Murino colostomia Distal, um novo modelo de colite de diversão em camundongos C57BL/6

Resumo

Murino colostomia distal fornece um modelo murino para colite de diversão humana, uma colite linfocítica predominantemente no segmento de cólon excluído do fluxo fecal.

Resumo

Colite de diversão (DC) é uma condição clínica frequente, ocorrendo em pacientes com segmentos intestinais excluídos o fluxo fecal como resultado de um desvio enterostomy. A etiologia desta doença permanece mal definida mas parece diferir da clássica Enteropatias inflamatórias tais como a doença de Crohn e colite ulcerativa. Pesquisa teve como objetivo decifrar os mecanismos fisiopatológicos, levando ao desenvolvimento desta doença tem sido severamente dificultada pela falta de um adequado modelo murino. Este protocolo gera um modelo murino de DC que facilita o estudo da função do sistema imunológico e sua interação com o microbiome no desenvolvimento da DC. Nesse modelo, usando animais C57BL/6, partes distais do cólon são excluídas do fluxo fecal, criando uma colostomia distal, provocando o desenvolvimento de leve a moderada inflamação nos segmentos excluídos do intestino e reproduzindo as lesões de marca registrada do ser humano DC com uma resposta inflamatória sistêmica moderada. Em contraste com o modelo de rato, um grande número de modelos de murino geneticamente modificados no fundo C57BL/6 está disponível. A combinação destes animais com o nosso modelo permite que as funções potenciais de individuais citocinas, quimiocinas ou receptores de moléculas bioativas (por exemplo, interleucina (IL) -17; Il-10, chemokine CXCL13, chemokine receptores CXCR5 e CCR7 e o receptor de esfingosina-1-fosfato 4) para ser avaliado na patogénese da DC. Em grande parte a disponibilidade de cepas de congenic do mouse sobre o fundo de C57BL/6 facilita a transferência de experiências para estabelecer os papéis de tipos de células distintas envolvidos na etiologia da DC. Finalmente, o modelo oferece a oportunidade de avaliar as influências de intervenções locais (por exemplo, modificação do local microbiome ou terapia anti-inflamatória local) sobre imunidade mucosal em segmentos intestinais afetados e não afetados e na homeostase imune sistêmica.

Introdução

Nos últimos anos, um número substancial de colite não-infecciosas entidades diferentes de doenças clássica inflamatória intestinal (IBD; i. e., ulcerosa de Crohn doença ou colite) tem sido clinicamente e histopatologicamente caracterizada em seres humanos. Os mecanismos fisiopatológicos, levando ao desenvolvimento destas formas de colite não são completamente compreendidos parcialmente, porque os modelos animais apropriados são escassos. Colite de diversão é uma dessas entidades recentemente descritas. Embora o termo foi inventado em 1980 por Glotzer¹, a descrição inicial de um fenótipo semelhante foi dada em 1972 por Morson². A doença se desenvolve em 50% a 91% dos pacientes com desvio de enterostomy, e sua intensidade clínica varia de^3,4. Tendo em conta a incidência anual de cerca de 120.000 pacientes de colostomia em Estados Unidos da América, esta entidade de doença constitui um importante problema de saúde.

O objetivo geral de desenvolver este protocolo foi fornecer um modelo murino de DC que se baseia em um gatilho de colite semelhante ao observado em humano DC e que reproduz as características histopatológicas primárias da doença humana. Em contraste com outros modelos de colite murino, indução de colite em nosso modelo não requer animais geneticamente modificados (por exemplo, ratos transgénicos de IL-7, caderina N dominante negativos ratos ou camundongos TGFβ^{- / -} ), o aplicativo de quimicamente irritante de substâncias (por exemplo, dextrano sulfato de sódio (DSS) - colite induzida, ou trinitrobenzeno sulfônico (neutrófilos) - induzido colite), ou a transferência de populações de células específicos em camundongos deficientes imunes (como a transferência de^alta CD45RB modelo de colite) (para uma revisão, ver⁵). Em contraste com outros modelos, o sistema imunológico intacto do nosso modelo DC permite avaliação do mecanismo imunológico envolvido no desenvolvimento da DC. A limitação de inflamação da mucosa do segmento intestinal excluído permite a avaliação de sua repercussão na imunidade da mucosa em outras partes do trato gastrintestinal, sobre a homeostase imune em outros compartimentos imunes do trato intestinal (por exemplo, , Do Peyer patches e mesenteriale dos gânglios linfáticos) e sobre a homeostase imune de todo o organismo. Finalmente, o nosso modelo constitui um instrumento apropriado para investigar os mecanismos de controlo locais estímulos inflamatórios provenientes de alterações no ambiente local normal para o local microbiome tanto antígenos alimentares.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela autoridade veterinária do governo (turismo für Landwirtschaft, und Lebensmittelsicherheit Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, (LALLF M-V)).

