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要約

ここで生体内で心臓遺伝子組換えアデノ ウイルス (下さい rAAV) を用いたマウスで編集を実行する詳細なプロトコルを提供-CRISPR の配信を介する。このプロトコルは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋ジストロフィーの心筋症を治療するために有望な治療戦略を提供しています、生後マウス心臓固有ノックアウトを生成する使用ことができます。

要約

クラスター化、定期的に空間、短い、回文の繰り返し (CRISPR) システムは、培養細胞のさまざまな種から生きている有機体のゲノム工学を促進しています。CRISPR 技術は、人間の病気の治療薬として検討されています。概念実証データは可能性とマウスモデルを用いたデュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD) の遺伝子編集ベース アプローチの有効性を示す最近の研究に代表される非常に心強いものです。黄色ブドウ球菌CRISPR 関連タンパク質 9 の効率的な心筋配信 (SaCas9) と 2 つの特に、組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) 血清型 rh.74 (rAAVrh.74) の静脈内投与と腹腔内注入が有効になって23 マウスDmd遺伝子のエクソンに変異のコドン ゲノム領域を削除する Rna (gRNA) をご案内します。興味の遺伝子をノックアウトして生後マウスの心機能を研究、gRNA の遺伝子のコーディングの地域をターゲットに設計されている場合、これと同じアプローチを使用もできます。このプロトコルでは rAAVrh.74 CRISPR ベクトルをエンジニア リングする方法と新生児マウスで高効率な心臓配送を達成するために詳細に示します。

概要

クラスター化、定期的に空間、短い回文リピート (CRISPR) 技術はゲノム工学の最も最近の進歩を表し、細胞および生物における遺伝学の現在の習慣をもたらしました。CRISPR 関連のエンドヌクレアーゼ CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) などを直接単一ガイド RNA (gRNA) を利用してゲノムの CRISPR ベース編集とは、protospacer に補足シーケンスのゲノム DNA ターゲットに Cpf1 と gRNA でエンコードされた、特定の protospacer の隣接するモチーフ (PAM) の1,2。PAM は、Cas9 または Cpf1 の遺伝子の細菌種によって異なります。化膿連鎖球菌(SpCas9) から派生した一般的に使用される Cas9 ヌクレアーゼは、非ターゲット鎖に DNA に直接下流ターゲット シーケンスのある NGG の PAM のシーケンスを認識します。ターゲット ・ サイトで Cas9 と Cpf1 蛋白質を生成する非相同末端結合 (NHEJ) と相同性向け修理 (HDR) 経路3を含む組み込みの細胞 DNA 修復機構によって修復され、二重鎖切断 (DSB) 4。相同組換えの DNA のテンプレートがない場合は、DSB は主に修復に挿入や削除 (オクターリピート) 生じるエラーを起こしやすい NHEJ 経路による DSB がコーディングで作成された場合、フレーム シフト突然変異を引き起こしているヌクレオチドの遺伝子5,6の領域。したがって、遺伝子の機能を調べるために、CRISPR システムを様々 な細胞モデルと全有機体の機能喪失変異をエンジニアに広く使用がされています。また、触媒非アクティブの Cas9 と Cpf1 発現に開発されている、epigenetically ターゲット遺伝子7,8の発現を調節します。

最近では、SpCas9 と SaCas9 (黄色ブドウ球菌由来) パッケージ化されている遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) ベクトルの人間の病気の動物モデルの生後遺伝子補正のために特に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー筋ジストロフィー (DMD)9,10、11,12,13,14,15。DMD はジストロフィン蛋白質16,17をエンコード、 DMDの遺伝子で突然変異によって引き起こされる致命的な X 連鎖劣性病気新生児マスス クリーニング18によると約 1 つで 3500 男性出産に影響を与える,19. 進歩的な筋肉弱さと無駄が特徴です。DMD 患者は通常 20-30 年20歳で 10 歳以上 12 歳未満と呼吸や心臓の障害で死ぬと歩行能力を失います。心筋症を開発する特に、> 90% の DMD 患者と DMD 患者21,22の死の主要な原因を表します。Deflazacort (抗炎症薬) と Eteplirsen (エクソン 51 をスキップのための薬をスキップ エクソン) 最近によって承認されている DMD の食品医薬品局 (FDA)23,24、これらの治療のどれもがゲノム DNA レベルで遺伝的欠陥を修正します。エクソン 23 ジストロフィン遺伝子の点突然変異を運ぶ、mdx マウスは、DMD モデル25として広く使用されています。さらに、我々 は以前、機能的なジストロフィン式カバー エクソン 21、22、23 筋肉内の広告-SpCas9/gRNA 配信9 を使用してmdxマウス骨格筋でゲノム DNA のフレームの削除によって復元された実証、および静脈内、腹腔内の rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 配信26を使用してmdx/研究+/-マウスの心臓の筋肉。

