Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição

Resumo

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para realizar na vivo edição de gene cardíaca em ratos usando recombinantes Adeno-Associated vírus (rAAV)-mediada entrega de CRISPR. Este protocolo oferece uma promissora estratégia terapêutica para tratar a cardiomiopatia distrófica em distrofia muscular de Duchenne e pode ser usado para gerar o nocaute cardíaco-específicas em ratos pós-natal.

Resumo

O sistema (CRISPR) repetição clusterizado regularmente intercalado, curto, palíndromo tem facilitada engenharia do genoma em culturas de células e organismos vivos de uma grande variedade de espécies. A tecnologia CRISPR também tem sido explorada como romance terapêuticas para um número de doenças humanas. Dados de prova de conceito são altamente animadores, como exemplificado por estudos recentes que demonstram a viabilidade e a eficácia da abordagem terapêutica baseada em edição de gene para a distrofia muscular de Duchenne (DMD) usando um modelo murino. Em particular, a injeção intraperitoneal e intravenosa do sorotipo de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) rh.74 (rAAVrh.74) permitiu cardíaca uma entrega eficiente de proteínas associadas CRISPR 9 o Staphylococcus aureus (SaCas9) e dois Guia de RNAs (gRNA) para excluir uma região genômica com um códon mutante no exon 23 do gene Dmd de rato. Esta mesma abordagem também pode ser usada para nocautear o gene de interesse e estudar sua função cardíaca em camundongos pós-natal quando a gRNA destina-se a região codificante do gene-alvo. Neste protocolo, mostramos em detalhes como engenheiro vector rAAVrh.74-CRISPR e como conseguir altamente eficiente entrega cardíaca em camundongos neonatais.

Introdução

A cluster, regularmente intercalada, curta palíndromo repetição (CRISPR) tecnologia representa o mais recente avanço na engenharia de genoma e revolucionou a prática atual da genética em células e organismos. Edição baseada em CRISPR genoma utiliza um guia único RNA (gRNA) para direcionar uma endonuclease CRISPR associadas tais como proteínas associadas CRISPR 9 (Cas9) e Cpf1 para um alvo de DNA genômico complementar em sequência para o protospacer codificada pela gRNA com um protospacer específico motivo adjacentes (PAM)^1,2. O PAM varia dependendo da espécie bacteriana do gene Cas9 ou Cpf1. O mais comumente usado nuclease Cas9 derivado de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconhece uma sequência de PAM de NGG que encontra-se diretamente a jusante da sequência alvo no DNA genômico, na vertente não-alvo. No local de destino, as proteínas Cas9 e Cpf1 geram uma ruptura da dobro-Costa (DSB), que então é reparada via intrínsecos mecanismos reparação DNA celulares, incluindo não-homóloga final juntando (NHEJ) e reparação de homologia-dirigido (HDR) vias^{3, 4}. Na ausência de um modelo de DNA para recombinação homóloga, ORL é reparado principalmente por via NHEJ propenso a erro, que pode resultar em inserções ou exclusões (puntuais) de nucleotídeos, causando mutações frameshift se o ORL foram criado na codificação região de um gene^5,6. Assim, o sistema CRISPR amplamente serviu para engenheiro-perda da função de mutações em vários modelos de celulares e organismos de todo, a fim de investigar a função de um gene. Além disso, o Cas9 cataliticamente inactiva e Cpf1 têm sido desenvolvidos para transcricionalmente e epigenetically modulam a expressão de genes de alvo^7,8.

