JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем, и контраст двух протоколов используется для decellularize растительных тканей: подход на основе моющих средств и моющих средств свободный подход. Оба метода оставить позади внеклеточного матрикса в тканях растений используется, который затем может быть использован как строительные леса для ткани инженерных приложений.

Аннотация

Аутологичные, синтетические и животных, полученных графтов, в настоящее время используется как строительные леса для замены тканей имеют ограничения из-за низкой доступности, плохое биосовместимость и стоимость. Ткани растений имеют благоприятные характеристики, которые делают их уникально подходит для использования в качестве лесов, таких как большую площадь поверхности, отличный водный транспорт и удержания, взаимосвязанных пористость, существующий сосудистой сети и широкий спектр механических Свойства. Здесь описываются две успешные методы decellularization завод для ткани инженерных приложений. Первый метод основан на стиральный порошок ванны для удаления клеточной материи, которая похожа на ранее установленные методы, используемые для очистки тканей млекопитающих. Вторая — это моющее средство бесплатно метод, адаптированный вариант протокола, который изолирует листьев сосудистую и предполагает использование подогревом отбеливателя и солевая ванна для очистки листья и стебли. Оба метода дают подмости с сопоставимыми механическими свойствами и низкой сотовой метаболические последствия, таким образом позволяя пользователю выбрать протокол, который лучше подходит для их предполагаемого применения.

Введение

Тканевая инженерия появилась в 80-х годов для создания живых тканей заменителей и потенциально адрес существенных органов и тканей нехватки1. Одна из стратегий использовала подмостей стимулировать и направлять тела, чтобы регенерировать недостающие тканей или органов. Хотя производство подходы, такие, как 3-D печати дали подмости с уникальными физическими свойствами, способность производить строительные леса с разнообразными достижимых физических и биологических свойств остается задача2 , 3. Кроме того, из-за отсутствия функциональной сосудистой сети, эти методы были ограничены в регенерации 3-мерных тканей. Использование decellularized тканей животных и человека как строительные леса помог в обход этой проблемы4,5,6,7. Однако, высокая стоимость, партии партии изменчивость и ограниченная доступность может ограничить широкое использование decellularized животное помостами8. Есть также опасения по поводу потенциальной передачи болезни пациентов и иммунологические реакции на некоторые decellularized тканей млекопитающих9.

Целлюлоза, полученных из растений и бактериального происхождения, широко использовался для создания биоматериалов для широкого круга приложений в регенеративной медицине. Некоторые примеры включают: кости10,11, хряща12,13,14 и15ранозаживляющее. Строительные леса, которые состоят из целлюлозы имеют дополнительное преимущество в том, что они являются прочными и устойчивыми к разбивке mammalian клеток. Это связано с тем, что клетки млекопитающих не вырабатывают ферменты, необходимые для сломать молекулы целлюлозы. В сравнении подмости изготавливаются с использованием макромолекул из внеклеточного матрикса, таких как коллаген, легко разбиваются16 и не может быть хорошо подходит для долгосрочного применения. Коллаген строительные леса могут быть стабилизированы по химической сшивки. Однако существует компромисс из-за присущего токсичность сшивок, которые влияют на биосовместимость подмостей17. И наоборот целлюлоза имеет потенциал, чтобы оставаться на месте имплантации для длительных периодов времени, потому что он непроницаем для энзимной деградации клеток млекопитающих18,19,20. Это может быть изменено путем настройки скорость деградации через гидролиз предварительной обработки и Сопредседатель доставки леса с целлюлазы21. Биосовместимость decellularized завод производные целлюлозы леса в естественных условиях также было продемонстрировано в исследовании, проведенном на мышах22.

Через сотни миллионов лет эволюции растения имеют изысканный их структуры и состава для повышения эффективности жидкости транспорта и хранения. Завод сосудистой судов минимизировать гидравлическое сопротивление, ветвится на более мелкие суда, похож на млекопитающих сосудистую согласно Мюррея закон23. После decellularization поддерживается завода сложную сеть сосудов и взаимосвязанных поры. Учитывая огромное количество видов различных растений, которые легко доступны растительного леса имеют потенциал для преодоления ограничений разработки в настоящее время затрагивающих леса в ткани, инженерных24,25. Например Modulevsky et al. продемонстрировал, что ангиогенез и клеток миграции произошла decellularized яблоко ткани был имплантирован подкожно на задней части мыши22. Аналогично Gershlak et al. показал, что эндотелиальные клетки могут быть выращены в сосудистую decellularized листья24. В отдельном эксперименте Gershlak et al. также смогли показать, что cardiomyocytes можно выращивать на поверхности листьев и смогли контракта24.

