小鼠远端结肠造口术, 一种新的 C57BL/6 老鼠转移性结肠炎模型

摘要

小鼠远端结肠造口为人分流型结肠炎提供了鼠模型, 一种主要的淋巴细胞结肠炎在结肠段被排除从粪流。

摘要

分流性结肠炎 (DC) 是一种常见的临床情况发生在肠段的病人排除在粪便流由于分流肠。这种疾病的病因仍然不明确, 但似乎有别于传统的炎症性肠病, 如克罗恩病和溃疡结肠炎。研究旨在破译导致这种疾病发展的病理生理学机制, 由于缺乏合适的小鼠模型而受到严重阻碍。该协议生成了小鼠 dc 模型, 有利于研究免疫系统在 dc 发育过程中的作用及其与微生物的相互作用。在这个模型使用 C57BL/6 动物, 结肠远端部分被排除在粪便流通过创造一个远端结肠造口, 触发轻度到中度炎症在排除的肠段, 并再现人类的标志性病变的发展DC 具有适度的全身炎症反应。与大鼠模型相比, 大量的基因修饰的小鼠模型在 C57BL/6 的背景下可用。这些动物与我们的模型相结合, 可以使个体细胞因子、趋化因子或生物活性分子受体 (如白细胞介素 (IL)-17) 发挥潜在作用;IL-10, 趋化因子 CXCL13, 趋性因子受体 CXCR5 和 CCR7, sphingosine-1-phosphate 受体 4) 被评估在 DC 的发病机制。在 C57BL/6 背景下, 同类系小鼠菌株的可用性在很大程度上促进了转移实验, 从而确定了不同细胞类型在 DC 病因学中的作用。最后, 该模型提供了机会, 以评估当地干预 (如修改当地微生物或局部抗炎治疗) 对黏膜免疫的影响和非受影响的肠段和对系统性免疫平衡。

引言

近年来, 大量的非传染性结肠炎实体不同于典型的炎症性肠病 (IBDs;i., 克罗恩病或结肠炎溃疡性皮肤) 已临床和病理的特点在人类。导致这些结肠炎形式的发展的病理生理学机制部份地不完全地被了解, 因为适当的动物模型是稀缺的。分流性结肠炎是最近被描述的实体之一。虽然这个词在1980年由 Glotzer¹创造了, 相似的表型的最初的描述在1972年被给了 Morson²。该病在50% 至91% 的转移肠患者中发展, 其临床强度变化^3,4。鉴于美国每年约有12万口结肠造口患者的发病率, 这一疾病实体构成了一个重要的健康问题。

制定这项议定书的总目标是提供一个小鼠 dc 模型, 它依赖于类似于人类 DC 中所看到的结肠炎触发, 再现人类疾病的主要病理学特征。与其他小鼠结肠炎模型相比, 我们模型中的结肠炎诱导不需要转基因动物 (例如, IL-7 转基因小鼠, n-钙粘蛋白显性阴性小鼠, 或 TGFβ鼠), 应用化学刺激性物质 (例如, 葡聚糖硫酸盐钠 (DSS) 诱发结肠炎, 或硝基苯磺酸 (TNBS) 诱发结肠炎), 或在免疫缺陷小鼠 (如 CD45RB^高转移的特定细胞群的转移结肠炎模型) (综述, 见⁵)。与其他模型相比, 我们的 dc 模型的完整免疫系统允许评估在 dc 发展中所涉及的免疫机制。粘膜炎症对被排除的肠段的限制, 允许评估其对胃肠道其他部位粘膜免疫的影响, 对肠道其他免疫室的免疫平衡 (例如,, Peyer 的补丁和 mesenteriale 淋巴结), 以及整个生物体的免疫平衡。最后, 我们的模型构成了一个适当的工具来研究控制局部炎症刺激的机制, 这是由于当地微生物和消化抗原的正常当地环境的变化。

