Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

요약

여기에 우리가 현재, 및 대비 2 프로토콜 decellularize 식물 조직 하는 데 사용: 세제 기반 접근 및 세제 무료 접근. 두 방법 모두 다음 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 건설 기계로 활용 될 수 있습니다 사용, 식물 조직의 세포 외 매트릭스 뒤에 남겨두고.

초록

헌, 합성, 및 동물 파생 된 이식 조직 교체에 대 한 건설 기계로 현재 사용 되는 낮은 가용성, 불 쌍 한 생체 적합성 및 비용 제한이 있습니다. 식물 조직 그들이 유일 하 게 적합 상호 다공성, 기존 혈관 네트워크, 그리고 다양 한 기계 건설 기계, 높은 표면적, 우수한 물 수송 및 보존, 등으로 사용 하는 유리한 특성이 있다 속성입니다. 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 식물 decellularization의 2 개의 성공적인 방법이 여기 설명 되어 있습니다. 첫 번째 방법은 포유류 조직 취소 하는 데 사용 하는 이전 설립된 방법과 비슷합니다 세포 물질을 제거 하는 세제 목욕을 기반으로 합니다. 두 번째 잎 맥 관 구조를 격리 하 고 온수 표 백제 및 잎과 줄기를 소금 목욕의 사용을 포함 하는 프로토콜에서 적응 하는 세제 무료 방법입니다. 두 방법 모두 유사한 기계적 특성 및 낮은 세포 대사 충격, 따라서 더 나은 그들의 의도 된 응용 프로그램을 적합 한 프로토콜을 선택 하려면 사용자를 허용 건설 기계를 얻을.

서문

조직 생활을 만드는 1980 년대에 등장 하는 조직 공학 대체, 그리고 잠재적으로 주소 중요 한 장기 및 조직 부족¹. 한 전략은 자극 하 고 누락 된 조직이 나 장기를 재생성 하기 위해 시체를 안내 건설 기계를 사용 하 고. 첨단 3 차원 인쇄 생산 독특한 물리적 특성으로 건설 기계와 같은 접근을 제조, 비록 달성 물리적 및 생물학적 속성의 다양 한 범위와 건설 기계를 제조 하는 능력 유지 도전^{2 , 3}. 또한, 기능 혈관 네트워크의 부족으로 이러한 기술을 제한 되어 3 차원 조직 재생에. Decellularized 인간과 동물 조직으로 건설 기계를 사용 하 여가 문제^4,5,,67우회 주 었 있다. 그러나, 높은 비용, 일괄 배치 변화, 및 제한 된 가용성의 광범위 한 사용을 제한할 수 있습니다 decellularized 동물 투어⁸. 또한 환자에 게 잠재적인 질병 전송 및 일부 decellularized 포유류 조직⁹면역학 반응에 대 한 우려가 있다.

셀 루 로스, 식물 및 세균성 소스에서 파생 된 다양 한 응용 프로그램에 대 한 바이오 재생 의학에서 생성 하 광범위 하 게 사용 되었습니다. 몇 가지 예는 다음과 같습니다:^10,11, 연골^12,,1314 및 상처 치유¹⁵뼈. 그들은 내 구성과 저항 포유류 세포에 의해 분해 되 고 하는 룰의 구성 되어 건설 기계 추가 혜택이 있다. 이것이 사실은 포유류 세포는 셀 룰 로스 분자를 분해 하는 데 필요한 효소를 생산 하지 않습니다. 비교에서는, 건설 기계는 세포 외 기질, 콜라겐 등에서 고분자를 사용 하 여, 쉽게¹⁶ 를 세분화 생산과 장기 응용 프로그램에 적합 하지 않을 수 있습니다. 콜라겐 건설 기계 화학 cross-linking에 의해 안정 될 수 있다. 그러나, 건설 기계¹⁷의 생체 적합성에 영향을 주는 cross-linkers의 고유한 독성 때문 교환이 이다. 반대로, 셀 루 로스 통하지 포유류 세포^18,,1920효소 저하 때문에 시간의 연장된 기간에 대 한 이식의 사이트에 남아 있을 가능성이 있다. 이 가수분해 전처리를 통해 저하의 속도 cellulases²¹장비의 공동 배달을 조정 하 여 변경할 수 있습니다. Decellularized 플랜트-파생 셀 룰 로스 건설 기계에서 vivo에서 의 생체 적합성도 쥐²²연구에서 입증 되었습니다.

