Deux méthodes de DÉCELLULARISATION de tissus végétaux pour utilisations en génie tissulaire

Résumé

Nous présentons ici, et contraste deux protocoles utilisés pour decellularize les tissus végétaux : une approche axée sur le détergent et une approche sans tensioactifs. Les deux méthodes laissent derrière eux de la matrice extracellulaire des tissus végétaux utilisés, qui peut ensuite servir d’échafaudages pour applications d’ingénierie tissulaire.

Résumé

Les greffes autologues, synthétiques et issus d’animaux actuellement utilisées comme échafaudages pour le remplacement de tissus ont des limitations dues à la faible disponibilité, mauvaise biocompatibilité et coût. Tissus végétaux ont des caractéristiques favorables qui les rendent particulièrement bien adapté pour les utiliser comme échafaudages, tels que la grande surface, le transport de l’eau excellente et rétention, porosité interconnectée, préexistant des réseaux vasculaires et un large éventail de mécanique Propriétés. Deux méthodes réussies de DÉCELLULARISATION plante pour applications d’ingénierie tissulaire sont décrites ici. La première méthode repose sur des bains de détergent pour enlever les matières cellulaires, ce qui est semblable aux méthodes établies auparavant utilisés pour effacer les tissus des mammifères. La seconde est une méthode sans détergent adaptée d’un protocole qui isole la vascularisation de la feuille et implique l’utilisation d’une eau de Javel chauffée et un bain de sel pour dégager les feuilles et les tiges. Les deux méthodes donnent des échafaudages avec des propriétés mécaniques comparables et faible impact métabolique cellulaire, permettant ainsi à l’utilisateur de sélectionner le protocole qui convient le mieux à leur application prévue.

Introduction

Génie tissulaire a émergé dans les années 1980 pour créer un tissu vivant des substituts et potentiellement adresse importants organes et tissus pénuries¹. Une stratégie a utilisé des échafaudages pour stimuler et guider le corps pour régénérer des tissus ou des organes manquants. Bien que la fabrication de pointe des approches telles que l’impression 3D ont produit des échafaudages avec des propriétés physiques uniques, la capacité de fabriquer des échafaudages avec une gamme variée de réalisables propriétés physiques et biologiques reste un challenge^{2 , 3}. en outre, en raison de l’absence d’un réseau vasculaire fonctionnel, ces techniques ont été limités dans la régénération de tissus 3-dimensions. L’utilisation de DECELLULARISE tissus animaux et humains comme échafaudages a aidé à contourner ce problème,^4,5,6,7. Cependant, coût élevé, la variabilité de lot et disponibilité limitée peuvent limiter l’utilisation généralisée des animaux DECELLULARISE échafaudages⁸. Il y a également des préoccupations concernant l’éventuelle transmission de la maladie aux patients et de la réaction immunologique à certains tissus de mammifères DECELLULARISE⁹.

Cellulose, dérivée de la plante et des sources bactériennes, a été largement utilisée pour générer des biomatériaux pour un large éventail d’applications dans la médecine régénérative. Voici quelques exemples : OS^10,11, cartilage^12,,du¹³,¹⁴ et¹⁵de cicatrisation. Les échafaudages qui sont composés de cellulose ont un avantage supplémentaire car ils sont durables et résistantes à ventilées selon les cellules de mammifères. Cela est dû au fait que les cellules de mammifères ne produisent pas les enzymes nécessaires pour décomposer les molécules de cellulose. En comparaison, les échafaudages produites à l’aide de macromolécules de la matrice extracellulaire, comme le collagène, sont facilement décomposés de¹⁶ et peuvent ne pas être bien adaptés aux applications à long terme. Les échafaudages de collagène peuvent être stabilisées par réticulation chimique. Cependant, il y a un compromis en raison de la toxicité intrinsèque de l’agents qui affectent la biocompatibilité des échafaudages¹⁷. À l’inverse, cellulose peut rester présents sur le site d’implantation pour de longues périodes car il est imperméable à la dégradation enzymatique par les cellules de mammifères^18,19,20. Cela peut être modifiée par le réglage de la vitesse de dégradation par un prétraitement hydrolyse et co-exécutants des échafaudages avec cellulases²¹. La biocompatibilité des échafaudages DECELLULARISE cellulose végétale en vivo a aussi démontrée dans une étude réalisée sur des souris,²².

À travers des centaines de millions d’années d’évolution, les plantes ont raffiné leur structure et leur composition pour accroître l’efficacité du transport des fluides et de la rétention. Plante vasculaires navires minimisent la résistance hydraulique de ramification en petits navires, semblables à la vascularisation mammifères selon Murray Loi²³. Après DÉCELLULARISATION, réseau complexe de l’usine de navires et les pores interconnectés est maintenue. Compte tenu de la multitude d’espèces végétales distinctes disponibles, échafaudages d’origine végétale sont susceptibles de surmonter les limites de conception qui affectent actuellement les échafaudages en tissu technique^24,25. Par exemple, Modulevsky et coll. ont démontré que l’angiogenèse et la migration cellulaire s’est produite lorsque le tissu DECELLULARISE apple a été implanté par voie sous-cutanée sur le dos d’une souris²². De même, Gershlak et coll. ont montré que les cellules endothéliales pouvaient être cultivés dans le système vasculaire des feuilles DECELLULARISE²⁴. Dans une expérience distincte, Gershlak et coll. purent aussi montrer que les cardiomyocytes pourrait être cultivés sur la surface des feuilles et ont été capables de se contracter de²⁴.

