Adeno 관련 바이러스 중재 배달 심장 유전자 쥐에서 편집에 대 한 CRISPR의

요약

여기 우리 vivo 심장 유전자 재조합 Adeno-Associated 바이러스 (rAAV)를 사용 하 여 마우스에서 편집을 수행 하는 자세한 프로토콜 제공-CRISPR의 납품을 중재. 이 프로토콜 듀 켄 씨 근이 영양 증에서 dystrophic 심장 근육 병 증을 치료 하는 유망 치료 전략을 제공 하 고 출생 후 쥐에서 심장 관련 녹아웃을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복 (CRISPR) 시스템은 크게 배양된 세포에 다양 한 종의 생물 게놈 엔지니어링을 촉진 했다. CRISPR 기술 또한 인간의 질병의 숫자에 대 한 새로운 치료제로 탐험 되었습니다. 개념 증명 데이터는 매우 고무적인 타당성과 듀 켄 씨 근이 영양 증 (DMD) murine 모델을 사용 하 여에 대 한 편집 기반 치료 방법은 유전자의 효능을 설명 하는 최근 학문에 의해 exemplified입니다. 특히, 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74)의 정 맥 및 복 주사 (SaCas9) 포도 상 구 균 CRISPR 관련 단백질 9의 효율적인 심장 배달 및 2 있었습니다. exon 23 마우스 Dmd 유전자에에서 돌연변이 codon 게놈 영역을 삭제 하려면 RNAs (gRNA) 안내. 이 같은 방법은 유전자의 관심 밖으로 노크 하는 gRNA 유전자의 코딩 지구를 대상으로 설계는 출생 후 마우스에 그들의 심장 기능을 공부도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리가 자세히 표시 rAAVrh.74 CRISPR 벡터 하는 방법 및 신생아 쥐에 고효율 심장 납품을 달성 하는 방법.

서문

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술 게놈 엔지니어링에서 가장 최근의 발전을 나타내고 세포와 유기 체 유전학의 현재 연습을 혁명을. CRISPR 관련 된 단백질 (Cas9) 9 등 CRISPR 관련 endonuclease 직접 단일 가이드 RNA (gRNA)을 이용 한다 CRISPR 기반 게놈 편집 하 고는 protospacer 시퀀스에 보완은 genomic DNA 대상에 Cpf1와 gRNA에 의해 인코딩 한 특정 protospacer 인접 한 모티브 (PAM)^1,2. PAM은 Cas9 또는 Cpf1 유전자의 세균성 종에 따라 다릅니다. 연쇄 상 구 균 pyogenes (SpCas9)에서 파생 된 가장 일반적으로 사용 되 Cas9 nuclease NGG 비 대상 가닥에 genomic DNA에서 직접 대상 시퀀스의 다운스트림 발견 되는 팸 시퀀스를 인식 합니다. 대상 사이트에 Cas9 및 Cpf1 단백질 생성 등 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 상 동 감독 수리 (HDR) 경로^{3내장 세포 DNA 수리 메커니즘을 통해 복구 다음, 이중 가닥 휴식 (DSB) 4}. 동종 재결합에 대 한 DNA 템플렛의 부재, DSB는 주로 수리 삽입 또는 삭제 (indels)에서 발생할 수 있는 오류가 NHEJ 통로 DSB 코딩에서 만들어진 경우 frameshift 돌연변이 일으키는 뉴클레오티드의 ⁶유전자^5,지역. 따라서, CRISPR 시스템은 널리 사용 되었습니다 다양 한 휴대폰 모델 및 전체 유기 체에 있는 손실의 기능 돌연변이 하는 유전자의 기능을 조사 하기 위하여. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 및 Cpf1 transcriptionally를 개발 되었습니다 그리고 epigenetically 조절 대상 유전자^7,8의 표현.