진화의 년의 수백만의 수백을 통해 식물의 구조와 구성의 유체 수송 및 유지의 효율성을 증가 하 정제는. 공장 혈관 혈관은 작은 혈관, 머 레이 법²³에 따르면 포유류 맥 관 구조에 유사한으로 분기 하 여 유압 저항을 최소화 합니다. Decellularization, 후 식물의 용기 및 상호 연결 된 숨 구멍의 복잡 한 네트워크 유지 됩니다. 쉽게 사용할 수 있는 고유 식물 종의 수많은 고려 건설 기계 공장에서 파생 된 현재 조직 공학^24,25건설 기계에 영향을 미치는 디자인 한계를 극복 하기 위해 가능성이 있다. 예를 들어, Modulevsky 그 외 여러분 시연 신생 및 셀 마이그레이션 decellularized 애플 조직 마우스²²의 뒤에 피하 이식 했다 때 발생. 마찬가지로, Gershlak 외. 내 피 세포 decellularized 잎²⁴의 맥 관 구조 내에서 성장 될 수 있었다 보여주었다. 별도 실험에서 Gershlak 그 외 여러분 또한 cardiomyocytes 잎의 표면에 성장 수와²⁴계약 수를 보여줄 수 있었다.

식물은 또한 현재까지 개발 된 가장 진보 된 제조 기법으로도 달성 하기 어려운 거시적인 규모에 복잡 한 조직 세포에서 포함 됩니다. 식물 조직의 복잡 한 계층 구조 디자인은 그들이 그들의 성분²⁶의 합계 보다 더 강한 합니다. 식물 줄기 등 견고 하 고 힘든 구성에서 배열 하는 다른 기계적 특성의 과다 보유와 같은 훨씬 더 유연 하 고 유연한 것²⁷를 나뭇잎. 잎 크기 면에서 종에 따라 다릅니다, 그리고 모양, 강도, vascularization, 정도 휴식 및 화란의 다른 학위를가지고 있습니다. 전반적으로, 이러한 식물 속성 decellularized 식물 독특하고 대단히 기능적인 의료 기기, 건설 기계 엔지니어링 조직 등으로 사용할 수 있습니다 것이 좋습니다.

이 프로토콜 decellularize 식물 조직에 두 가지 방법에 초점을 맞추고와 같은 고 조직 공학에서 공중 발판으로 사용 하기 위해 유래한 다. 첫 번째 방법은 DNA와 포유류 decellularize 조직^{6,22,25 식물에 널리 사용 되는 기술에서 적응 되어 세포 물질을 제거 하는 일련의를 사용 하는 세제 기반 기술 ,,2829,30}. 두 번째 방법은 세제 무료 이며 일반적으로 나뭇잎³¹의 부드러운 조직을 제거 하는 데 사용 하는 "skeletonization" 프로토콜에서 적응 됩니다. 이전 작업 그 주변의 부드러운 조직³¹는 맥 관 구조 분리를 촉진 표 백제와 나트륨 중 탄산염 해결책에서 잎을 끓인 것을 보여주었다. 이 기술은 17^번째 및 18^번째 세기 Albertus Seba³² 및³³에드워드 패 리 쉬 작품 등에서 실시 하는 실험을 다시 인용 될 수 있다. 이러한 실험을 중심으로 잎과 과일, 같은 공장 문제를 떠나 장기간 물에 잠긴 (달 주) 시간과 수 있도록 자연스럽 게 멀리 부패 부드러운 조직. 여기 "skeletonization" 접근은 셀룰러 잔류물을 제거 하 고 부드러운 조직 구조를 크게 방해 하지 않도록 낮은 온도에서 더 이상 보육 시간 등 온화한 조건, 사용에 적응 됩니다. 여기 자세한 실험에 대 한 3 개의 식물 종류 사용 되었다: 무화과나무 hispida, Pachira aquatica 및 필리핀의 종. DNA 정량화, 기계적 테스트, 그리고 두 방법 모두에서 세포 대사 활동에 미치는 영향의 결과 설명 합니다.