Mais recentemente, tanto SpCas9 e SaCas9 (derivado de Staphylococcus aureus) foram embalados em vetores de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) para correção do gene pós-natal no modelo animal de doenças humanas, particularmente, Duchenne distrofia muscular (de Duchenne DMD)^{9,10,11,12,13,14,15}. DMD é uma doença fatal e ligada ao X recessiva causada por mutações no gene DMD , que codifica a distrofina proteína^16,17, afetando aproximadamente 1 em 3500 nascimentos masculinos de acordo com o teste do pezinho^{18 , 19}. é caracterizada por fraqueza muscular progressiva e a perder. Os pacientes DMD geralmente perdem a habilidade de andar entre 10 e 12 anos de idade e morrem de insuficiência respiratória e/ou cardíaca com a idade de 20-30 anos²⁰. Notavelmente, cardiomiopatia desenvolve em > 90% dos pacientes DMD e representa a principal causa de morte em pacientes DMD^21,22. Embora o Deflazacort (um medicamento anti-inflamatório) e Eteplirsen (um exon saltando de medicina para saltar o exon 51) recentemente foram aprovados para DMD pelo Food and Drug Administration (FDA)^23,24, nenhum destes tratamentos corrigi o defeito genético no nível do DNA genômico. O mdx mouse, que transporta uma mutação pontual no exon 23 do gene da distrofina, tem sido amplamente utilizado como um DMD modelo²⁵. Além disso, temos demonstrado anteriormente que a expressão de distrofina funcional foi restaurada por exclusão em-frame do DNA genômico cobrindo exões, 21, 22 e 23 em músculos esqueléticos de camundongos mdx usando intramuscular entrega de Ad-SpCas9/gRNA⁹ e dos músculos do coração de camundongos mdx/Utrofina^{+ /-} usando intraperitoneal e intravenosa entrega de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA²⁶.

Neste protocolo, descrevemos em detalhe cada etapa no gene cardíaca pós-natal de edição para restaurar a distrofina em camundongos mdx/Utrofina^{+ /-} usando vetores de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, desde a concepção de gRNA para análise de distrofina nas seções de músculo do coração.

Protocolo

Os animais utilizados neste protocolo foram mantidos no estado com recursos de animais de laboratório Universidade The Ohio em conformidade com as diretrizes de uso de animais. Todos os estudos em animais foram autorizados pelo institucional Cuidado Animal, uso e o Comitê de revisão da Ohio State University.

1. design e clonagem de gRNAs no vetor CRISPR

1. Selecione 2 gRNAs segmentação distrofina intron 20 e intrão 23 (i20 e i23) para SaCas9: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT e i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (a sequência de PAM é sublinhada e itálico).
   Nota: Os sites de destino para i20 e i23 são cerca de 23 quilos pares de base (kbp) afastado. Para interromper um gene de codificação, dois gRNAs alvejando os exões comuns com o NNGRRT PAM sequenciar para SaCas9 (de preferência, NNGAAT, NNGGGT e NNGAGT) e distância dentro 20 kbp são recomendados.
2. Use os seguintes parâmetros PCR para recozer a gRNA oligos (100 µmol/L) em 1x tampão de recozimento (o 5x recozimento regulador contém 0,5 mol/L K-acetato, 150 mmol/L HEPES-KOH, 10 mmol/L Mg-acetato, pH7.4): 95 ° C 10 min., diminuir a 90 ciclos de 95 a 59 ° C, com 0,4 ° C por ciclo de 20 s, 90 ciclos de 59 a 32 ° C, com uma diminuição de 0,3 ° C por ciclo de 20 s, 20 ciclos de 32 a 26 ° C, com uma diminuição de 0,3 ° C por ciclo de 20 s.
3. Ligam os oligos recozido gRNA para o pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA usando BsaI e T4 DNA ligase em uma reação (1 µ l 50 ng / µ l pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 1 µ l recozido oligos, buffer de ligase T4 DNA de 10 x 1,5 µ l, 0,5 µ l T4 DNA ligase, 1 µ l BsaI, 10 µ l ddH₂O ), com a seguinte condição de reação em um cycler PCR: 5 ciclos de 37 ° C 5 min e 16 ° C 10 min; 37 ° C 20 min; 80 ° C 5 min.
4. Transformar o produto de ligadura de 15 µ l de células competentes de 30 µ l, placa as células em placa de ágar com 100 mg/mL ampicilina e cultura a 37 ° C por 24 h.
5. Pegar de 5 a 10 colônias e cultura em meio LB contendo 100 µ g/mL ampicilina a 37 ° C, 250 rpm numa incubadora shaker para 3-4 h.
6. As colônias por PCR de tela: 10 µ l 2 x mestre mistura PCR 8 µ l ddH₂O, cultura de Escherichia Coli 1 µ l, 1 µ l 10 µmol/L U6-forward da primeira demão, 1 µ l i20 ou i23 gRNA inversa da primeira demão. Os parâmetros de ciclismo de PCR: 95 ° C 5 min, 35 ciclos de 95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s.
7. Prepare a cultura 5ml dos clones positivos por adicionando 4 mL fresco LB médio containing100 µ g/mL ampicilina e cultura durante a noite a 37 ° C, 250 rpm.
8. Purificar o plasmídeo de DNA usando o kit de extração de plasmídeo apropriado e verifique se o plasmídeo por Sanger sequenciando com o primer U6-para a frente.
9. Cultura de células de C2C12 em DMEM suplementado com 10% FBS e 1% caneta-Strep até alcançar a confluência de ~ 70% para testar o gene edição eficácia dos Plasmideos.
10. Electroporate um total de 5 µ g de mistura de plasmídeo SaCas9/gRNA em proporção molar de 1:1 em 1 x 10⁶ C2C12 células de acordo com o protocolo do fabricante.
11. Depois de pós-transfeccao 48 h, colher as células C2C12 e extrair DNA genômico.
12. Uso 100 ng DNA genômico como modelo para realizar a reação de PCR para locus de distrofina rato: encaminhar cartilha 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA (1 µ l 10 µmol/L), reverter a primeira demão 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 µ l 10 µmol/L), 10 µ l 2 x a verde PCR master mix, 7 µ l ddH2O, 1 µ l (de DNA genômico 100 ng). Use o PCR ciclismo condições como a 95 ° C 5 min, 35 ciclos de [95 ° C 30 s, 61 ° C 30 s, 72 ° C 30 s], 72 ° C 2 min.