더 최근에, SpCas9 및 SaCas9 ( 황색 포도상구균에서 파생 됨)는 패키지 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV) 벡터 인간 질환의 동물 모델에서 출생 후 유전자 교정용으로 특히, 듀 켄 씨 근 위축 증 (DMD)^{9,10,11,12,13,,1415}. DMD는 치명적인 X 연결 된 열성 질병 dystrophin 단백질^16,17인코딩하는 DMD 유전자에 있는 돌연변이 기인한 신생아 심사¹⁸ 에 따르면 약 3500에서 한 남성 출생에 영향을 미치는 ^{, 19}. 진보적인 근육 약점 그리고 낭비 특징 이다. DMD 환자는 일반적으로 20-30 년²⁰의 나이 10 ~ 12 세 사이의 호흡기 또는 심장 실패의 다이 걸을 기능 손실. 특히, 심근에 개발 > DMD 환자와 나타냅니다 DMD 환자^21,22에 죽음의 주요 원인의 90%. 비록 Deflazacort (항 염증 약물) 및 Eteplirsen (는 엑손 exon 51를 건너뛰는 데 약을 건너뛰는) 최근 승인 된 DMD에 대 한 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)^23,24, 이러한 치료의 게놈 DNA 수준에서 유전적 결함을 수정 합니다. Exon 23 dystrophin 유전자의 점 돌연변이 운반, mdx 마우스 DMD 모델²⁵로 널리 사용 되었습니다. 또한, 우리 이전 기능 dystrophin 식 취재 exons 21, 22, 23 일 근육 광고-SpCas9/gRNA 배달^{9 사용 하 여 mdx 쥐의 골격 근육에서 게놈 DNA의 프레임 삭제에 의해 복원 된 시연} , 그리고 정 맥 및 복 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 배달²⁶를 사용 하 여 mdx/utrophin^/- 생쥐의 심장 근육에.

이 프로토콜에서 우리가 자세히 설명 출생 후 심장 유전자 dystrophin mdx/utrophin^/- 생쥐 dystrophin 분석 심장 근육 섹션에 gRNA 디자인에서 rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 벡터를 사용 하 여 복원 하려면 편집 모든 단계.

프로토콜

이 프로토콜에 사용 되는 동물의 오하이오 주립 대학 실험실 동물 자원에서 동물 사용 지침에 따라 유지 되었다. 모든 동물 연구 기관 동물 관리, 사용, 및 오하이오 주립 대학의 검토 위원회에 의해 승인 했다.

1. 디자인 및 CRISPR 벡터에 gRNAs의 복제

1. SaCas9에 대 한 dystrophin intron 20과 intron 23 (i20 및 i23)를 대상으로 하는 2 gRNAs 선택: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT 및 i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM 시퀀스는 밑줄을 표시 하 고 이탤릭체).
   참고: i20 i23에 대 한 대상 사이트는 약 23 킬로 기본적인 쌍 (kbp) 멀리. 코딩 유전자 중단, 두 gRNAs NNGRRT 팸 일반적인 exons를 대상으로 SaCas9에 대 한 시퀀스 (선호 NNGAAT, NNGGGT 및 NNGAGT) 및 20 kbp 이내 거리는 것이 좋습니다.
2. 버퍼를 어 닐 링 x 1에서 다음 PCR 매개 변수 anneal gRNA oligos (100 µ / L)를 사용 (버퍼 재고를 어 닐 링 x 5 0.5 mol/L K-아세테이트, 150 mmol/L HEPES 포함-코, 10 mmol/L Mg-아세테이트, pH7.4): 95 ° C 10 분 당 0.4 ° c 95 ~ 59 ° C의 90 주기 감소 20 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 59 ~ 32 ° C의 90 주기 s, 20 주기 당 0.3 ° C 감소와 32에 26 ° C의 20 주기 s.
3. pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA로 단련된 gRNA oligos를 위하여 BsaI와 T4 DNA 리가 한 반응에 사용 하 여 (1 µ L 50 ng / µ L pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA, 1 µ L 단련 oligos, 1.5 µ L 10 x T4 DNA 리가 버퍼, 0.5 µ L T4 DNA 리가, 1 µ L BsaI, 10 µ L ddH₂O ), PCR cycler에서 다음 반응 조건: 5 주기 [37 ° C 5 분 및 16 ° C 10 분]; 37 ° C 20 분; 80 ° C 5 분입니다.
4. 15 µ L 결 찰 제품을 30 µ L 유능한 세포 변환, 100 µ g/mL 암 피 실린, 한 천 판에 24 h에 대 한 37 ° C에서 문화 셀 접시.
5. 5-10 식민지와 100 µ g/mL 암 피 실린 37 ° c, 250 rpm 3-4 h 흔드는 인큐베이터에 들어 있는 LB 매체 문화를 선택 합니다.
6. PCR에 의해 식민지 화면: 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스, 8 µ L ddH₂O, 1 µ L 대장균 문화, 1 µ L 10 µ / L U6-앞으로 뇌관, 1 µ L i20 또는 i23 gRNA 역 뇌관. PCR 자전거 매개 변수: 95 ° C 5 분, 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 초, 72 ° C 30 s의 35 주기.
7. 추가 4 mL 신선한 파운드 중간 containing100 µ g/mL 암 피 실린, 고 37 ° C, 250 rpm에서 하룻밤 문화에 의해 긍정적인 클론의 5 mL 문화를 준비 합니다.
8. 적절 한 플라스 미드 추출 키트를 사용 하 여 DNA 플라스 미드 정화 하 고 생어에 의해 플라스 미드를 확인 시퀀싱 U6-앞으로 뇌관.
9. 10 %FBS 1% 보충 DMEM C2C12 셀 문화 펜-Strep 유전자는 플라스 미드의 효능 편집 테스트용 ~ 70 %confluency 도달할 때까지.
10. Electroporate 5 µ g 1 x 10⁶ C2C12 셀 제조업체의 프로토콜에 따라 1:1 어 금 니 비율에서 SaCas9/gRNA 플라스 미드 혼합물의 총.
11. 48 h 후 transfection 후 C2C12 세포를 수확 하 고 게놈 DNA를 추출 합니다.
12. 사용 100 ng genomic DNA 템플릿으로 마우스 dystrophin 로커 스에 대 한 PCR 반응을 수행 하: 전달 뇌관 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ L 10 µ / L), 반전 뇌관 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ L 10 µ / L), 10 µ L 2 녹색 PCR x 마스터 믹스, 7 µ L ddH2O, 1 µ L genomic DNA ( 100 ng). PCR를 사용 하 여 순환 조건 95 ° c 5 분, [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s]의 35 주기 72 ° C 2 분.

