg].

5. vía intravenosa y la inyección Intraperitoneal de rAAVrh.74-CRISPR en Neonatal mdx/utrophin^+- ratones

1. Inmovilizar los mdx/utrophin^+- cachorros ratón (día 3) colocando en hielo durante 1 minuto y luego administrar con 1 x 10¹² partículas virales en 50 μL por ratón sistémicamente a través de un enfoque de retro-orbital o una inyección intraperitoneal.
2. Permitir que los ratones recuperar y poner en sus jaulas hogar. A las diez semanas después de la administración de rAAV, eutanasia los ratones por exposición a CO₂ para la recolección de tejido.
3. Snap-congelar tejidos para extracción de DNA y RNA genómico y uso isopentano en nitrógeno líquido para congelar tejidos con temperatura óptima de corte para cryosectioning de refrigeración.

6. análisis del Gene de la blanco edición los resultados

1. Análisis de PCR de ADN genómico
   1. Aislar el total de ADN genómico de los tejidos del corazón de ratones mdx/utrophin^+- tratado con o sin rAAV.
   2. Utilizar el mismo protocolo en paso 1.12 para análisis de PCR.
2. Análisis de RT-PCR de la expresión de distrofina
   1. Extracto de RNA total de los tejidos del corazón con el kit de extracción de RNA siguiendo el manual del fabricante.
   2. Para reversa de la transcripción, tratamiento previo del RNA total con un libre de Rnasa DNasa y 5 μg de RNA tratado como plantilla para síntesis de cDNA de primera línea con el kit de transcripción inversa.
   3. Utilizar el producto de la transcripción reversa para análisis de RT-PCR de la expresión de distrofina con los iniciadores de ADNc de distrofina: GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT 5' y 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
3. Estimar el gene de la eficacia de edición por análisis de qPCR
   1. Estimar el gen edición eficacia por RT-PCR cuantitativa para detectar la reducción de las transcripciones que contienen 22 exón mediante el primer avance (exón 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA y el cebador reverso (exón 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Uso de Gapdh como un gen de referencia con el primer avance: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC y el cebador reverso: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
   2. Ejecutar la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) usando qPCR Kit según instrucciones del fabricante en un sistema de PCR en tiempo real y las condiciones de reacción 2-paso: 95 ° C 3 min, 45 ciclos de 95 ° C 5 s y 61 ° C 30 seg.
4. Inmunofluorescencia que manchaba para analizar la expresión de distrofina
   1. Cortar los tejidos congelados con un criostato en un espesor de 10 μm. fijar las secciones congeladas con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 15 minutos.
   2. Lavado x 2 con PBS e incubar con solución (10% de suero de caballo) de bloqueo durante 1 hora.
   3. Incubar el anticuerpo primario anti-distrofina, a 4 ° C durante la noche.
   4. Lavar los portaobjetos con PBS 3 veces, 5 minutos y se incuba con anticuerpos fluorescentes secundarios (1: 500) a temperatura ambiente durante 1 h.
   5. Montar las diapositivas usando el medio de montaje con DAPI y proyección de imagen con un microscopio confocal invertido.

7. objetivo análisis T7E1 análisis

1. Predecir los sitios potenciales de objetivo utilizando el CRISPR en línea herramientas de diseño tales como < http://crispr.mit.edu>.
2. Amplificar las regiones genómicas que cubre la parte superior sitios de fuera de objetivo potencial 5-10 por PCR: genomic DNA 200 ng, 1 μl alta fidelidad polimerasa de la DNA, 5 μl 10 x PCR Buffer mezclar, 1,5 μl 10 μmol/L de site-specific primers hacia adelantados y hacia atrás, ajuste el volumen total de 50 μL con ddH₂O.
3. Ejecutar los productos PCR por electroforesis, extraer y purificar el ADN utilizando un kit de extracción de gel. Medir la concentración mediante espectrofotometría.
4. Promover la formación del heterodúplex por desnaturalización y volver a recocer los amplicones purificados lentamente en el 2.1 de búfer utiliza a un ciclador PCR. Utilice las mismas condiciones de ciclismo como se detalla en el paso 1.2.
5. Digerir los productos re-recocidos durante 30 min a 37 ° C con la enzima de T7E1 de 0,5 μl y analizar la reacción por electroforesis en gel de agarosa al 1-2%.
   Nota: Los amplicones también pueden ser analizadas mediante secuenciación profunda dirigida.

Resultados

Debe evaluarse la eficacia de los gRNAs para inducir la supresión de la región Diana de ADN genómica en cultivos celulares antes de empaquetar a rAAV para estudios in vivo. Con este fin, los gRNAs y construcciones expresando SaCas9 eran electroporated en las células C2C12 y el ADN genómico se analizó por PCR con los cebadores que flanquean los sitios de destino (figura 1). Un producto PCR de ~ 500 bp indica eliminación exitosa de la DNA genomic de dest...

Discusión

En este protocolo, detallamos todos los pasos necesarios para lograr en vivo gene cardiaco edición en ratones postnatales con entrega mediada por el rAAVrh.74 de SaCas9 y dos gRNAs. Como se señaló anteriormente, este enfoque puede utilizarse para restaurar la expresión de distrofina en ratones distróficos como se describe en nuestro trabajo²⁷, pero también podría permitir estudios de genética reversa rápida de genes relacionados con cardiaco en ratones sin el largo proceso de la ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21428
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bio Safety Cabinets	Thermo Fisher Scientific	1347	1300 Series A2 Class II, Type A2
BsaI	New England BioLabs Inc	RO535S
Competent cells	Agilent Technologies	200314
Cell culture dishes, 150mm	Nest Scientific USA	715001
Cryostat	Leica Biosystems		Leica CM3050S
DMEM	Thermo Fisher Scientific	MT10017CV	Corning cellgro
Dystrophin antibody	Spring Bioscience	E2660
Fast-Ion Midi Plasmdi Kits	IBI Scientific	IB47111
FBS	Thermo Fisher Scientific	26-140-079
Filter Unit, 0.45μm	Thermo Fisher Scientific	166-0045
GoTaq Master Mixes	Promega	M7122
High-speed plasmid mini kit	IBI Scientific	IB47102
Horse serum	Abcam	ab139501
Isotemp 2239 Water Bath	Thermo Fisher Scientific	15-460-11Q
Isotemp Heat Block	Thermo Fisher Scientific	11-718
Inverted confocal microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC		LSM 780
LightCycler 480 instrument	Roche	5015243001	LightCycler 480 Instrument II
Large Capacity Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	46-910	Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002445	Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop spectrophotometers	Thermo Scientific	ND2000CLAPTOP	NanoDrop™ 2000/2000c
Oligos for i20-F	Integrated DNA Technologies		CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC
Oligos for i20-R	Integrated DNA Technologies		AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
Oligos for i23-F	Integrated DNA Technologies		CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC
Oligos for i23-R	Integrated DNA Technologies		GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
Oligos	Integrated DNA Technologies
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250ML
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
PEG8000	Sigma-Aldrich	89510-1kg-F
Polyethylenimine	Polysciences	23966
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
Quick-Seal centrifuge tube	Beckman Coulter Inc	342414
QIAquick Gel Extraction kit	Qiagen	28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits	Alkali Scientific	QS2005
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691
Rotor	Beckman Coulter Inc	337922	Type 70Ti
T4 DNA ligase	New England BioLabs Inc	M0202S
Thermal Cycler	Bio-rad	1861096
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026
Ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc	8043-30-1192	Optima le-80k
Ultra centrifugal filter unit	MilliporeSigma	UFC510096
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories, Inc	H-1200