1. pré-operatório cuidados e preparação do Animal

1. Após a chegada na instalação de animais, dividir os animais (C57Bl/6) em grupos de tamanho similar, cada grupo da gaiola juntos e manter grupos constante em todas as experiências.
   Nota: Use animais do mesmo sexo. Os resultados descritos foram obtidos com ratos masculinos.
   Nota: Se animais machos são usados, começando juntos quando eles são 7 semanas de idade, para que possa estabelecer-se uma hierarquia de grupos de gaiola, minimizando assim o risco de comportamento agressivo durante as experiências.
2. Pelo menos uma semana antes da cirurgia, alternar para uma alta energia (> 14 MJ/kg) e rica em proteínas (> 20%) alimentar contendo todos os oligoelementos essenciais e vitaminas (para obter detalhes, consulte lista de materiais).
   Nota: Assegurar todos os ratos pesar pelo menos 25 g quando a cirurgia é realizada.
3. Induzi a anestesia e analgesia pela injeção intraperitoneal de cetamina (87 mg/kg, i.p.) e cloridrato de xilazina (13 mg/kg, i.p.). Espere até que o mouse tolera estimulação mecânica, por exemplo, arremesso de dedo do pé, sem resposta motora.
4. Prenda o mouse seguiram com fitas na posição supina sobre uma subjacência de calor posicionada a mesa de operação, garantindo o posicionamento durante a operação estável e evitando uma esmagadora perda de calor do corpo.
   Nota: A subjacência de calor deve ter uma temperatura de superfície de 36 ° C a 40 ° C; a temperatura de operação deve ser de 21 ° C.

2. distal colostomia operação

1. Raspe o cabelo abdominal. Antes de iniciar a cirurgia, desinfecte o campo de operação três vezes, utilizando álcool 70% e um Iodofor. Cubra o campo de operação, a garantia de condições assépticas.
2. Realizar uma laparotomia mediana de 15 mm por incisão da musculatura abdominal e o peritônio ao longo da linea alba, minimizando assim a perda de sangue.
3. Use dois DeBakey atraumática pinça, puxe cuidadosamente o ceco, íleo terminal e ascendente e o cólon transverso da cavidade peritoneal.
   Nota: Tenha cuidado para limitar estritamente a manipulação mecânica do intestino para evitar danos às estruturas mesentéricas.
4. Identifica o polo cecal, o cólon ascendente e intestino delgado (figuras 1a e 1b).
   Nota: A identificação correta do cólon ascendente é fundamental para colocação da colostomia. Em casos onde a anatomia da região ileocecal é ambígua, a presença de Peyer identifica o intestino delgado, e a presença de fezes formadas caracteriza o cólon.
5. Use uma régua para determinar a posição da futuro da colostomia. Ele deve ser colocado 20mm distal à válvula ileocecal para uma colostomia distal.
6. Efectue uma segunda incisão de 3 mm na parede abdominal no quadrante superior direito. Puxe o segmento de cólon anteriormente identificados através desta incisão para formar um loop, tomando cuidado para não distorcer o loop.
7. Passe cuidadosamente uma cânula de calibre 22 i.v. flexível através do mésocôlon. Tome cuidado para não danificar estruturas vasculares mesentéricas.
8. Retorno do intestino para a cavidade peritoneal.
9. Corrigi as duas extremidades do tubo flexível para a pele com pontos simples e uma sutura absorvível (por exemplo, Poliglactina 910 ou fibras c de 1/2 de 4-0).
10. Antes de fechar a laparotomia, realizar ressuscitação com fluidos usando uma injeção intraperitoneal de soro fisiológico a 0,9% 0,5 mL.
11. Feche o peritônio e a camada muscular com uma sutura contínua usando uma sutura absorvível (por exemplo, Poliglactina 910 ou fibras c de 1/2 de 4-0). Feche a pele com uma sutura contínua usando uma sutura absorvível (por exemplo, Poliglactina 910 ou fibras c de 1/2 de 4-0).
12. Abra o loop exteriorização do cólon através da realização de uma transecção subtotal usando uma tesoura bem. Evite todos os ferimentos para o mesentério. Não transecto completamente o cólon.
13. Corrigir a cada abertura da colostomia usando três pontos único da cheio-espessura no peritônio e pele usando um monofil, sutura absorvível (por exemplo, polydioxanone ou monofil 3 de 6-0/8s). O loop aferente, que é uma final-colostomia funcional, e o loop eferente, que é uma fístula mucosa, sejam claramente separadas neste momento (Figura 1C).
    Nota: O tempo de operação deve ser menos de 20 minutos para limitar as perdas térmicas e fluidas.
14. Após terminar a cirurgia, desinfectar instrumentos usando uma solução de desinfecção aldeído livre em um banho ultra-sônico de acordo com as instruções do fabricante.