2. produção de rAAV

1. Para cultura de células, células AD293 para 20 a 40 de pratos de 15 cm da semente e manter em DMEM suplementado com 10% FBS e 1% caneta-Strep até alcançar a confluência do ~ 90% para transfeccao.
2. Diluir 3 plasmídeos com 200 µ l reduziram média de soro (por prato): 1) 10 µ g pHelper; 2) 5 µ g pXR (rh.74 ou outros sorotipos) e 3) num total de 5 µ g de mistura de pX601-i20 e pX601-i23 (proporção de 1:1). Executar o polyethylenimine (PEI) do transfection misturando com 80 µ l PEI e incubar a temperatura ambiente por 10 min. adicionar a mistura para as culturas de células AD293 em forma de gota a gota.
3. Para a produção de vírus vírus adeno-associados, depois de Transfeccao de post de 72 h, use um raspador de célula para coletar tanto a mídia e as pelotas de célula AD293 por centrifugação a 1100 x g por 10 minutos.
4. Resuspenda as pelotas de célula em 15 mL de tampão de Lise rAAV (50 mmol/L Tris Base, 150 mmol/L NaCl, pH 8,5) seguidas por 3 ciclos de congelamento e descongelamento com a alternância de incubação em nitrogênio líquido e um banho de água de 42 ° C. Armazene os lisados celulares em-80 ° C para processamento futuro se eles não estão sendo processados imediatamente.
5. Os meios de cultura de filtragem com um filtro de 0,45 µm e adicionar um 40% PEG8000 em 2,5 mol/L NaCl, a uma concentração final de 8%. Incube a mistura a 4 ° C, durante 1 h e centrifugar 1100 x g por 15 min.
6. Resuspenda as pelotas em tampão de Lise rAAV e combinar com os lisados celulares da etapa 2.3, seguido de tratamento benzonase (50 U/mL) a 37 ° C por 1h.
7. Centrifugue o rAAV benzonase-tratados contendo mistura 1100 x g durante 15 minutos a 4 ° C e salvar o sobrenadante (preparação rAAV bruto).

3. rAAV purificação e concentração

1. Carregar a preparação rAAV bruto em um gradiente de iodixanol num tubo se na seguinte ordem de cima para a parte inferior: bruto AAV lisado (~ 15 mL), 8 mL 15% Iodixanol, 6 mL 25% Iodixanol, 5ml 40% Iodixanol, 5ml 58% Iodixanol. Preencha o restante volume vazio do tubo até o topo usando 1 x DPBS.
2. Centrifugar as amostras a 230.000 x g em um rotor se para 120 min a 10 ° C e coletar 3-4 mL da fração gradiente 40% contendo as partículas rAAV com uma agulha de 18 G.
3. Dilua as partículas rAAV com 1 x DPBS e centrífuga usando a unidade de filtração centrífuga (MWCO 100 kDa). Repita este passo para 3 - 5 vezes e finalmente concentrar a preparação rAAV a 300-500 µ l.