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프로토콜

1. 식물 조직 세제 기반 접근을 사용 하 여 decellularization

1. 신선 또는 냉동 F. hispida, 잎 샘플을 사용 합니다. -20 ° C 냉동 고 (최대 1 년) 나중에 사용에 대 한 저장소에서 사용 되지 않는 신선한 샘플을 동결.
   참고: 거의 모든 원하는 식물의 줄기 나 잎 조직을 사용 합니다. 확장된 저장 시간은 조직에 손상을 일으킬 수 있습니다.
   1. 샘플의 용도 기준으로 하 여 처리 하는 샘플의 형태와 크기를 결정 (즉, 샘플 스트립으로 잘라 기계적 테스트 응용 프로그램에 대 한 적합, 한편 8 m m 디스크 샘플 다 잘 자란 응용 프로그램에 유용 ). 잘라 잎 8 m m 디스크 날카로운, 깨끗 한 생 검 펀치 실내 온도 (20-25 ° C) 이온된 H₂o. 잠수 하는 동안
      참고: 전체 잎과 줄기에는이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 그러나, 작은 샘플은 빨리 decellularize 것입니다.
   2. 실내 온도 (20-25 ° C) 이온된 H₂O 세척 및 그들을 녹여 낮은 속도 설정 흔들 플레이트 세트에 5-10 분에 대 한 샘플을 품 어. 충분히 이온된 h 조₂O를 사용 하 여 모든 샘플은 철저 하 게 침수 되도록.
2. 10% (w/v) 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 이온된 H₂o. 장소에서에서의 솔루션 (유리 또는 플라스틱 접시 이상적 이다) 적합 한 컨테이너에 샘플을 준비 하 고 SDS 솔루션 샘플 표지를 추가. 손상을 방지 하기 위해 샘플에 낮은 속도를 흔들 플레이트 세트에 실내 온도 (20-25 ° C)에서 5 일에 대 한 샘플을 품 어.
   참고:이 decellularization 과정을 감속 하 고 SDS에 의해 고르지 치료 이어질 수 컨테이너를 혼잡 하지 않습니다. 이 단계 동안 샘플 갈색 색조를 취득 해야 합니다.
   1. 5 일 후 바꿉니다 SDS 솔루션 이온된 H₂o. 품 어떤 잔여 SDS 솔루션을 철저 하 게 씻어을 흔들어 접시에 추가 10-15 분에 대 한 샘플을.
3. 10% (v/v) 표 백제 솔루션에서 1% (v/v) 비 이온 계면 활성 제를 준비 합니다. 500 mL 솔루션, 백제의 50 mL와 5 mL의 비 이온 계면 활성 제를 혼합 후 이온 H₂o. Submerge 445 mL을 추가 갓된 솔루션에서 샘플링 합니다.
   참고: 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션 없는 긴 수명, 따라서, 준비의 48 h 사용할 수 있습니다.
4. 샘플은 완전히 지워질 때까지 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션 마다 24 h를 교체 (시각적 비교를 위해 그림 1A 참조). 다음 씻어 초과 비 이온 계면 활성 제/표 백제 솔루션을 2 분 동안 흔들어 접시에 이온된 수에 샘플을 품 어. 흔들어 접시 샘플을 손상을 방지 하기 위해 낮은 설정으로 설정 합니다.
   참고: 샘플 사용의 선택을 취소 하는 데 필요한 시간 따라 달라 집니다, 유형 및 식물의 종. 전체 decellularization의이 샘플의 완전 한 변색 (철저 한 청소를 보장 하기 위해 DNA 정량화를 수행).
   1. 년까지 그들을 저장 하는 샘플을 lyophilize (플래시 동결 액체 질소를 사용 하 여 선호,-80 ° C에서 샘플을 동결 하 셔도 됩니다) 실내 온도 (20-25 ° C) 낮은 습도에 그들을 저장 하 고.
   2. Tris HCl (10 m m, pH 8.5)에서 샘플을 다시 구성 하기 충분히 코트 샘플을 사용 하 여. 혈 청 무료 미디어 사용 (린스, 표준 24 잘 접시에서 당즉 사용 150-300 µ L) 하기 전에 micropipette를 사용 하 여 부드럽게 2-3 번 샘플 린스.
      참고: Tris HCl 버퍼 및 혈 청 무료 미디어 (즉 DMEM, 그러나 어떤 기본적인 세포 배양 매체를 대체할 수) 낮추는 이온 H₂O 혼자 치료 보다 SDS 처리 샘플의 세포 생존 능력에 대 한 영향에 더 효과적입니다.