Plantes comprennent également une organisation complexe de la cellulaire à l’échelle macroscopique, ce qui est difficile à réaliser même avec les techniques de fabrication les plus avancées développés à ce jour. La conception hiérarchique complexe de tissus végétaux qui les rend plus fort que la somme de leurs constituants²⁶. Les plantes possèdent une multitude de propriétés mécaniques différentes, allant des composants rigides et difficiles tels que les tiges, à celles beaucoup plus souples et malléable comme laisse²⁷. Feuilles varient selon l’espèce en termes de taille, forme, briser la force, le degré de vascularisation et peuvent transporter différents degrés de hydrophilicité. Dans l’ensemble, ces propriétés de la plante suggèrent que les plantes DECELLULARISE peuvent servir d’uniques et hautement fonctionnels des dispositifs médicaux, y compris comme des échafaudages en génie tissulaire.

Ce protocole met l’accent sur deux méthodes pour decellularize les tissus végétaux, tels que feuilles et découle, pour servir d’échafaudages en génie tissulaire. La première méthode est une technique à base de détergent qui utilise une série de bains pour supprimer ADN et matière cellulaire, qui a été adaptée d’une technique largement utilisée pour decellularize chez les mammifères et plantes tissus^{6,22,25 ,28,29,30}. La deuxième méthode est sans détergent et est une adaptation d’un protocole de « squelettisation » généralement utilisé pour enlever les tissus mous des feuilles³¹. Travaux antérieurs ont montré que faire mijoter les feuilles dans une solution d’eau de Javel et de bicarbonate de sodium facilité de séparation de la vascularisation des tissus mous environnants³¹. Cette technique peut être citée retour d’expériences menées dans le 17^ème et 18^ème siècles, tels que les travaux de Albertus Seba³² et³³de la Edward Parrish. Ces expériences centrées laissant la matière végétale, comme les feuilles et les fruits, immergé dans l’eau pendant de longues périodes de temps (semaines ou mois) et en permettant les tissus plus douces à la pourriture, naturellement. Ici, l’approche « squelettisation » est adapté pour utiliser des conditions plus clémentes, comme des périodes d’incubation plus longues à basse température, afin d’éliminer les résidus cellulaires et à éviter de perturber considérablement la structure des tissus mous. Pour les essais décrits dans les présentes, trois types de plantes ont été utilisées : Ficus hispida, Pachira aquatica et une espèce de Garcinia. Résultats de quantification ADN, essais mécaniques et impact sur l’activité métabolique cellulaire de ces deux méthodes sont décrites.