4. rAAV Titulagem

1. Extrair o DNA genômico de 2 µ l concentrado rAAV, precipitado com 3 M NaOAc em etanol e ressuspender em 20 µ l ddH₂O.
2. Obter a curva padrão para quantificação de rAAV por diluição serial do plasmídeo pX601: 1 x 10⁹, 1x10^8,1 x 10⁷, 1 x 10⁶, 1 x 10⁵ cópias em cada 10 µ l ddH₂O. dilua o rAAV DNAase-tratados as amostras como 01:10, 01:50, 1: 100 e 1: 1000.
3. Determinar o título de rAAV por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) usando qPCR Kit de acordo com as instruções do fabricante, em um sistema de PCR em tempo real: 1 µ l 10 µmol/L de cada primer (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC e 5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC), 5 µ l 2 x mestre mistura PCR, 1 µ l diluído rAAV amostras e 2 µ l ddH₂O. executar a reação com os seguintes parâmetros de ciclismo: 95 ° C 3 min, 45 ciclos de 95 ° C 5 seg e 61 ° C 20 seg.

5. intravenosa e injeção Intraperitoneal de rAAVrh.74-CRISPR em Neonatal mdx/Utrofina^{+ /-} ratos

1. Imobilizar os mdx/Utrofina⁺ rato filhotes (dia 3), colocando no gelo por 1 min e então administrar com 1 x 10¹² partículas virais em 50 µ l por rato sistemicamente através de uma abordagem retrô-orbital ou uma injeção intraperitoneal.
2. Permitir que os ratos recuperar e colocar volta em suas gaiolas para casa. Às dez semanas após a administração de rAAV, eutanásia em ratos pela exposição de CO₂ para a coleção de tecido.
3. Snap-congelar tecidos para genômica extração de DNA e RNA e o uso de refrigeração em nitrogênio líquido para congelar tecidos com temperatura ideal de corte composto para cryosectioning o isopentano.

6. análise do Gene alvo, resultados de edição

1. Análise de PCR do DNA genômico
   1. Isole o DNA genômico de tecidos de camundongos mdx/Utrofina^{+ /-} coração tratado com ou sem rAAV total.
   2. Use o mesmo protocolo em 1.12 passo para análise PCR.
2. Análise de RT-PCR da expressão de distrofina
   1. Extrair o RNA total de tecidos do coração com o kit de extração de RNA seguindo o manual do fabricante.
   2. Para realizar a transcrição reversa, Pre-treat o RNA total com um livre de RNase DNase e uso 5 µ g de RNA tratado como modelo para a síntese do cDNA da primeiro-costa com o kit de transcrição reversa.
   3. Utilizar o produto de transcrição reversa para análise de RT-PCR da expressão de distrofina com os primers de cDNA de distrofina: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT e 5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC.
3. Estimar o gene edição eficácia por qPCR análise
   1. Estimar o gene edição eficácia por RT-PCR quantitativo para detectar a redução da exon 22-contendo as transcrições usando o primer para a frente (exon 21): 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA e o primer reverso (exon 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT. Use Gapdh como um gene de referência com o primer para a frente: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC e o primer reverso: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT.
   2. Executar o PCR quantitativo em tempo real (qPCR) usando o qPCR Kit de acordo com as instruções do fabricante, em um sistema de PCR em tempo real e as condições de reação de 2-passo: 95 ° C 3 min, 45 ciclos de 95 ° C 5 seg e 61 ° C 30 seg.
4. Mancha para analisar a expressão de distrofina
   1. Corte os tecidos congelados usando um criostato em uma espessura de 10 µm. Fix as seções congeladas com paraformaldeído 4% à temperatura ambiente por 15 min.
   2. Lave 2 vezes com PBS e incubar com bloqueio de solução (10% de soro de cavalo) por 1h.
   3. Incube o anticorpo primário antidistrofina, a 4 ° C durante a noite.
   4. Lave os slides com PBS 3 x 5 min e incubar com anticorpos secundários fluorescentes (1: 500) à temperatura ambiente durante 1 h.
   5. Monte as lâminas usando o meio de montagem com DAPI e imagem com um microscópio confocal invertido.