2. 세제 무료 Decellularization 접근을 사용 하 여 샘플의 준비

참고:이 절차의 초기 단계 일치 단계 1.1-1.1.2 (위 참조).

1. 5% (v/v) 표 백제 (NaClO)와 3% (w/v) 나트륨 중 탄산염 (NaHCO₃) 솔루션을 준비 합니다. F. hispida 잎 샘플 잘라 뜨거운 접시에 감동 하면서 8 m m 디스크에 대 한 60-70 ° C에 증기 두건에서 솔루션을 따뜻한.
   참고: 중 탄산 나트륨 탄산 나트륨 (Na₂CO₃), 또는 수산화 나트륨 (NaOH)로 교체하실 수 있습니다. 원하는 온도 크게 (90 ° C로 실 온)에서 변화 하 고 사용 하는 샘플의 속성에 따라 조정 되어야 한다.
2. 솔루션에는 원하는 온도 도달 하면, 일단 샘플 잠수함 하 고 그들을 손상 되지 않도록 교 반 속도 줄일 수 있습니다. 후 샘플 지워집니다 가시 (참조 그림 1B 시각적 비교를 위해), 목욕에서 신중 하 게 제거. 이온된 H₂O 초과 표 백제 솔루션을 제거 하려면 1-2 분에 한 번 샘플을 품 어.
   참고: 샘플을 취소 하는 데 필요한 시간이 달라질 수 있습니다. 예를 들어 전체 잎 또는 줄기 완전히 취소 하 고 열 탕에 시간이 걸릴 수 있습니다와 같은 컷된 파 슬 리 10-15 분, 두꺼운 또는 더 큰 샘플 동안에 지울 수 있습니다.
3. 샘플을 lyophilize 하 고 실내 온도 (20-25 ° C) 낮은 습도에 그들을 저장 합니다.

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결과

두 방법 모두 굴복 건설 기계 세포 배양 및 조직 엔지니어링 응용 프로그램에 적합 했다. 그림 1 세제 기반 메서드와 세제 없는 메서드에 대 한 컷된 샘플 (8 m m 직경)에 그대로 잎을 사용 하 여 decellularization 프로세스의 일반적인 워크플로 보여 줍니다. 무화과나무 hispida 조직 두 방법 모두 다음의 성공적인 decellularization 나왔고 명확 하 고 그대?...

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토론

여기, decellularize 식물 조직에 두 가지 방법은 설명 합니다. 여기, 결과 나온 프로토콜 가능성이 있다는 제안²⁵, 이전 연구 결과 함께 결합의 광범위에 적용 가능한 종 식물, 줄기와 잎에서 수행할 수 있습니다. 이 절차는 간단 하 고 공장 decellularization 대부분 실험실에서 실행 될 수 있다 그래서 전문된 장비를 필요 하지 않습니다. 그것은 주목할 만한 그 decellularization, 후에 건설 기?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma Life Science	75746-1KG
Triton X-100	MP Biomedicals, LLC	807426	Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up.
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite)	Clorox	Item #: 31009	Standard concentrated bleach.
Sodium bicarbonate	Acros Organics	217120010	Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate.
8 mm Biopunch	HealthLink	15111-80	Cuts samples that fit well in 24 well plate
Belly Dancer-Shake table	Stovall Life Sciences	BDRAA115S	Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table.
Isotemp hot/stir plate	Fisher Scientific		Can use any style/brand of hot/stir plate.
Beaker	Any		Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them.
Tris Hydrochloride	Fisher Scientific	BP153-500
DMEM	Corning	MT50003PC
Quant-iT Picogreen dsDNA assay	Life Technologies	P11496	Can use any dsDNA quantification mehtod on hand.