2입니다. rAAV 생산

1. 셀 문화, 15 cm의 20 ~ 40에 AD293 셀 씨 고 DMEM 10 %FBS 1% 보완 유지 펜-Strep transfection 대 ~ 90 %confluency 도달할 때까지.
2. 200 µ L로 희석 3 플라스 미드 감소 (접시) 당 혈 청 매체: 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 또는 다른 serotypes) 및 3) pX601-i20, pX601 i23 혼합물 (1:1 비율)의 5 µ g의 총. 80 µ L 페이와 혼합 하 여 polyethylenimine (페이) transfection를 수행 하 고 dropwise 방식에서 10 분 추가 AD293 세포 배양에 혼합물에 대 한 실 온에서 품 어.
3. AAV 바이러스 생산, 72 h 게시물 transfection 후 10 분 동안 1100 x g에서 원심 분리 하 여 미디어와 AD293 셀 알 약을 수집 하 셀 스 크레이 퍼를 사용 합니다.
4. 액체 질소와 42 ° C 물 탕에서 보육 교류 3 freeze-thaw 주기 다음 15 mL rAAV 세포의 용 해 버퍼 (50 mmol/L 트리 스 베이스, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5)에 셀 펠 릿 resuspend 그들은 즉시 처리 되지 않는 경우 미래 처리를 위한-80 ° C에 세포 lysates를 저장 합니다.
5. 0.45 μ m 필터와 문화 미디어를 필터링 하 고 추가 40% PEG8000 2.5 mol/L NaCl에에서 8%의 최종 농도. 1 시간에 4 ° C에 혼합물 그리고 15 분 동안 1100 x g에서 원심 분리기를 품 어.
6. RAAV 세포의 용 해 버퍼에 산 탄을 resuspend 하 고 단계 2.3, 뒤에 1 시간 동안 37 ° C에서 benzonase (50 U/mL) 치료에서에서 세포 lysates 결합.
7. 원심 benzonase 처리 rAAV 혼합물 1100 x g 4 ° C에서 15 분을 포함 하 고 상쾌한 (원유 rAAV 준비)를 저장 합니다.

3. rAAV 정화 및 농도

1. 하단에는 다음 순서에 따라 ultracentrifuge 튜브에 iodixanol 그라데이션에 원유 rAAV 준비 위에서 로드: 원유 AAV lysate (~ 15 mL), 8 mL 15 %Iodixanol, 6 mL 25 %Iodixanol, 5 mL 40 %Iodixanol, 5 mL 58 %Iodixanol. 1 x DPBS를 사용 하 여 정상에 튜브의 나머지 빈 볼륨을 작성 합니다.
2. 230000 x g 10 ° C에서 120 분 ultracentrifuge로 터에서에 샘플 원심을 3-4 mL 18 G 바늘 rAAV 입자를 포함 하는 40% 그라데이션 분수의를 수집 합니다.
3. 1 x DPBS와 원심 분리기는 원심 필터 장치 (MWCO 100 kDa)를 사용 하 여 rAAV 입자를 희석. 대 한이 단계를 반복 3-5 시간 및 마지막으로 300-500 µ L rAAV 준비 집중.