研究方案

这里描述的所有方法都已得到兽医政府当局 (Landesamt Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit 和 Fischerei, Vorpommern, LALLF M V) 的批准。

1. 动物的术前护理和准备

1. 到达动物设施后, 将动物 (C57Bl/6) 分成相似大小的组, 将每个组保持在一起, 并在整个实验中保持组恒定。
   注意: 使用相同性别的动物。用雄性小鼠得到了实验结果。
   注意: 如果使用雄性动物, 笼群在7周的年龄开始, 这样就可以建立一个层次结构, 从而最大限度地减少实验期间攻击性行为的风险。
2. 手术前至少一周, 切换到高能 (> 14 兆焦耳/千克) 和高蛋白 (> 20%) 饲料含有所有必需的微量元素和维生素 (详情, 见材料清单)。
   注: 确保所有小鼠在执行手术时重量至少25克。
3. 通过腹腔注射氯胺酮 (87 毫克/千克 ip) 和盐酸甲苯噻嗪 (13 毫克/千克 ip) 诱导麻醉和镇痛。等到老鼠容忍机械刺激, 如脚趾间距, 没有马达反应。
4. 将麻醉鼠标固定在位于操作台上的热垫上的仰卧位上, 保证在操作过程中稳定的定位, 避免全身热量的巨大损失。
   注: 热衬底应具有36°c 到40°c 的表面温度;手术室温度应为21摄氏度。

2. 远端结肠造口术

1. 剃掉腹部的头发。在开始手术前, 使用酒精70% 和碘伏消毒手术现场三次。将操作现场悬垂, 保证无菌条件。
2. 执行15毫米中位剖腹手术通过切割腹部肌肉和腹膜沿 linea, 从而减少失血。
3. 使用两个迈克迪贝克非创伤性钳, 小心拉盲肠, 末端回肠, 和上升和横结肠从腹膜腔。
   注意: 小心严格限制肠道的机械操作, 以防止对肠系膜结构的损伤。
4. 识别盲肠极, 上升结肠和小肠 (图1a 和 1b)。
   注意: 正确识别上升结肠是正确放置结肠造口的基础。在回盲区解剖不明确的情况下, Peyer 斑块的存在识别小肠, 而形成的凳子的出现则是结肠的特点。
5. 使用标尺确定未来结肠造口的位置。它应该被放置在20毫米远端的回盲阀的远端结肠造口。
6. 在右上象限的腹壁上再做3毫米切口。通过这个切口提取先前识别的结肠段, 形成一个循环, 小心不要扭曲循环。
7. 小心通过乙状结肠22口径灵活的静脉注射套管。注意不要损伤肠系膜血管结构。
8. 将肠道恢复到腹膜腔。
9. 用简单的缝线和可吸收缝合 (例如, polyglactin 910 或 polyfil 4-0 1/2 c) 将软管的两端固定在皮肤上。
10. 在关闭剖腹手术前, 用腹腔注射0.5 毫升0.9% 生理盐水进行液体复苏。
11. 用可吸收缝合 (如polyglactin 910 或 polyfil 4-0 1/2 c) 闭合腹膜和肌肉层, 并进行连续缝合。用可吸收缝合 (如 polyglactin 910 或 polyfil 4-0 1/2 c), 用连续缝合法关闭皮肤。
12. 通过使用细剪刀执行小计横断来打开形象化冒号循环。避免所有的肠系膜损伤。不要完全横过结肠。
13. 使用 monofil, 可吸收缝线 (如polydioxanone 或 monofil 6-0 3/8) 修复每个结肠造口, 使用三张全厚针缝合腹膜和皮肤。传入回路, 这是一个功能性的末端结肠造口, 和传出循环, 这是一个粘液瘘, 在这一点上明显分离 (图 1c)。
    注: 操作时间应少于20分钟, 以限制流体和热损失。
14. 完成手术后, 根据制造商的指示, 在超声波浴中使用无醛消毒液消毒仪器。

