Murino colostomía Distal, un modelo novedoso de desvío Colitis en ratones C57BL/6

Resumen

Murino colostomía distal proporciona un modelo murino para la colitis de la diversión humana, una colitis linfocítica predominante en el segmento de colon excluido de la corriente fecal.

Resumen

Desviación (DC) es una condición clínica frecuente que ocurre en pacientes con segmentos de intestino excluidos de la corriente fecal como resultado de una enterostomía desviar. La etiología de esta enfermedad sigue siendo mal definida pero parece diferir de la de enfermedades de intestino inflamatorias clásicas tales como la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. Investigaciones encaminadas a descifrar los mecanismos fisiopatológicos principales en el desarrollo de esta enfermedad ha sido gravemente obstaculizado por la falta de un modelo murino. Este protocolo genera un modelo murino de DC que facilita el estudio del papel del sistema inmune y su interacción con el microbioma en el desarrollo de CC. En este modelo utilizando animales C57BL/6, parte distal del colon se excluye de la corriente fecal al crear una colostomía distal, provocando el desarrollo de leve a moderada inflamación en el segmento intestinal excluido y reproducir las lesiones característica distintiva del ser humano DC con una moderada respuesta inflamatoria sistémica. En contraste con el modelo de la rata, hay un gran número de modelos murinos genéticamente en el fondo de C57BL/6. La combinación de estos animales con nuestro modelo permite que las funciones potenciales de individuales citoquinas, quimiocinas y receptores de moléculas bioactivas (e.g., interleukin (IL) -17; IL-10, chemokine CXCL13, chemokine receptores CXCR5 y CCR7 y el receptor de la esfingosina-1-fosfato 4) a evaluarse en la patogenesia de DC. La disponibilidad de tensiones congenic ratón C57BL/6 fondo facilita en gran medida transferencia experimentos para establecer los roles de distintos tipos de células involucrados en la etiología de DC. Finalmente, el modelo ofrece la oportunidad de evaluar la influencia de las intervenciones locales (p. ej., modificación del microbioma local o terapia antiinflamatoria local) de inmunidad mucosa en los segmentos intestinales afectados y no afectados y en homeostasis inmune sistémica.

Introducción

En los últimos años, un número considerable de entidades colitis no infecciosa diferentes de las enfermedades clásicas inflamatorias intestinales (EII; ej., enfermedad enfermedad o colitis de Crohn) han caracterizado clínico e histopathologically en seres humanos. Los mecanismos fisiopatológicos principales en el desarrollo de estas formas de colitis no se entienden completamente parcialmente porque son escasos los modelos animales apropiados. Colitis de la diversión es una de estas entidades recientemente descritas. Aunque el término fue acuñado en 1980 por Glotzer¹, la descripción inicial de un fenotipo similar fue dada en 1972 por Morson². La enfermedad se desarrolla en el 50% al 91% de los pacientes con desvío de enterostomía, y su intensidad clínica varía de^3,4. Dada la incidencia anual de alrededor de 120.000 pacientes de colostomía en los Estados Unidos de América, esta entidad de la enfermedad constituye un importante problema de salud.

El objetivo general de desarrollar este protocolo era proporcionar un modelo murino de DC que se apoya en un disparador de colitis similar a ése visto en DC humana y que reproduce las principales características histopatológicas de la enfermedad humana. En contraste con otros modelos de colitis murino la inducción de colitis en nuestro modelo no requiere de animales genéticamente modificados (p. ej., ratones transgénicos IL-7, N-cadherin dominante negativo ratones o ratones TGFβ^{- / -} ), la aplicación de la química irritantes sustancias (p. ej., sulfato de dextrano sódico (DSS) - colitis inducida o ácido de trinitrobenceno sulfónico (TNBS) - inducida por colitis) o la transferencia de poblaciones celulares específicas en ratones deficientes inmunes (como en la transferencia^alta CD45RB modelo de colitis) (para una revisión, véase⁵). En contraste con otros modelos, el sistema inmune intacto nuestro modelo DC permite la evaluación del mecanismo inmunológico involucrado en el desarrollo de CC. La limitación de la inflamación mucosa al segmento intestinal excluido permite la evaluación de su repercusión sobre la inmunidad mucosa en otras partes del tracto gastrointestinal en la homeostasis inmune en otros compartimentos inmunes del tracto intestinal (p. ej. , Parches de Peyer y ganglios mesenteriale) y en la homeostasis inmune de todo el organismo. Por último, nuestro modelo constituye una herramienta apropiada para investigar los mecanismos de control de estímulos inflamatorios locales origina cambios en el ambiente local normal para el microbioma local, así como antígenos alimentarios.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la autoridad veterinaria (Landesamt für Landwirtschaft, und Lebensmittelsicherheit Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, LALLF M-V).

