Dos métodos de descelularización de tejidos vegetales para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Resumen

Aquí presentamos, y protocolos de contraste dos utilizan para decellularize los tejidos de la planta: un enfoque de base de detergente y un libre de detergente. Ambos métodos dejan la matriz extracelular de los tejidos de la planta utilizada, que luego puede ser utilizada como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Resumen

Los injertos autólogos, sintéticos y derivados de animales, actualmente utilizados como andamios para reemplazo de tejidos tienen limitaciones debido a la baja disponibilidad, pobre biocompatibilidad y costo. Los tejidos de la planta tienen características favorables que las hacen especialmente adecuado para utilizar como andamios, tales como superficie, excelente transporte y retención, porosidad interconectada, preexistente de redes vasculares y una amplia gama de mecánicas propiedades. Aquí se describen dos métodos exitosos de descelularización de planta para aplicaciones de ingeniería de tejidos. El primer método se basa en baños detergentes para quitar la materia celular, que es similar al previamente establecidos métodos utilizados para eliminar los tejidos mamíferos. El segundo es un método libre de detergente adaptado de un protocolo que aísla la vasculatura de la hoja y consiste en el uso de una lejía caliente y el baño de sal para limpiar las hojas y tallos. Ambos métodos producen andamios con propiedades mecánicas comparables y bajo impacto metabólico celular, lo que permite al usuario seleccionar el protocolo que mejor se adapte a su uso.

Introducción

Ingeniería de tejidos surgió en la década de 1980 para crear tejidos vivos sustitutos y potencialmente dirección importantes órganos y tejidos escasez¹. Una de las estrategias ha utilizar andamios para estimular y guiar el cuerpo para regenerar los tejidos o los órganos. Aunque avanzados métodos de fabricación tales como impresión en 3-d han producido andamios con características físicas únicas, la capacidad para la fabricación de andamios con una amplia gama de propiedades físicas y biológicas viables sigue siendo un reto^{2 , 3}. por otra parte, debido a la falta de una red vascular funcional, estas técnicas han sido limitadas en regeneración de tejido de 3 dimensiones. El uso de tejidos animales y humanos decellularized como andamios ha ayudado a eludir este problema^4,5,6,7. Sin embargo, el alto costo, la variabilidad lote a lote y la disponibilidad limitada pueden limitar uso generalizado de animal decellularized andamios⁸. También hay preocupaciones sobre la potencial transmisión de enfermedades a los pacientes y reacción inmunológica a algunos tejidos mamíferos decellularized⁹.

Celulosa, derivada de plantas y fuentes bacterianas, se ha utilizado ampliamente para generar Biomateriales para una amplia gama de aplicaciones en medicina regenerativa. Algunos ejemplos incluyen:^10,11, cartílago^12,13,14 y¹⁵de cicatrización ósea. Los andamios que se componen de celulosa tienen un beneficio adicional que son durables y resistentes a ser desglosadas por células de mamífero. Esto es debido a que las células de mamífero no producen las enzimas necesarias para descomponer las moléculas de celulosa. En comparación, andamios producción con macromoléculas de la matriz extracelular, como colágeno, se descomponen fácilmente con¹⁶ y no sea idóneos para aplicaciones a largo plazo. Andamios de colágeno pueden ser estabilizados por reticulación química. Sin embargo, existe una relación inversa debido a la toxicidad inherente de los cross-linkers que afectan la biocompatibilidad de los andamios¹⁷. Por el contrario, la celulosa tiene el potencial de permanecer presentes en el lugar de implantación durante períodos prolongados de tiempo porque son impermeable a la degradación enzimática de las células mamíferas^18,19,20. Esto puede modificarse mediante la regulación de la tasa de degradación a través de pretratamiento de hidrólisis y la entrega de los andamios con celulasas²¹. La biocompatibilidad de celulosa de origen vegetal decellularized andamios en vivo también se ha demostrado en un estudio realizado en ratones²².

A través de cientos de millones de años de evolución, las plantas han refinado su estructura y composición para aumentar la eficiencia de transporte de fluidos y la retención. Planta vasculares vasos minimizan resistencia hidráulica por ramifican en vasos más pequeños, similares a la vasculatura mamífera según²³de la ley de Murray. Después de descelularización, se mantiene la red compleja de la planta de los vasos y poros interconectados. Teniendo en cuenta la gran cantidad de especies de plantas distintas disponibles, andamios de origen vegetal tienen el potencial para superar limitaciones de diseño que afecta actualmente a andamios en tejido ingeniería^24,25. Por ejemplo, Modulevsky et al demostraron que la angiogénesis y migración celular ocurrió cuando apple decellularized tejido fue implantado por vía subcutánea en la parte posterior de un ratón²². Semejantemente, Gershlak et al. , demostró que las células endoteliales podrían ser crecidas dentro de la vasculatura de hojas decellularized²⁴. En un experimento separado, Gershlak et al. también fueron capaces de demostrar que cardiomiocitos podrían cultivarse en la superficie de las hojas y pudieron contratar²⁴.