3. 假操作 (Colotomy)

1. 执行步骤1.1。到2.4。
2. 使用标尺确定未来的 colotomy 位置。colotomy 应定位与回盲阀的距离为实验组的结肠造口。
3. 用细剪刀打开结肠至少2/3 的周长。
4. 使用 monofil, 可吸收缝线 (例如, polydioxanone, monofil 6-0 3/8 s), 用单层、全厚度中断缝线闭合 colotomy。
   注: 实验外科医生的手术时间应少于20分钟, 限制液体和热损失。
5. 执行步骤2.10。, 2.11。和2.14。

4. 术后护理

1. 把动物送回笼子里去。提供一个良好的气氛, 37 摄氏度 (如红外线灯), 直到老鼠完全清醒。然后, 保持老鼠在温度和湿度调节的环境 (21 °c; 30% 10% 相对湿度)。允许免费获得食物和饮用水。为促进流体吸收, 提供额外的水浸泡动物饲料。
2. 当动物表现出对机械刺激的反应时, 注射0.1 毫克/千克体重丁丙诺啡, 开始术后镇痛。小心避免呼吸压抑。
3. 用1毫克/毫升曲马多补充饮用水, 在术后第一周继续镇痛。
4. 为了补偿由于流动性降低而减少的液体摄入量, 在第一个术后的一周内在笼子里供应一个固体饮料垫。
5. 在第一周, 每第二天在第一个月的剩余时间, 每隔三天, 在第二个月, 使用佳中描述的疾病严重性评分, 衡量动物的体重, 并评分动物行为。⁶。

结果

手术在实验性 (结肠造口) 和假 (colotomy) 组均耐受良好。手术和围手术期处理正确执行时, 围手术期死亡率不应超过10%。在术后第一周, 实验性和假组均有明显的体重下降。假组的动物通常在第四术后的一天达到其体重最低点, 但在实验组的一天后发生。体重减轻在实验组更明显, 达到21.7% 的初始体重。相比之下, 假动物失去了10.8% 的初始体重 (图 2)

讨论

本协议所提出的小鼠模型可靠地再现了人 dc 的组织病理学特征 ( 例如, 在炎症性肠段粘膜下层淋巴滤泡的发育, 隐窝缩短, 以及减少杯状细胞数)。除了这个优势, 这个模型是由一个非常相似的触发因素引起的, 并呈现出一个中等到轻度的严重性的临床过程, 正如在大多数受影响的人的情况。

为获得重现性结果和可接受的围手术期致死率, 需要一些显微外科技术的实...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt	ThermoLux, Witte + Sutor GmbH	461265
Ethanol 70% (with methylethylketon)	Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length	Centramed GmbH, Germany	8308370	for disinfection of operation field
Scissor	Aesculap (BRAUN)	BC064R
Atraumatic DeBakey forceps	Aesculap (BRAUN)	OC021R
Needle holder	Aesculap (BRAUN)	BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G	Braun Melsungen AG, Germany	4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm	ETHICON, Inc.	VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm	ETHICON, Inc.	Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior)	BD Medical	305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin)	ANTISEPTICA, Germany	18824-01	disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	9089.01.00	87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	400300.00.00	13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9%	Braun Melsungen AG, Germany	6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine)	Bayer, Germany	PZN: 01498870	0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride)	Grünenthal GmbH, Germany	10116838	1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)	Cephasaar GmbH, Germany	PZN: 08844252	25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL	Braun Melsungen AG, Germany	PZN: 05543515	12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich	ssniff, Germany	V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches	TripleATrading, the Netherlands	SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L	Nikon Instruments Europe BV, Germany		light microscopy
VetScan HM 5	Abaxis, USA	770-9000	Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath)	Bandelin electronics, Germany	RK 100 H	disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software	Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6	GraphPad Software, Inc.