1. preoperatorio cuidado y preparación del Animal

1. A su llegada a las instalaciones de animales, animales (C57Bl/6) se dividen en grupos de tamaño similar, jaula a cada grupo juntos y mantener constante a lo largo de los experimentos de los grupos.
   Nota: Utilizar animales del mismo sexo. Los resultados descritos se obtuvieron con ratones machos.
   Nota: Si se utilizan machos, grupos de jaula juntos a partir de cuando tienen 7 semanas de edad para que pueda establecerse una jerarquía, minimizando así el riesgo de comportamiento agresivo durante los experimentos.
2. Por lo menos una semana antes de la cirugía, cambiar a una alta energía (> 14 MJ/kg) y alta en proteínas (> 20%) de la alimentación que contiene todos los oligoelementos esenciales y vitaminas (para detalles, ver lista de materiales).
   Nota: Asegure todos los ratones pesan al menos 25 g cuando se realiza la cirugía.
3. Inducir analgesia y la anestesia por inyección intraperitoneal de ketamina (87 mg/kg i.p.) y el clorhidrato de xilacina (13 mg/kg i.p.). Espere hasta que el ratón tolera la estimulación mecánica, por ejemplo campo de dedo del pie, sin respuesta de motor.
4. Asegure el ratón narcotizado con cintas en una posición supina sobre una arpillera de calor colocado en la mesa de operación, garantizando la colocación durante la operación estable y evitando una abrumadora pérdida de calor corporal.
   Nota: La arpillera de calor debe tener una temperatura de 36 ° C a 40 ° C; la temperatura de la sala de operaciones debe ser de 21 ° C.

2. distal de la colostomía operación

1. Afeitarse el vello abdominal. Antes de comenzar la cirugía, desinfectar el campo de la operación tres veces con alcohol 70% y un yodóforo. Cubra el campo de la operación para garantizar condiciones asépticas.
2. Realizar una laparotomía mediana 15 mm mediante la incisión de los músculos abdominales y el peritoneo a lo largo de la linea alba, minimizando así la pérdida de sangre.
3. Utilizar dos pinzas atraumáticas de DeBakey, tire con cuidado hacia el ciego, íleon terminal y el ascendente y el colon transverso de la cavidad peritoneal.
   Nota: Tenga cuidado de limitar estrictamente la manipulación mecánica del intestino para evitar daños a las estructuras mesentéricas.
4. Identificar el polo cecal, el colon ascendente y el intestino (Figuras 1a y 1b).
   Nota: La correcta identificación de los dos puntos ascendentes es fundamental para la correcta colocación de la colostomía. En casos donde la anatomía de la región ileocecal es ambigua, identifica a la presencia de placas de Peyer del intestino, y la presencia de heces formadas caracteriza el colon.
5. Use una regla para determinar la posición de la futura operación del intestino grueso. Se debe colocar 20 mm distal a la válvula ileocecal para una colostomía distal.
6. Hacer una segunda incisión de 3 mm en la pared abdominal en el cuadrante superior derecho. Tire el segmento de colon previamente identificadas a través de esta incisión para formar un círculo, teniendo cuidado de no distorsionar el bucle.
7. Pasar con cuidado una cánula i.v. flexible calibre 22 a través del mesocolon. Tenga cuidado para no dañar estructuras vasculares mesentéricas.
8. Devolver el intestino a la cavidad peritoneal.
9. Fijar ambos extremos del tubo flexible a la piel con puntos simples y sutura reabsorbible (p. ej., polyglactin 910 o polyfil 4-0 1/2 c).
10. Antes de cerrar la laparotomía, realice reanimación con líquidos usando una inyección intraperitoneal de solución salina al de 0.9% 0,5 mL.
11. Cierre del peritoneo y la capa muscular con una sutura continua usando una sutura reabsorbible (p. ej., polyglactin 910 o polyfil 4-0 1/2 c). Cierre la piel con una sutura continua usando una sutura reabsorbible (p. ej., polyglactin 910 o polyfil 4-0 1 / 2c).
12. Abrir el bucle de colon exteriorizado mediante la realización de un corte transversal subtotal con una tijera fina. Evitar toda lesión del mesenterio. Transecto no el colon completamente.
13. Fijar cada abertura de colostomía con tres puntadas de espesor total solo al peritoneo y la piel con un monofilamento, suturas absorbibles (p. ej., Polidioxanona o monofilamento 6-0 3/8s). El aferente del lazo, que es una colostomía de final funcional, y el lazo eferente, que es una fístula mucosa, se separan claramente en este punto (figura 1C).
    Nota: Tiempo de operación debe ser menos de 20 minutos para limitar las pérdidas de fluidos y térmicas.
14. Después de terminar la cirugía, desinfectar instrumentos usando una solución de desinfectante libre de aldehídos en un baño de ultrasonidos según las instrucciones del fabricante.