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Protocole

1. DÉCELLULARISATION de tissus de la plante à l’aide de l’approche axée sur le détergent

1. Utilisez des fraîches ou congelées F. hispida, échantillons de feuilles. Congeler des échantillons frais inutilisés dans un congélateur-20 ° C et le magasin pour une utilisation future (jusqu'à un an).
   Remarque : Utiliser des tissus tige ou feuille de presque n’importe quelle usine désirée. Durée de conservation prolongée peut endommager les tissus.
   1. Déterminer la taille et la forme des échantillons à traiter sur la base de l’utilisation prévue de l’échantillon (c'est-à-dire les échantillons coupés en lanières sont bien adaptés pour des applications de test mécaniques, en attendant les échantillons de disque de 8 mm sont utiles dans des applications de culture multipuites ). Couper la feuille en disques de 8 mm avec une biopsie forte, propre poinçon submergé sous la température ambiante (20-25 ° C) désionisée H₂O.
      Remarque : Ce protocole peut être utilisé sur les tiges et les feuilles entières. Toutefois, les échantillons plus petits seront decellularize plus vite.
   2. Incuber les échantillons pendant 5-10 min à température ambiante (20-25 ° C) désionisée H₂O sur un ensemble de plaque de secousse à un réglage de vitesse réduite à laver et/ou de les décongeler. Assez désionisée H₂O permet de s’assurer que tous les échantillons sont minutieusement mouillés.
2. Préparer une solution de 10 % (p/v) dodécylsulfate de sodium (SDS) dans désionisée H₂O. Place les échantillons dans un récipient approprié (un verre ou un plat en plastique est idéal) et ajouter la solution SDS pour couvrir complètement les échantillons. Incuber les échantillons pendant 5 jours à température ambiante (20-25 ° C) sur un shake réglé à une vitesse lente pour éviter d’endommager les échantillons.
   Remarque : Ne surchargez pas le conteneur car cela peut ralentir le processus de DÉCELLULARISATION et conduire à un traitement inégal par le SDS. Au cours de cette étape, les échantillons devraient acquérir une teinte brune.
   1. Après 5 jours, remplacez la solution SDS par désionisée H₂O. Incuber les échantillons pendant un supplémentaire 10-15 min sur la plaque de secousse à rincer soigneusement toute solution SDS résiduelle.
3. Préparer un surfactant non ionique de 1 % (v/v) dans une solution d’eau de Javel 10 % (v/v). Pour faire une solution de 500 mL, mélangez 5 mL de l’agent de surface non ioniques avec 50 mL d’eau de Javel puis ajouter 445 mL de désionisée H₂O. Submerge les échantillons dans la solution fraîchement préparée.
   Remarque : La solution de tensioactif non ionique/eau de Javel n’a pas une longue durée de vie, par conséquent, doit être utilisé dans les 48 h de préparation.
4. Remplacer la solution de tensioactif non ionique/eau de Javel toutes les 24 h, jusqu'à ce que les échantillons sont complètement effacées (voir Figure 1 a pour comparaison visuelle). Puis incuber l’échantillon dans l’eau désionisée sur une plaque de secouer pendant 2 min pour rincer la solution excès agent tensio-actif non ionique/eau de Javel. Mettre la plaque de secouer un réglage bas pour éviter d’endommager les échantillons.
   NOTE : Le temps nécessaire pour effacer les échantillons utilisés varie selon le type et l’espèce de la plante. La décoloration complète des échantillons est révélateur de DÉCELLULARISATION complet (effectuer la quantification de l’ADN afin d’assurer une compensation complète).
   1. Lyophiliser les échantillons pour les stocker jusqu'à un an (congélation à l’aide d’azote liquide flash est préféré, est également acceptable de congélation des échantillons à-80 ° C) et les stocker à température ambiante (20-25 ° C) à faible taux d’humidité.
   2. Exemples de Tris-HCl (10 mM, pH 8,5) de reconstituer en utilisant assez d’échantillons du manteau. Rincer les échantillons 2 ou 3 fois dans un milieu sans sérum délicatement à l’aide d’une micropipette avant utilisation (c.-à-d. utilisation 150 à 300 µL par rinçage, dans un plat bien 24 standard).
      NOTE : Tampon Tris-HCl et médias sans sérum (c.-à-d. DMEM, mais n’importe quelle culture de cellule de base médias peuvent être substituées) sont plus efficaces dans la réduction de l’impact sur la viabilité des cellules d’échantillons SDS traités que ceux traités avec désionisée H₂O seul.

2. préparation des échantillons à l’aide de l’approche de DÉCELLULARISATION sans tensioactifs

Remarque : Les premières étapes de cette procédure coïncident avec les étapes 1.1-1.1.2 (voir ci-dessus).

1. Préparer une solution de bicarbonate de sodium (NaHCO₃) 3 % (p/v) et de 5 % (v/v) eau de Javel (NaClO). Chauffer la solution sous une hotte à 60-70 ° C pour les échantillons de feuilles F. hispida coupée en rondelles 8 mm tout en remuant sur une plaque chauffante.
   Remarque : Le bicarbonate de sodium peut être substitué avec du carbonate de sodium (Na₂CO₃) ou d’hydroxyde de sodium (NaOH). La température varie grandement (de la température de la pièce à 90 ° C) et doit être ajustée selon les propriétés des échantillons utilisés.
2. Une fois la solution atteigne la température désirée, submerger les échantillons et réduire la vitesse d’agitation pour ne pas les endommager. Après que les échantillons sont visiblement effacées (voir Figure 1 b pour comparaison visuelle), retirer du bain avec soin. Incuber les échantillons une fois dans désionisée H₂O pendant 1-2 min enlever l’excès de Javel.
   NOTE : Le temps nécessaire pour effacer les échantillons peut varier considérablement. Par exemple, persil haché peut être effacée en 10-15 min, alors que les échantillons plus épaisses ou plus grandes, comme ensemble de feuilles ou tiges peuvent prendre des heures à haute température des bains pour effacer complètement.
3. Lyophiliser les échantillons et les stocker à température ambiante (20-25 ° C) à faible taux d’humidité.

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Résultats

Les deux méthodes ont donné des échafaudages qui convenaient pour culture cellulaire et applications en génie tissulaire. La figure 1 illustre le déroulement général du processus DÉCELLULARISATION en utilisant une feuille intacte pour la méthode à base de détergent et coupe des échantillons (diamètre 8 mm) pour la méthode sans détergent. DÉCELLULARISATION réussie des Ficus hispida tissus suivant les deux méthodes a donné des échan...

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Discussion

Ici, deux méthodes pour decellularize les tissus végétaux sont décrites. Les résultats présentés ici, couplé avec les résultats d’études antérieures²⁵, suggèrent que les protocoles mis en avant sont probables applicable à un large éventail d’espèces végétales et peuvent être effectuées sur les tiges et les feuilles. Ces procédures sont simples et ne nécessitent pas de matériel spécialisé, donc plante DÉCELLULARISATION peut être effectuée dans la plupart des laboratoi...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)	Clorox	Item #: 31009	Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate	Acros Organics	217120010	Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate	Fisher Scientific		Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker	Any		Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay	Life Technologies	P11496	Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.