Las plantas también incluyen organización compleja desde el celular a la escala macroscópica, que es difícil de conseguir incluso con las más avanzadas técnicas de fabricación desarrolladas hasta la fecha. El diseño jerárquico complejo de tejidos de la planta hace más fuerte que la suma de sus componentes²⁶. Las plantas poseen una gran cantidad de propiedades mecánicas diferentes que van desde componentes rígidos y resistentes como los tallos, a unos mucho más flexibles y maleables como hojas²⁷. Hojas varían dependiendo de la especie en términos de tamaño, forma, rompen la resistencia, el grado de vascularización y pueden llevar a diferentes grados de hidrofilicidad. En general, estas propiedades de la planta sugieren que decellularized las plantas pueden servir como dispositivos médicos únicos y altamente funcionales, como los andamios de la ingeniería del tejido.

Este protocolo se centra en dos métodos para decellularize los tejidos vegetales, como hojas y tallos, para el uso como andamios en ingeniería tisular. El primer método es una técnica basada en el detergente que utiliza una serie de baños para extraer ADN y materia celular, que ha sido adaptada de una técnica ampliamente utilizada decellularize mamíferos y vegetales tejidos^{6,22,25 ,28,29,30}. El segundo método está libre de detergente y es una adaptación de un protocolo de "skeletonization" generalmente se utiliza para eliminar los tejidos blandos de hojas³¹. Trabajos previos demostraron que hirviendo las hojas en una solución de lejía y bicarbonato de sodio facilita la separación de la vasculatura de los tejidos blandos circundantes³¹. Esta técnica se puede citar a experimentos realizados en el^th de 17 y^{18 siglos, tales como el trabajo de Albertus Seba32 y33de Edward Parrish} . Estos experimentos de centrar dejando materia vegetal, como hojas y frutos, sumergieron en agua durante largos períodos de tiempo (semanas a meses) y permitir que los tejidos más suaves al decaimiento, naturalmente. Aquí el enfoque "skeletonization" está adaptado para utilizar condiciones más suaves, tales como tiempos de incubación más largos a temperaturas más bajas, para eliminar los residuos celulares y para evitar distorsionar significativamente la estructura de tejidos blandos. Para los experimentos detallados en este documento, se utilizaron tres tipos de plantas: Ficus hispida, Pachira aquatica y una especies de Garcinia. Resultados de la cuantificación de ADN, pruebas mecánicas e impacto en la actividad metabólica celular de ambos métodos se describen.