このプロトコルで生後心臓遺伝子の心臓の筋肉のセクションでジストロフィン解析 gRNA 設計からの rAAVrh.74-SaCas9/gRNA ベクトルを使用してmdx/研究+/-マウスでジストロフィンを復元する編集のあらゆるステップ詳細に述べる。

プロトコル

このプロトコルで使われる動物は、動物使用のガイドラインに従って、オハイオ州大学研究所動物資源で維持されました。すべての動物の研究は、制度的動物のケア、使用、およびオハイオ州立大学の審査委員会によって承認されました。

1. デザイン gRNAs CRISPR ベクターにクローニング

  1. 対象 20 ジストロフィン イントロンとイントロン (i20 と i23) 23 SaCas9 2 gRNAs を選択: i20: 5'-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT i23: 5'-CACCGATGAGAGGGAAAGGTC CTGAAT (PAM シーケンスは、下線、斜体)。
    注: i20 と i23 のターゲット ・ サイトには、約 23 キロ塩基対 (kbp) 離れて。コーディングの遺伝子を破壊する 2 つの gRNAs NNGRRT PAM と共通のエクソンをターゲット シーケンス SaCas9 の (できれば NNGAAT、NNGGGT、NNGAGT) および 20 kbp の範囲内の距離をお勧めします。
  2. 次の PCR パラメーターを使用して 1 アニーリング バッファー x gRNA oligos (100 µmol/L) をアニール (緩衝在庫をアニール x 5 には 0.5 mol/L 150 ミリ モル/L HEPES K 酢酸が含まれています-島、10 ミリ モル/L Mg 酢酸、pH7.4): 95 ° C 10 分の 0.4 の ° C と 95 に 59 ° C 90 サイクル減少あたりサイクルの 20 s、20 サイクルあたり 0.3 ° C 減少と 59 ~ 32 ° C の 90 サイクル s、20 サイクルあたり 0.3 ° C 減少 32 に 26 ° C の 20 サイクル s。
  3. PX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA に焼鈍 gRNA oligos を縛る反応の 1 つで BsaI と T4 DNA リガーゼを使って (1 μ L 50 ng/μ L pX601-CMV-SaCas9-mPA-U6-gRNA 焼鈍 1 μ L oligos、1.5 μ 10 x T4 DNA リガーゼ バッファー、0.5 μ L T4 DNA リガーゼ、1 μ 10 μ L ddH2O BsaI)、PCR サーマルサイクラーに次の反応条件を持つ: 5 サイクル [37 ° C 5 分および 16 ° C 10 分];37 ° C 20 分。80 ° C 5 分。
  4. 100 μ g/ml、アンピシリン寒天培地で 24 h の 37 ° C で培養細胞をプレート、15 μ L 結紮製品を 30 μ L の有能なセルに変換します。
  5. 5-10 コロニーと 37 ° C, 3 4 h のシェーカーのインキュベーターで 250 rpm で 100 μ g/mL アンピシリンを含む LB 培地での培養を拾います。
  6. 画面の PCR によるコロニー: PCR のマスターの組合せ、8 μ L ddH2O、1 μ L 大腸菌文化、1 μ L の 10 µmol/L U6 前方プライマー、1 μ L i20 または i23 gRNA 逆プライマー x 10 μ L 2。PCR の循環パラメーター: 95 ° C、95 ° C 30 秒、61 ° C 30 s、72 ° C 30 秒の 35 サイクル 5 分。
  7. 追加 4 mL 新鮮な LB 培地 containing100 μ G/ml、アンピシリンと 37 ° C, 250 rpm で一晩文化肯定的なクローンの 5 mL 文化を準備します。
  8. 適切なプラスミド抽出キットを使用して DNA のプラスミッドの浄化し、サンガーでプラスミドを確認 U6 前方プライマーによるシーケンスします。
  9. 10 %fbs と 1 %dmem で C2C12 細胞の培養テスト遺伝子プラスミッドの効果を編集するための 〜 70% の confluency に到達するまでペン連鎖球菌。
  10. Electroporate 5 μ g 製造元のプロトコルに従って 1 × 106 C2C12 細胞に 1:1 のモル比で SaCas9/gRNA プラスミドの混合物の合計。
  11. 48 時間後のトランスフェクション後 C2C12 細胞を収穫し、ゲノム DNA を抽出します。
  12. マウス ジストロフィン遺伝子座の PCR の反作用を実行するテンプレートとしての使用 100 ng ゲノム DNA: プライマー 5'-GGCCAAAGCAAACTCTGGTA を転送 (1 μ 10 µmol/L)、逆プライマー 5'-TTTAATCCCACGTCATGCAA (1 μ 10 µmol/L) 10、緑の PCR x 2 μ L マスター ミックス 7 μ L ddH2O 1 μ L ゲノム DNA (100 ng)。PCR を使用してサイクリング条件 95 ° C、5 分として [95 ° C 30 s、61 ° C 30 s、72 ° C 30 s] 35 サイクル 72 ° C 2 分。