4입니다. rAAV Titering

1. 2 µ L 집중 rAAV, 에탄올에 3 M NaOAc와 20 µ L ddH₂O. resuspend 촉진에서 게놈 DNA를 추출
2. PX601 플라스 미드의 직렬 희석에 의해 rAAV 정량에 대 한 표준 곡선을 얻기: 1 x 10⁹, 1 x 10^8,1 x 10⁷, 1 x 10⁶, 각 10 µ L ddH₂O. Dilute DNAase 치료 rAAV 1 x 10⁵ 부 샘플 1:10, 1시 50분, 1: 100, 그리고 1:1000.
3. 실시간 PCR 시스템에서 제조업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실시간 양이 많은 PCR (정량)에 의해 rAAV titer 결정: 1 µ L 10 µ / L 각 뇌관의 (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC 및 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ L PCR 마스터 믹스, 희석 1 µ L x 2 rAAV 샘플 및 2 µ L ddH₂O. 자전거 매개 변수가 반응 실행: 95 ° C 3 분, 45의 주기 [95 ° C 5 초 61 ° C 20 초].

5. 정 맥 및 복 rAAVrh.74-CRISPR 신생아 mdx/utrophin^/- 생쥐에 주입

1. 1 분 동안 얼음에 배치 하 여 mdx/utrophin⁺ 마우스 새끼 (3 일)를 immobilize 하 고 1 x 10¹² 복고풍 궤도 접근 또는 복 주사를 통해 체계적으로 마우스 당 50 µ L에서 바이러스 성 입자와 관리.
2. 복구 하 고 다시 자신의 집 새를 마우스 수 있습니다. RAAV 관리 후 10 주, 조직 컬렉션에 대 한 공동₂ 노출에 의해 쥐를 안락사.
3. 스냅-동결 genomic DNA와 RNA 추출 및 사용 isopentane 최적의 절삭 온도와 조직 cryosectioning 복합 동결 액체 질소에 냉각에 대 한 조직.

6입니다. 결과 편집 대상 유전자의 분석

1. 게놈 DNA PCR 분석
   1. Mdx/utrophin^/- 생쥐의 심장 조직에서 게놈 DNA 치료 또는 rAAV 없이 총을 격리 합니다.
   2. 1.12 단계에서에서 동일한 프로토콜을 사용 하 여 PCR 분석에 대 한.
2. Dystrophin 식의 RT-PCR 분석
   1. 제조업체의 설명서에 따라 RNA 추출 키트와 함께 심장 조직에서 총 RNA를 추출.
   2. 반전 녹음 방송을 수행 하려면 미리 RNase 무료 DNase와 총 RNA를 치료 하 고 템플릿으로 처리 RNA의 5 µ g를 사용 하 여 반전 녹음 방송 장비를 가진 첫번째 물가 cDNA 합성에 대 한.
   3. 반전 녹음 방송 제품을 사용 하 여 dystrophin cDNA 뇌관으로 dystrophin 식의 RT-PCR 분석: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT 및 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
3. 정량 분석에 의해 효능을 편집 하는 유전자 예측
   1. 양적 RT-PCR exon 22 포함 된 성적 (exon 21) 앞으로 뇌관을 사용 하 여 감소를 감지 하 여 효능을 편집 하는 유전자 예측: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA, 그리고 역방향 뇌관 (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. 앞으로 뇌관 참조 유전자로 Gapdh 사용: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC 및 역방향 뇌관: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
   2. 양이 많은 실시간 PCR (정량) 실시간 PCR 시스템과 2 단계 반응 조건에서 제조 업체의 지시에 따라 정량 키트를 사용 하 여 실행: 95 ° C 3 분, 95 ° C 5 sec와 61 ° C 30 초 45 주기.
4. 면역 형광 분석 dystrophin 식 얼룩
   1. 잘라 냉동된 조직 두께 10 µ m. 수정에는 cryostat를 사용 하 여 15 분 동안 실 온에서 4 %paraformaldehyde 냉동된 섹션.
   2. PBS로 2 배를 세척 하 고 1 시간에 대 한 솔루션 (10% 말 혈 청) 차단으로 품 어.
   3. 안티 dystrophin 기본 항 체, 4 ° C 하룻밤에 품 어.
   4. PBS와 슬라이드를 씻어 3 × 5 분 및 1 시간에 대 한 실 온에서 형광 이차 항 체 (1: 500)를 품 어.
   5. DAPI를 장착 매체를 사용 하 여 거꾸로 confocal 현미경으로 이미징 슬라이드를 탑재 합니다.