3. operação sham (Colotomy)

1. Execute as etapas 1.1. através de 2.4.
2. Use uma régua para determinar a posição de futuros colotomy. O colotomy deve ser posicionado à mesma distância da válvula ileocecal como a colostomia no grupo experimental.
3. Abra o cólon pelo menos dois terços sua circunferência usando tesouras bem.
4. Fechar o colotomy com uma única camada, espessura total interrompido sutura usando um monofil, sutura absorvível (por exemplo, polydioxanone, monofil 3 de 6-0/8s).
   Nota: O tempo de operação deve ser menos de 20 minutos para um cirurgião tarimbado, limitando perdas térmicas e fluidas.
5. Execute os passos 2.10. , 2.11. e 2.14.

4. pós-operatório cuidados

1. Retorno de animais de suas gaiolas. Proporcionam um ambiente bem temperado de 37 ° C (por exemplo, com uma lâmpada infravermelha) até que os ratos são totalmente acordados. Em seguida, manter os ratos em um ambiente de temperatura e umidade-regulamentados (21 ° C; 30% ± 10% umidade relativa). Permita o livre acesso à comida e água potável. Para facilitar a penetração de fluidos, fornecem adicional ensopados de água alimentação animal.
2. Iniciar analgesia pós-operatória injetando buprenorfina de peso de corpo de 0,1 mg/kg s.c. quando animais mostram resposta à estimulação mecânica. Tenha cuidado para evitar a depressão respiratória.
3. Suplemento de água potável com tramadol 1mg/mL para analgesia contínua durante a primeira semana pós-operatória.
4. Para compensar a diminuição da ingestão de líquidos devido à mobilidade reduzida, fornecer um bloco sólido beber na gaiola durante a primeira semana pós-operatória.
5. Pesar os animais e o escore de comportamento animal diariamente durante a primeira semana, em dois dias durante o restante do primeiro mês e a cada três dias durante o segundo mês usando o escore de severidade de doença descrito em Kleinwort et al ⁶.

Resultados

Cirurgia é bem tolerada no experimental (colostomia) e grupos de Souza (colotomy). Mortalidade perioperatória não deve exceder 10%, quando a gestão de cirurgia e perioperatório é executada corretamente. Na primeira semana pós-operatória, perda de peso significativa é vista em ambos os grupos, experimentais e sham. Animais do grupo farsa atingir seu nadir de peso, geralmente em direção ao quarto dia de pós-operatório, mas ocorre um dia depois no grupo experimental. Perda de pe...

Discussão

O modelo murino de DC apresentado neste protocolo confiável reproduz as características histopatológicas de DC humana (por exemplo, de novo desenvolvimento de folículos linfoides da submucosa de segmentos intestinais inflamados, cripta encurtamento e reduções em número de células de Goblet). Além desta vantagem, este modelo é induzido por um fator desencadeante muito semelhante e apresenta-se com um curso clínico de moderada a leve gravidade como é o caso em humanos mais afetados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt	ThermoLux, Witte + Sutor GmbH	461265
Ethanol 70% (with methylethylketon)	Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length	Centramed GmbH, Germany	8308370	for disinfection of operation field
Scissor	Aesculap (BRAUN)	BC064R
Atraumatic DeBakey forceps	Aesculap (BRAUN)	OC021R
Needle holder	Aesculap (BRAUN)	BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G	Braun Melsungen AG, Germany	4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm	ETHICON, Inc.	VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm	ETHICON, Inc.	Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior)	BD Medical	305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin)	ANTISEPTICA, Germany	18824-01	disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	9089.01.00	87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	400300.00.00	13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9%	Braun Melsungen AG, Germany	6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine)	Bayer, Germany	PZN: 01498870	0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride)	Grünenthal GmbH, Germany	10116838	1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)	Cephasaar GmbH, Germany	PZN: 08844252	25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL	Braun Melsungen AG, Germany	PZN: 05543515	12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich	ssniff, Germany	V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches	TripleATrading, the Netherlands	SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L	Nikon Instruments Europe BV, Germany		light microscopy
VetScan HM 5	Abaxis, USA	770-9000	Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath)	Bandelin electronics, Germany	RK 100 H	disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software	Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6	GraphPad Software, Inc.