2. 下さい rAAV 生産

  1. 細胞を培養する 20 に 40 15 cm 皿の上に AD293 細胞を播くし、10 %fbs と 1 %dmem で維持ペン-連鎖球菌の transfection のための ~ 90% の confluency に到達するまで。
  2. 200 μ L で希釈 3 プラスミド減少 (一皿) 血清中: 1) 10 μ g の pHelper;2) 5 μ g pXR (rh.74 または他の血清型)、3) pX601 i20 と pX601 i23 混合物 (1:1) の 5 μ g の合計。80 μ L PEI と混合してポリエチレンイミン (PEI) トランスフェクションを行い、滴状に 10 分追加 AD293 細胞培養に混合物を室温で孵化させなさい。
  3. AAV ウイルス産生、72 h ポスト トランスフェクション後 10 分 1100 × g で遠心分離してメディアと AD293 細胞ペレットの両方を収集するのに細胞スクレーパーを使用します。
  4. 液体窒素と 42 ° C の水浴でインキュベーションを交互に 3 凍結融解サイクルに続いて 15 mL 下さい rAAV 換散バッファー (50 ミリ モル/L 150 ミリ モル/L 塩化ナトリウム、pH 8.5、トリス基地) 内細胞ペレットを再懸濁します。-80 ° C、彼らがすぐに処理されていない場合は将来、処理セル lysates を格納します。
  5. 0.45 μ m フィルターでフィルター文化メディアと 8% の最終的な集中に 2.5 mol/l 塩化ナトリウム 40 %peg8000 を追加します。4 ° C 1 時間の混合物と 1100 × g で 15 分間遠心を孵化させなさい。
  6. 下さい rAAV 換散バッファーでペレットを再懸濁します、ステップ 2.3, 1 h 37 ° C で benzonase (50 U/mL) 治療が続きますからのセル lysates と結合します。
  7. 4 ° C で 15 分間混合物 1100 x g を含有する benzonase 処理下さい rAAV を遠心し、上清 (原油下さい rAAV 準備)。

3. 下さい rAAV 浄化と濃度

  1. 上から下に次の順序で遠心管の iodixanol 勾配に原油下さい rAAV 準備をロード: 原油 AAV ライセート (〜 15 mL) 8 mL の 15 パーセント 6 mL 25% Iodixanol Iodixanol、5 mL 40 %5 mL 58% Iodixanol Iodixanol。1 x DPBS を使用してトップ チューブの残りの空のボリュームを埋めます。
  2. 遠心分離機のサンプル 10 ° C で 120 分の超遠心機ローターで 230,000 x g で 18 G 針で下さい rAAV 粒子を含む 40% 勾配率の 3-4 mL を収集しています。
  3. 1 x DPBS と遠心遠心フィルター ユニット (MWCO 100 kDa) を使用して下さい rAAV 粒子を希釈します。に対してこの手順を繰り返します 3-5 回、最終的に 300-500 μ L に下さい rAAV 準備を集中。