7. 오프 대상 분석 T7E1 분석 결과

1. 온라인 CRISPR를 사용 하 여 잠재적인 대상 오프 사이트 디자인 도구와 같은 예측 < http://crispr.mit.edu>.
2. 게놈 지역 취재는 상위 5-10 잠재적인 대상 오프 사이트 PCR에 의해 증폭: genomic DNA 200, 1 µ L 고 충실도 DNA 중 합 효소, 5 µ L 10 x PCR 버퍼 믹스, 1.5 µ L 10와 50 µ L 총 볼륨 조정 사이트별 정방향 및 역방향 뇌관의 µ / L ddH₂o.
3. 전기 이동 법으로 PCR 제품을 실행 하 고 추출 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 광을 사용 하 여 농도 측정 합니다.
4. 변성 시키기 및 다시 사용 하 여 PCR cycler 버퍼 2.1에서 천천히 정화 amplicons 어 닐 링에 의해 heteroduplex 형성을 촉진 합니다. 동일한 자전거 상태를 사용 하 여 단계 1.2에서에서 상술 된 대로.
5. 0.5 µ L T7E1 효소, 37 ° C에서 30 분 동안 다시 단련된 제품을 소화 하 고 사용 하 여 1-2 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 반응 분석.
   참고:는 amplicons 또한 타겟된 깊은 시퀀싱 하 여 분석할 수 있습니다.

결과

대상 게놈 DNA 영역 삭제를 유도 하는 gRNAs의 효능 vivo에서 학문을 위한 rAAV로 포장 하기 전에 셀 문화에서 평가 되어야 한다. 이 위해, gRNAs 및 SaCas9을 표현 구문 electroporated C2C12 세포로 되었고 대상 사이트 (그림 1) 측면 뇌관으로 PCR에 의해 게놈 DNA 분석. PCR 제품 ~ 500 bp 대상 게놈 DNA 유전자 제어 세포 게놈 DNA의 큰 크기로 인해 밴드 양보 하지 해야 하는...

토론

이 프로토콜에서 우리 vivo 심장 유전자 SaCas9 및 2 개의 gRNAs의 납품 rAAVrh.74 중재를 사용 하 여 출생 후 생쥐에서 편집을 달성 하는 데 필요한 모든 단계를 상세하게. 이전 지적,이 이렇게 dystrophic 쥐에서 dystrophin 식²⁷의 우리의 작업 설명 된 대로 복원 사용할 수 있지만 그것은 또한 급속 한 반전 유전학 연구의 긴 과정 없이 쥐 심장 관련 유전자의 활성화 수는 생성 하 고 사육...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21428
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bio Safety Cabinets	Thermo Fisher Scientific	1347	1300 Series A2 Class II, Type A2
BsaI	New England BioLabs Inc	RO535S
Competent cells	Agilent Technologies	200314
Cell culture dishes, 150mm	Nest Scientific USA	715001
Cryostat	Leica Biosystems		Leica CM3050S
DMEM	Thermo Fisher Scientific	MT10017CV	Corning cellgro
Dystrophin antibody	Spring Bioscience	E2660
Fast-Ion Midi Plasmdi Kits	IBI Scientific	IB47111
FBS	Thermo Fisher Scientific	26-140-079
Filter Unit, 0.45μm	Thermo Fisher Scientific	166-0045
GoTaq Master Mixes	Promega	M7122
High-speed plasmid mini kit	IBI Scientific	IB47102
Horse serum	Abcam	ab139501
Isotemp 2239 Water Bath	Thermo Fisher Scientific	15-460-11Q
Isotemp Heat Block	Thermo Fisher Scientific	11-718
Inverted confocal microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC		LSM 780
LightCycler 480 instrument	Roche	5015243001	LightCycler 480 Instrument II
Large Capacity Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	46-910	Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002445	Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop spectrophotometers	Thermo Scientific	ND2000CLAPTOP	NanoDrop™ 2000/2000c
Oligos for i20-F	Integrated DNA Technologies		CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC
Oligos for i20-R	Integrated DNA Technologies		AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
Oligos for i23-F	Integrated DNA Technologies		CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC
Oligos for i23-R	Integrated DNA Technologies		GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
Oligos	Integrated DNA Technologies
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250ML
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
PEG8000	Sigma-Aldrich	89510-1kg-F
Polyethylenimine	Polysciences	23966
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
Quick-Seal centrifuge tube	Beckman Coulter Inc	342414
QIAquick Gel Extraction kit	Qiagen	28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits	Alkali Scientific	QS2005
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691
Rotor	Beckman Coulter Inc	337922	Type 70Ti
T4 DNA ligase	New England BioLabs Inc	M0202S
Thermal Cycler	Bio-rad	1861096
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026
Ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc	8043-30-1192	Optima le-80k
Ultra centrifugal filter unit	MilliporeSigma	UFC510096
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories, Inc	H-1200