Растения также включают сложную организацию от сотовой макроскопических масштабе, который трудно добиться даже с самых передовых методов производства, разработанных до сих пор. Сложных иерархических дизайн тканей растений делает их сильнее, чем сумма их избирателей26. Растения обладают множеством различных механических свойств, начиная от жесткой и жесткой компонентов, таких как стебли, гораздо более гибким и податливой, такие как листья27. Листья различаются в зависимости от вида с точки зрения размера, форма, нарушить прочность, степень васкуляризации и может иметь различные степени гидрофильность. В целом эти свойства растений показывают, что decellularized растения может служить уникальным и весьма функциональный медицинских устройств, включая как ткани, инженерные строительные леса.

Этот протокол фокусируется на два метода, decellularize растительных тканей, таких как листья и стебли, для использования в качестве строительных лесов в тканевой инженерии. Первый метод является методом на основе моющих средств, использующий серия ванн для удаления ДНК и клеточного материи, которая была адаптирована из широко используемый метод decellularize млекопитающих и растительных тканей6,22,25 ,28,29,30. Второй метод моющих средств-свободно и адаптирован из протокола «skeletonization», обычно используется для удаления мягких тканей листья31. Предыдущие работы показал, что кипячения листьев в растворе отбеливателя и бикарбонат натрия облегчает разделение сосудистую от окружающих мягких тканей31. Этот метод можно привести обратно к экспериментов, проведенных 17-й и18 веках, например работу Seba Альбертус32 и33Эдвард Пэрриш . Эти эксперименты, вокруг оставляя растительной массы, например, листья и плоды, погруженной в воду в течение длительного периода времени (недель до месяцев) и позволяя мягкие ткани разрушаться от естественно. Здесь «skeletonization» подход адаптирован для использования более мягких условиях, например, длиннее время инкубации при более низких температурах, чтобы удалить остатки клеточных и избежать значительно нарушить структуру мягких тканей. Для экспериментов, изложенных в настоящем документе, были использованы три вида растений: фикус hispida, Пахира водная и видов Гарциния. Описаны результаты количественной оценки ДНК, механических испытаний и влияние на клеточном метаболической активности от обоих методов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. decellularization растительной ткани, используя подход на основе моющих средств