4. 下さい rAAV あります。

  1. 2 μ L 集中して下さい rAAV、エタノール、3 M NaOAc と 20 μ L ddH2o. で再懸濁します沈殿物からゲノム DNA を抽出します。
  2. PX601 プラスミドのシリアル希釈して下さい rAAV 定量用標準曲線を取得: 1 × 109, 1 x 108,1 x 10 の71 x 106、各 10 μ L ddH2O. Dilute DNAase 処理下さい rAAV で 1 x 10 の5枚サンプルとして 1:10、1:50、1: 100、1: 1000。
  3. リアルタイム PCR システムの製造元の指示に従って qPCR キットを使用して量的なリアルタイム PCR (qPCR) して下さい rAAV 価を決定する: 1 μ 10 各プライマーの µmol/L (5'-GGATTTCCAAGTCTCCACCC、5'-TCCCACCGT ACACGCCTAC)、5 PCR マスター ミックス、希釈 1 μ L x 2 μ L下さい rAAV サンプルと 2 μ L ddH2修次サイクリング パラメーター反応を実行: 95 ° C [95 ° C 5 秒、61 ° C 20 秒] 45 サイクル 3 分。

5. 静脈と新生児mdx/研究+/-マウスに rAAVrh.74 CRISPR の腹腔内投与

  1. 1 分間氷の上を置くことによって、 mdx/研究+/-マウスの子犬 (3 日目) を固定し、1 x 1012 50 μ L/マウス レトロ軌道アプローチまたは腹腔内注射で全身でウイルス粒子とを管理します。
  2. 回復し、彼らのホームのケージに戻しマウスを許可します。下さい rAAV 投与後 10 週間で組織の採取の CO2の露出によってマウスを安楽死させます。
  3. ゲノム DNA および RNA の抽出、イソペンタン セクショニング化合物最適切削温度と組織を凍結する液体窒素を冷却の使用のためのティッシュのスナップ-凍結。

6. 成果を編集ターゲット遺伝子の解析

  1. ゲノム DNA の PCR 解析
    1. Mdx/研究+/-マウスの心臓組織からのゲノム DNA 治療下さい rAAV 有無合計を分離します。
    2. Pcr のステップ 1.12 で同じプロトコルを使用します。
  2. ジストロフィンの発現の RT-PCR 解析
    1. 製造元のマニュアルに従って RNA 抽出キットの心臓組織からの総 RNA を抽出します。
    2. 逆のトランスクリプションを実行、RNase フリーの DNase の総 RNA の事前治療し、最初繊維の cDNA を合成する逆転写キットのテンプレートとして扱われた RNA の 5 μ g を使用します。
    3. ジストロフィン cDNA プライマーのジストロフィン式の RT-PCR 解析で逆のトランスクリプション製品を使用: 5'-GGCTAGAGTATCAAACCAACATCAT、5'-TGGAGGCTTACGGTTTTATCC。
  3. QPCR による効果を編集遺伝子を推定します。
    1. 編集 (エクソン 21) の前方のプライマーを用いたエクソン 22 含む転写産物の減少を検出する RT-PCR によって有効性遺伝子を推定: 5'-TTGTCAGCTCTTCAGCCTCAAA、および逆プライマー (エクソン 23): 5'-AAACTCTCCTTCACAGTGTCACT。前方のプライマーと参照の遺伝子としての Gapdh の使用: 5'-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC と逆プライマー: 5'-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT。
    2. リアルタイム PCR システムと 2 段階反応条件の製造元の指示に従って qPCR キットを使用して量的なリアルタイム PCR (qPCR) を実行: 95 ° C 3 分、95 ° C 5 秒、61 ° C 30 秒 45 サイクル。
  4. ジストロフィンの発現を分析する染色蛍光抗体法
    1. 修正プログラムは、10 μ m の厚さでクライオスタットを用いた凍結組織で 15 分間室温で 4% パラホルムアルデヒド凍結切片をカットします。
    2. PBS で 2 倍を洗って、1 h のソリューション (10% 馬血清) をブロックで孵化させなさい。
    3. 4 ° c 夜間、抗ジストロフィンの一次抗体を孵化させなさい。
    4. PBS でスライドを洗って 3 x 5 分と蛍光二次抗体 (1: 500) 1 時間室温で孵化させなさい。
    5. DAPI でメディアをマウントを使用し、倒立の共焦点顕微鏡とイメージングのスライドをマウントします。