7. o alvo análise por meio de ensaio T7E1

1. Prever os potenciais sites fora do alvo usando o on-line CRISPR projetar ferramentas tais como < http://crispr.mit.edu>.
2. Amplificar as regiões genômicas cobrindo o top 5-10 sites de fora do alvo potenciais por PCR: ng de 200 de DNA genômico, 1 µ l alta fidelidade DNA polimerase, 5 µ l 10 x PCR Buffer misturar 1,5 µ l 10 µmol/L de site-specific primers para diante e reversos, ajustando o volume total de 50 µ l, com ddH₂O.
3. Executar os produtos PCR por electroforese, extrair e purificar o DNA usando um kit de extração do gel. Medir a concentração usando espectrofotômetros.
4. Promover a formação de doheteroduplex por desnaturação e re-recozimento os amplicons purificada lentamente no Buffer 2.1 usando um reciclador PCR. Use as mesmas condições de ciclismo conforme detalhado na etapa 1.2.
5. Digerir os produtos re-recozidos por 30 min a 37 ° C, com a enzima de T7E1 0,5 µ l e analisar a reação a electroforese do gel do agarose 1-2%.
   Nota: Os amplicons também podem ser analisados pelo sequenciamento profundo orientado.

Resultados

A eficácia do gRNAs para induzir a exclusão da região de DNA genômica de destino deve ser avaliada em culturas de células antes de empacotar em rAAV para estudos in vivo. Para este fim, o gRNAs e SaCas9-expressando construções foram electroporated em C2C12 de células e o DNA genômico foi analisado por PCR com primers flanqueando os sites de destino (Figura 1). Um produto PCR de ~ 500 bp indica exclusão bem-sucedida do DNA genômico alvo resultantes ...

Discussão

Neste protocolo, detalhamos todas as etapas necessárias para alcançar na vivo cardíaca gene edição no pós-natal ratos usando entrega mediada por rAAVrh.74 de SaCas9 e dois gRNAs. Como já observado, esta abordagem pode ser usada para restaurar a expressão da distrofina em camundongos distróficos, conforme descrito em nosso trabalho²⁷, mas isso também poderia permitir estudos de genética reversa rápida de genes relacionados ao cardíaco em camundongos sem o longo processo do abo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21428
Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bio Safety Cabinets	Thermo Fisher Scientific	1347	1300 Series A2 Class II, Type A2
BsaI	New England BioLabs Inc	RO535S
Competent cells	Agilent Technologies	200314
Cell culture dishes, 150mm	Nest Scientific USA	715001
Cryostat	Leica Biosystems		Leica CM3050S
DMEM	Thermo Fisher Scientific	MT10017CV	Corning cellgro
Dystrophin antibody	Spring Bioscience	E2660
Fast-Ion Midi Plasmdi Kits	IBI Scientific	IB47111
FBS	Thermo Fisher Scientific	26-140-079
Filter Unit, 0.45μm	Thermo Fisher Scientific	166-0045
GoTaq Master Mixes	Promega	M7122
High-speed plasmid mini kit	IBI Scientific	IB47102
Horse serum	Abcam	ab139501
Isotemp 2239 Water Bath	Thermo Fisher Scientific	15-460-11Q
Isotemp Heat Block	Thermo Fisher Scientific	11-718
Inverted confocal microscope	Carl Zeiss Microscopy, LLC		LSM 780
LightCycler 480 instrument	Roche	5015243001	LightCycler 480 Instrument II
Large Capacity Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	46-910	Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002445	Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop spectrophotometers	Thermo Scientific	ND2000CLAPTOP	NanoDrop™ 2000/2000c
Oligos for i20-F	Integrated DNA Technologies		CACCgGGCGT TGAAATTCTCATTAC
Oligos for i20-R	Integrated DNA Technologies		AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
Oligos for i23-F	Integrated DNA Technologies		CACCgCACCGATGAGAGGG AAAGGTC
Oligos for i23-R	Integrated DNA Technologies		GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
Oligos	Integrated DNA Technologies
OptiPrep Density Gradient Medium	Sigma-Aldrich	D1556-250ML
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
PEG8000	Sigma-Aldrich	89510-1kg-F
Polyethylenimine	Polysciences	23966
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P2308
Quick-Seal centrifuge tube	Beckman Coulter Inc	342414
QIAquick Gel Extraction kit	Qiagen	28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits	Alkali Scientific	QS2005
RevertAid RT Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	K1691
Rotor	Beckman Coulter Inc	337922	Type 70Ti
T4 DNA ligase	New England BioLabs Inc	M0202S
Thermal Cycler	Bio-rad	1861096
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026
Ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc	8043-30-1192	Optima le-80k
Ultra centrifugal filter unit	MilliporeSigma	UFC510096
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories, Inc	H-1200