  1. Используйте свежие или замороженные F. hispida, образцы листьев. Заморозить неиспользованный свежих образцов в морозильник-20 ° C и хранить для будущего использования (до года).
    Примечание: Использование стволовых или листовой ткани практически любого желаемого завода. Длительного хранения раз может привести к повреждению тканей.
    1. Определить размер и форма образцов для обработки на основе предполагаемого использования образца (т.е. образцы, порезать на полоски хорошо подходят для механического тестирования приложений, тем временем 8 мм диск образцы полезны в нескольких хорошо культивирования приложений ). Разрезать лист на 8 мм диски с биопсией острый, чистый удар в то время как под водой при комнатной температуре (20-25 ° C) деионизированная H2O.
      Примечание: Этот протокол может использоваться на весь листья и стебли. Однако небольшие образцы будут decellularize быстрее.
    2. Проинкубируйте образцы для 5-10 мин при комнатной температуре (20-25 ° C) деионизированная H2O на трясти плита набор для низкой скорости мойте или растопить их. Используйте достаточно дейонизированной H2O чтобы убедиться, что все образцы тщательно смоченные.
  2. Подготовить раствор 10% (w/v) лаурилсульфат натрия (SDS) в дейонизированной H2O. место образцы в подходящую емкость (стеклянные или пластиковые блюдо идеально) и добавить SDS решение полностью покрывают образцы. Проинкубируйте образцы на 5 дней при комнатной температуре (20-25 ° C) на множестве пластины трясти на низкой скорости для предотвращения повреждения образцов.
    Примечание: Не переполнять контейнера, как это может замедлить процесс decellularization и привести к неравномерным лечение ИКБ. Во время этого шага образцы следует приобретать коричневый оттенок.
    1. После 5 дней замените решение SDS с дейонизированной H2O. инкубировать образцы для дополнительных 10-15 мин на пластину встряска для тщательно смойте любого остаточного решения SDS.
  3. Подготовьте 1% (v/v) неионных ПАВ в раствор отбеливателя 10% (v/v). Чтобы сделать 500 мл раствора, смешать 5 мл неионных ПАВ с 50 мл отбеливателя, а затем добавить 445 мл дейонизированной H2O. Submerge образцы в свежеприготовленный раствор.
    Примечание: Неионных ПАВ/Блич решения не имеют длительный срок хранения, поэтому, должны быть использованы в течение 48 часов подготовки.
  4. Заменить неионных ПАВ/отбеливатель решение каждые 24 ч до тех пор, пока образцы полностью очищен (см рис. 1A для визуального сравнения). Затем инкубации образца в дейонизированной воде на плите трясти за 2 мин чтобы смыть излишки неионных ПАВ/отбеливатель решение. Установите пластину трясти низкое значение для предотвращения повреждения образцов.
    Примечание: Время, необходимое для очистки образцов, используемых варьируется, в зависимости от типа и вида растений. Полное обесцвечивание образцов свидетельствует о полной decellularization (выполнять ДНК количественной оценки для обеспечения тщательной очистки).
    1. Lyophilize образцы для их хранения до одного года (flash, замораживания, с использованием жидкого азота является предпочтительным, замораживание образцов в-80 ° C приемлемо) и хранить их при комнатной температуре (20-25 ° C) в условиях низкой влажности.
    2. Восстановить образцы в Tris-HCl (10 мм, рН 8,5) с использованием достаточно пальто образцы. Промывайте образцы 2 - 3 раза в сыворотке свободных СМИ, аккуратно с помощью микропипеткой перед использованием (т.е. использование 150-300 мкл на полоскание, в стандартных 24 хорошо пластины).
      Примечание: Буфер Tris-HCl и сыворотки свободных средств массовой информации (т.е. DMEM, но любой основной клеточной культуры, которую средства массовой информации может быть заменен) являются более эффективными в снижении воздействия на жизнеспособность клеток SDS лечение образцов, чем те, которые относились с дейонизированной H2O только.

2. подготовка проб с использованием моющих средств бесплатная Decellularization подход

Примечание: Первые шаги этой процедуры совпадают с шаги 1.1-1.1.2 (см. выше).

  1. Подготовьте 5% (v/v) bleach (NaClO) и 3% (w/v) раствор бикарбоната натрия (3NaHCO). Теплый раствор в вытяжного шкафа до 60-70 ° C для образцов листьев F. hispida , разрезать на 8 мм диски помешивая на горячей плите.
    Примечание: Бикарбонат натрия может быть заменен с карбонатом натрия (Na2CO3), или гидроокиси натрия (NaOH). Желаемая температура колеблется значительно (от комнатной температуры до 90 ° C) и должны быть скорректированы с учетом свойств образцов, используемых.
  2. Как только решение достигает желаемой температуры, опускайте образцы и уменьшить перемешивания скорость, чтобы избежать их повреждения. После того, как образцы заметно очищаются (см. рис. 1B для визуального сравнения), осторожно извлеките из ванны. Проинкубируйте образцы раз в дейонизированной H2O для 1-2 мин удалить избыток отбеливатель решение.
    Примечание: Время, необходимое для очистки образцы могут широко варьироваться. Например вырезать петрушки может быть очищен в 10-15 мин, пока толще и/или больших образцов, таких, как целом листья или стебли могут принять часы в высокой температуры ванны, чтобы полностью очистить.
  3. Lyophilize образцы и хранить их при комнатной температуре (20-25 ° C) в условиях низкой влажности.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Оба метода принесли лесов, которые были пригодны для культуры клеток и тканей, инженерных приложений. Рисунок 1 показывает общий рабочий процесс decellularization, используя нетронутыми лист для метода на основе моющих средств и вырезать образцы (диаметром 8 мм...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь описываются два метода, decellularize растительных тканей. Результаты, представленные здесь, в сочетании с результатами предыдущих исследований25, показывают, что протоколы выдвинули, вероятно, применимые к широкому спектру видов растений и может быть выполнена на стебли и...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Джона Wirth Ольбрих садов за любезное предоставление образцы, используемые в этом проекте. Эта работа частично поддерживается национальный сердца, легких и крови института (R01HL115282 G.R.G.) Национальный научный фонд (DGE1144804 J.R.G и G.R.G.) и университета штата Висконсин Департамент хирургии и выпускников фонда (H.D.L.). Эта работа также поддержали частично агентства по охране окружающей среды (Грант № 83573701 звезда), национальные институты здравоохранения (R01HL093282-01A1 и UH3TR000506) и Национальный научный фонд (IGERT DGE1144804).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium dodecyl sulfateSigma Life Science75746-1KG
Triton X-100MP Biomedicals, LLC807426Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)CloroxItem #: 31009Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonateAcros Organics217120010Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm BiopunchHealthLink15111-80Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake tableStovall Life SciencesBDRAA115SUse low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plateFisher ScientificCan use any style/brand of hot/stir plate.
BeakerAnyCan use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris HydrochlorideFisher ScientificBP153-500
DMEMCorningMT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assayLife TechnologiesP11496Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.