3. simulacro de operación (Colotomy)

1. Realice los pasos 1.1. a través de 2.4.
2. Utilice una regla para determinar la posición de futuros colotomy. El colotomy debe colocarse a la misma distancia de la válvula ileocecal que la colostomía en el grupo experimental.
3. Abra el colon por lo menos dos tercios su circunferencia usando las tijeras finas.
4. Cierre colotomy con una sola capa, espesor total interrumpido con un monofilamento, absorbible sutura sutura (por ejemplo, polydioxanone, monofilamento 6-0 3/8s).
   Nota: Tiempo de operación debe ser menos de 20 minutos para un cirujano experimentado, limitando las pérdidas de fluidos y térmicas.
5. Realice los pasos 2.10. , 2.11. y 2.14.

4. posoperatorio cuidado

1. Devolver los animales a sus jaulas. Bien templado el ambiente de 37 ° C (por ejemplo, con una lámpara infrarroja) hasta que los ratones son totalmente despiertos. A continuación, mantenga ratones en un ambiente de temperatura y Humedad reguladas (21 ° C; humedad relativa de 30% ± 10%). Permitir el libre acceso a alimentos y agua potable. Para facilitar la absorción de líquidos, proporcionar alimentación animal empapado de agua adicional.
2. Inicio de la analgesia postoperatoria mediante la inyección de 0,1 mg/kg corporal peso buprenorfina s.c. cuando los animales muestran respuesta a la estimulación mecánica. Tenga cuidado para evitar depresión respiratoria.
3. Suplemento de agua potable con tramadol 1 mg/mL para analgesia continua durante la primera semana postoperatoria.
4. Para compensar la ingesta disminuida de líquidos debido a movilidad reducida, suministrar un cojín sólido de beber en la jaula durante la primera semana postoperatoria.
5. Pesan los animales y el comportamiento animal puntuación diariamente durante la primera semana, cada dos días durante el resto del primer mes y cada tercer día durante el segundo mes el score de severidad de la enfermedad descrito en Kleinwort et al. ⁶.

Resultados

La cirugía se tolera bien tanto en los grupos de sham (colotomy) y experimental (colostomía). Mortalidad perioperatoria no debe superar el 10% cuando se realiza correctamente la cirugía y perioperative management. En la primera semana postoperatoria, pérdida de peso significativa se observa en los grupos experimentales y simulados. Animales del grupo impostor alcanzan su nadir de peso normalmente hacia el cuarto día postoperatorio, pero se da un día más tarde en el grupo experiment...

Discusión

El modelo murino de DC presentada en este protocolo fiable reproduce las características histopatológicas de DC humana (p. ej., desarrollo de novo de los folículos linfoides en la submucosa de segmentos de intestino inflamado, cripta acortamiento y reducción de número de células caliciformes). Aparte de esta ventaja, este modelo es inducida por un factor desencadenante muy similar y presenta un curso clínico de moderado a leve gravedad como es el caso de los seres humanos más afectados.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt	ThermoLux, Witte + Sutor GmbH	461265
Ethanol 70% (with methylethylketon)	Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length	Centramed GmbH, Germany	8308370	for disinfection of operation field
Scissor	Aesculap (BRAUN)	BC064R
Atraumatic DeBakey forceps	Aesculap (BRAUN)	OC021R
Needle holder	Aesculap (BRAUN)	BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G	Braun Melsungen AG, Germany	4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm	ETHICON, Inc.	VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm	ETHICON, Inc.	Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior)	BD Medical	305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin)	ANTISEPTICA, Germany	18824-01	disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	9089.01.00	87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	400300.00.00	13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9%	Braun Melsungen AG, Germany	6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine)	Bayer, Germany	PZN: 01498870	0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride)	Grünenthal GmbH, Germany	10116838	1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)	Cephasaar GmbH, Germany	PZN: 08844252	25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL	Braun Melsungen AG, Germany	PZN: 05543515	12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich	ssniff, Germany	V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches	TripleATrading, the Netherlands	SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L	Nikon Instruments Europe BV, Germany		light microscopy
VetScan HM 5	Abaxis, USA	770-9000	Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath)	Bandelin electronics, Germany	RK 100 H	disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software	Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6	GraphPad Software, Inc.