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Protocolo

1. descelularización del tejido vegetal usando el enfoque de detergente

1. Utilice frescas o congeladas de F. hispida, muestras foliares. Congelación de muestras frescas no utilizadas en un congelador de-20 ° C y un almacén para uso futuro (hasta un año).
   Nota: Utilizar tejido de tallo o de hoja de casi cualquier planta deseada. Veces de un almacenamiento prolongado pueden causar daño a los tejidos.
   1. Determinar el tamaño y la forma de muestras a procesar en base a uso de la muestra (es decir, muestras cortadas en tiras son ideales para aplicaciones de pruebas mecánicas, mientras tanto son útiles en aplicaciones de cultivo múltiples bien muestras de disco de 8 mm ). Cortar la hoja en discos de 8 mm con una biopsia fuerte, limpio golpe mientras sumergido bajo temperatura ambiente (20-25 ° C) desionizada H₂O.
      Nota: Este protocolo se puede utilizar en tallos y hojas enteras. Sin embargo, muestras más pequeñas se decellularize más rápido.
   2. Incubar las muestras por 5-10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C) desionizada H₂O en un conjunto de placa de agitar a un ajuste de baja velocidad para lavar o descongelarlos. Uso suficientemente desionizada H₂O para que todas las muestras están completamente mojadas.
2. Preparar una solución de 10% (p/v) sodio dodecil sulfato (SDS) en desionizada H₂O. lugar las muestras en un recipiente adecuado (un vaso o plato de plástico es ideal) y añadir solución de SDS para cubrir completamente las muestras. Incubar las muestras durante 5 días a temperatura ambiente (20-25 ° C) en un shake de placas ajustado a una velocidad baja para evitar daños en las muestras.
   Nota: No masificar el envase ya que esto puede ralentizar el proceso de descelularización y llevar al tratamiento desigual por la SDS. Durante este paso, las muestras deben adquirir una tonalidad marrón.
   1. Después de 5 días, reemplazar la solución de SDS con desionizada H₂O. Incubar las muestras para un 10-15 minutos adicionales en la placa de la sacudida para enjuagar completamente cualquier resto de solución SDS.
3. Preparar un tensioactivo no iónico 1% (v/v) en solución de lejía del 10% (v/v). Para hacer una solución de 500 mL, mezclar 5 mL de surfactante no iónico con 50 mL de lejía 445 mL de desionizada H₂O. Sumerja las muestras en la solución recién preparada.
   Nota: La solución de blanqueador de surfactante no iónico no tiene una vida útil larga, por lo tanto, debe utilizarse dentro de las 48 h de preparación.
4. Reemplazar la solución de blanqueador de surfactante no iónico cada 24 h hasta que las muestras son completamente (ver figura 1A para la comparación visual). Luego incubar la muestra en agua desionizada en un plato de agitar por 2 min para enjuagar la solución de surfactante no iónico exceso/blanqueador. Coloque la placa de la sacudida en un ajuste bajo para no dañar las muestras.
   Nota: El tiempo necesario para borrar las muestras utilizadas varía, dependiendo del tipo y especie de la planta. La completa decoloración de las muestras es indicativo de descelularización completo (realizar cuantificación de ADN para asegurar fondo claro).
   1. Liofilizar muestras para almacenar hasta un año (flash congelación con nitrógeno líquido es preferido, congelar muestras de-80 ° C también es aceptable) y almacenar a temperatura ambiente (20-25 ° C) a baja humedad.
   2. Reconstituya las muestras en Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) con bastantes muestras de la capa. Enjuagar las muestras 2 - 3 veces en medios libres de suero con la ayuda de una micropipeta antes de su uso (es decir, uso 150-300 μL por enjuague en una placa bien 24 estándar).
      Nota: Tampón Tris-HCl y medios libres de suero (es decir, DMEM, pero ninguna cultura de célula básica media puede sustituirse) son más eficaces en reducir el impacto en la viabilidad celular de las muestras de la SDS tratados que aquellos tratados con desionizada H₂O solo.

2. preparación de las muestras utilizando el enfoque de descelularización libre de detergente

Nota: Los primeros pasos de este procedimiento coinciden con pasos 1.1-1.1.2 (véase arriba).

1. Preparar una solución de bicarbonato de sodio (NaHCO₃) 3% (p/v) y 5% (v/v) lejía (NaClO). Calentar la solución en una campana de humos a 60-70 ° C para las muestras de hojas de F. hispida cortar discos de 8 mm mientras que revuelve en una placa caliente.
   Nota: Puede sustituirse el bicarbonato de sodio con carbonato de sodio (Na₂CO₃), o hidróxido de sodio (NaOH). La temperatura varía enormemente (de temperatura a 90 ° C) y debe ajustarse de acuerdo con las propiedades de las muestras utilizadas.
2. Una vez que la solución alcanza la temperatura deseada, sumergir las muestras y reducir la velocidad de agitación para evitar dañarlos. Después de que las muestras son visiblemente despejadas (refiérase a figura 1B para comparación visual), retirar del baño cuidadosamente. Incubar las muestras una vez desionizada de H₂O por 1-2 min eliminar el exceso de lejía solución.
   Nota: El tiempo necesario para borrar las muestras puede variar ampliamente. Por ejemplo, perejil cortado puede eliminarse en 10-15 min, mientras que las muestras más gruesas o más grandes como conjunto las hojas o tallos pueden tardar horas en baños de alta temperatura para eliminar completamente.
3. Liofilizar las muestras y almacenar a temperatura ambiente (20-25 ° C) a baja humedad.

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Resultados

Ambos métodos produjeron andamios que eran convenientes para el cultivo de células y tejidos, aplicaciones de ingeniería. La figura 1 muestra el flujo general del proceso de descelularización utilizando una hoja intacta para el método base de detergente y corte muestras (8 mm de diámetro) para el método libre de detergente. Éxito descelularización de Ficus hispida tejidos siguiendo ambos métodos rindió muestras claras e intactas (

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Discusión

En este documento, se describen dos métodos para decellularize los tejidos vegetales. Los resultados presentados aquí, junto con los resultados de²⁵estudios anteriores sugieren que los protocolos planteados son probablemente aplicable a un amplio espectro de especies de plantas y se pueden realizar en tallos y hojas. Estos procedimientos son simples y no requieren de equipo especializado, para que planta descelularización puede llevarse a cabo en la mayoría de los laboratorios. Cabe destacar q...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)	Clorox	Item #: 31009	Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate	Acros Organics	217120010	Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate	Fisher Scientific		Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker	Any		Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay	Life Technologies	P11496	Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.