Ссылки

  1. Vacanti, J. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art. Journal of Pediatric Surgery. 45 (2), 291-294 (2010).
  2. Kim, S., et al. Survival and function of hepatocytes on a novel three-dimensional synthetic biodegradable polymer scaffold with an intrinsic network of channels. Annals of Surgery. 228 (1), 8-13 (1998).
  3. Park, A., Wu, B., Griffith, L. Integration of surface modification and 3D fabrication techniques to prepare patterned poly(L-lactide) substrates allowing regionally selective cell adhesion. Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition. 9 (2), 89-110 (1998).
  4. Steinhoff, G., et al. Tissue engineering of pulmonary heart valves on allogenic acellular matrix conduits: in vivo restoration of valve tissue. Circulation: JAMA. 102 (Suppl 3), III-50- III -55. 102 (Suppl 3), III-50-III-55 (2000).
  5. Stock, U., et al. Tissue-engineered valved conduits in the pulmonary circulation. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 119 (4 Pt 1), 732-740 (2000).
  6. Ott, H., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
  7. Guyette, J., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
  8. Huerta, S., Varshney, A., Patel, P., Mayo, H., Livingston, E. Biological Mesh Implants for Abdominal Hernia Repair: US Food and Drug Administration Approval Process and Systematic Review of Its Efficacy. JAMA Surgery. 151 (4), 374-381 (2016).
  9. Catalano, E., Cochis, A., Varoni, E., Rimondini, L., Azzimonti, B. Tissue-engineered skin substitutes: an overview. Journal of Artificial Organs. 16 (4), 397-403 (2013).
  10. Fang, B., Wan, Y., Tang, T., Gao, C., Dai, K. Proliferation and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells on hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposite scaffolds. Tissue Engineering. 15 (5), 1091-1098 (2009).
  11. Wan, Y., et al. Biomimetic synthesis of hydroxyapatite/bacterial cellulose nanocomposites for biomedical applications. Materials Science and Engineering. 27 (4), 855-864 (2007).
  12. Vinatier, C., et al. An injectable cellulose-based hydrogel for the transfer of autologous nasal chondrocytes in articular cartilage defects. Biotechnology and Bioengineering. 102 (4), 1259-1267 (2009).
  13. Vinatier, C., et al. A silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel for the three-dimensional culture of chondrocytes. Biomaterials. 26 (33), 6643-6651 (2005).
  14. Vinatier, C., et al. Engineering cartilage with human nasal chondrocytes and a silanized hydroxypropyl methylcellulose hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 66-74 (2007).
  15. Helenius, G., Bäckdahl, H., Bodin, A., Nannmark, U., Gatenholm, P., Risberg, B. In vivo biocompatibility of bacterial cellulose. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 76 (2), 431-438 (2006).
  16. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 79 (3), 456-463 (2006).
  17. Thomas, D., et al. A shape-controlled tuneable microgel platform to modulate angiogenic paracrine responses in stem cells. Biomaterials. 35 (31), 8757-8766 (2014).
  18. Lai, C., Zhang, S., Wang, L., Sheng, L., Zhou, Q., Xi, T. The relationship between microstructure and in vivo degradation of modified bacterial cellulose sponges. Journal of Materials Chemistry B. 3 (46), 9001-9010 (2015).
  19. Märtsonad, M., Viljantoa, J., Hurmea, T., Laippalac, P., Saukkob, P. Is cellulose sponge degradable or stable as implantation material? An in vivo subcutaneous study in the rat. Biomaterials. 20 (21), 1989-1995 (1999).