7 T7E1 法によるオフのターゲット分析

  1. オンライン CRISPR を使用して潜在的なターゲットをサイト デザイン ツールなどを予測する < http://crispr.mit.edu>。
  2. PCR によって 5-10 潜在的なターゲットをサイト上部を覆っているゲノムの領域を増幅する: ゲノム DNA 200 ng、1 μ L 高忠実度 DNA ポリメラーゼ、5 μ L の 10 倍 PCR バッファーのミックス、1.5 μ 10 50 μ L に容量を調整すること、サイト固有の前方および逆引きのプライマーの µmol/LddH2o.
  3. 電気泳動で PCR の製品を実行、抽出し、ゲル抽出キットを使用して DNA を浄化します。分光光度計を使用して濃度を測定します。
  4. 変化と再アニーリング PCR サーマルサイクラーを使用してバッファー 2.1 でゆっくりと精製 amplicons ヘテロ二本鎖形成を促進します。ステップ 1.2 の詳細として同じサイクリング条件を使用します。
  5. 0.5 μ L T7E1 酵素、37 ° C で 30 分間再熱処理製品を消化し、1 2% アガロースゲルを用いた電気泳動による反応を分析します。
    注: ターゲットのディープ シーケンスによって、amplicons 分析もできます。

結果

体内研究下さい rAAV に包む前に培養細胞の標的ゲノム DNA 領域の削除を誘導する gRNAs の有効性を評価しなければなりません。このため、gRNAs と SaCas9 を表現する構造であった C2C12 細胞に electroporated とターゲット サイト (図 1) を側面プライマーと PCR によるゲノム DNA を調べた。PCR の製品の ~ 500 bp ターゲット DNA 遺伝子制御の細胞ゲノム DNA のサ?...

ディスカッション

このプロトコルでは、生体内で心臓遺伝子 SaCas9 と 2 つの gRNAs の rAAVrh.74 を介した配信を使用して産後のマウスで編集を達成するために必要なすべての手順を詳しく説明します。前述のとおり、このアプローチは、私たちの仕事の27日に記載されている筋ジストロフィー マウスにおけるジストロフィン式を復元する使用ことができますがそれはの長いプロセスを使用?...

開示事項

利害の対立は存在しません。

謝辞

相対湿度は、米国国立衛生研究所健康補助金 (R01HL116546 および R01 AR064241) によってサポートされます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgGThermo Fisher ScientificA-21428
Benzonase NucleaseSigma-AldrichE1014
Bio Safety CabinetsThermo Fisher Scientific13471300 Series A2 Class II, Type A2
BsaINew England BioLabs IncRO535S
Competent cellsAgilent Technologies200314
Cell culture dishes, 150mmNest Scientific USA715001
CryostatLeica BiosystemsLeica CM3050S
DMEMThermo Fisher ScientificMT10017CVCorning cellgro
Dystrophin antibodySpring BioscienceE2660
Fast-Ion Midi Plasmdi KitsIBI ScientificIB47111
FBSThermo Fisher Scientific26-140-079
Filter Unit, 0.45μmThermo Fisher Scientific166-0045
GoTaq Master MixesPromegaM7122
High-speed plasmid mini kitIBI ScientificIB47102
Horse serumAbcamab139501
Isotemp 2239 Water BathThermo Fisher Scientific15-460-11Q
Isotemp Heat BlockThermo Fisher Scientific11-718
Inverted confocal microscopeCarl Zeiss Microscopy, LLCLSM 780
LightCycler 480 instrumentRoche5015243001LightCycler 480 Instrument II
Large Capacity CentrifugeThermo Fisher Scientific46-910Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002445Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop spectrophotometersThermo ScientificND2000CLAPTOPNanoDrop™ 2000/2000c
Oligos for i20-FIntegrated DNA TechnologiesCACCgGGCGT
TGAAATTCTCATTAC
Oligos for i20-RIntegrated DNA TechnologiesAAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
Oligos for i23-FIntegrated DNA TechnologiesCACCgCACCGATGAGAGGG
AAAGGTC
Oligos for i23-RIntegrated DNA TechnologiesGACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
OligosIntegrated DNA Technologies
OptiPrep Density Gradient MediumSigma-AldrichD1556-250ML
OptiMEMThermo Fisher Scientific31985070
PEG8000Sigma-Aldrich89510-1kg-F
PolyethyleniminePolysciences23966
Proteinase KSigma-AldrichP2308
Quick-Seal centrifuge tubeBeckman Coulter Inc342414
QIAquick Gel Extraction kitQiagen28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR KitsAlkali ScientificQS2005
RevertAid RT Reverse Transcription KitThermo Fisher ScientificK1691
RotorBeckman Coulter Inc337922Type 70Ti
T4 DNA ligaseNew England BioLabs IncM0202S
Thermal CyclerBio-rad1861096
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026
UltracentrifugeBeckman Coulter Inc8043-30-1192Optima le-80k
Ultra centrifugal filter unitMilliporeSigmaUFC510096
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPIVector Laboratories, IncH-1200

参考文献

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