  20. Miyamoto, T., Takahashi, S., Ito, H., Inagaki, H., Noishiki, Y. Tissue biocompatibility of cellulose and its derivatives. Journal of Biomedical Materials Research. 23 (1), 125-133 (1989).
  21. Entcheva, E., Bien, H., Yin, L., Chung, C., Farrell, M., Kostov, Y. Functional cardiac cell constructs on cellulose-based scaffolding. Biomaterials. 25 (26), 5753-5762 (2004).
  22. Modulevsky, D., Cuerrier, C., Pelling, A. Biocompatibility of Subcutaneously Implanted Plant-Derived Cellulose Biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894(2016).
  23. McCulloh, K., Sperry, J., Adler, F. Water transport in plants obeys Murray's law. Nature. 421 (6926), 939-942 (2003).
  24. Gershlak, J., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  25. Fontana, G., et al. Biofunctionalized Plants as Diverse Biomaterials for Human Cell Culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), (2017).
  26. Wegst, U., Bai, H., Saiz, E., Tomsia, A., Ritchie, R. Bioinspired structural materials. Nature Materials. 14 (1), 23-36 (2015).
  27. Gibson, L. The hierarchical structure and mechanics of plant materials. Journal of the Royal Society Interface. 9 (76), 2749-2766 (2012).
  28. Hoshiba, T., et al. Decellularized Extracellular Matrix as an In vitro Model to Study the Comprehensive Roles of the ECM in Stem Cell Differentiation. Stem Cells International. 2016, (2016).
  29. Guyette, J., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
  30. Modulevsky, D. J., et al. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE. 9 (5), e97835(2014).
  31. Blonder, B. How to make leaf skeletons. , Available from: http://benjaminblonder.org/The_secrets_of_leaves/Making_skeletons.html (2017).
  32. Seba, A., Sloane, H. The Anatomical Preparation of Vegetables, by Albertus Seba, F. R. S. Communicated to the Royal Society by Sir Hans Sloane, Bart. Pr. R. S. and Col. Med. Lond. Translated from the German, by Mr. Zolman, F. R. S. Philosophical Transactions. 36 (407), 441-444 (1775).
  33. Parrish, E. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. The Phantom Boutique: A Popular Treatise on the Art of Skeletonizing Leaves and Seed-Vessels and Adapting Them to Embellish the Home of Taste. , (1865).
  34. Coffin, S., Gaudette, G. Aprotinin extends mechanical integrity time of cell-seeded fibrin sutures. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (9), 2271-2279 (2016).
  35. Zangala, T. Isolation of Genomic DNA from Mouse Tails. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e246(2007).
  36. Borselli, C., Cezar, C., Shvartsman, D., Vandenburgh, H., Mooney, D. The role of multifunctional delivery scaffold in the ability of cultured myoblasts to promote muscle regeneration. Biomaterials. 32 (34), 8905-8914 (2011).
  37. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Designing Scaffolds to Enhance Transplanted Myoblast Survival and Migration. Tissue Engineering. 12 (5), 1295-1304 (2006).
  38. Hill, E., Boontheekul, T., Mooney, D. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (8), 2494-2499 (2006).
  39. Ma, J., Holden, K., Zhu, J., Pan, H., Li, Y. The Application of Three-Dimensional Collagen-Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-9 (2011).
  40. Tyree, M. Plant hydraulics: the ascent of water. Nature. 424 (6943), 923(2003).
  41. Raven, P., Evert, R., Eichhorn, S. Biology of Plants. , 7th edition, (2005).
  42. Turrell, F. The area of the internal exposed surface of dicotyledon leaves. American Journal of Botany. 23 (4), 255-264 (1936).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

135Decellularizedperfusabledecellularization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены