Murine 원심 인공, C57BL/6 마우스에 전환 Colitis의 새로운 모델

요약

Murine 원심 인공 인간의 전환 colitis, 지저분한 스트림에서 제외 콜론 세그먼트에서 주로 림프 colitis 위한 murine 모델을 제공 합니다.

초록

양 대 장 염 (DC)는 환자에서 발생 하는 diverting enterostomy의 결과로 지저분한 스트림에서 제외 장 세그먼트와 자주 임상 조건입니다. 이 질병의 병 인 병이 정의 남지만 크 론 병과 궤 양성 대 장 염 같은 클래식 선 동적인 장 질병의 차이가 나타납니다. 이 질병의 개발을 선도 pathophysiological 메커니즘을 해독 하기 위한 연구는 적절 한 murine 모델의 부족에 의해 심각 하 게 방해 되었습니다. 이 프로토콜은 면역 체계의 역할 및 DC의 개발에 미생물와의 상호 작용의 연구를 용이 하 게 하는 DC의 murine 모델을 생성 합니다. C57BL/6 동물을 사용 하 여이 모델에 콜론의 원심 부분 원심 인공 항문을 만들어, 약한 염증 제외 장 세그먼트에 보통의 개발 트리거링 및 인간의 전형적인 병 변 재현으로 지저분한 stream에서 제외 됩니다. 적당 한 조직의 염증 반응으로 Dc입니다. 쥐 모델 달리 많은 유전자 변형 murine 모델 C57BL/6 배경에 사용할 수 있습니다. 우리의 모델이 동물의 조합 수 있습니다 개별 cytokines, 발산, 또는 생리 활성 분자 (예를 들어, 인터 루 킨 (IL)-17;의 수용 체의 잠재적인 역할을 IL-10, chemokine CXCL13, CXCR5 및 CCR7, chemokine 수용 체 그리고 sphingosine 1 인산 염 수용 체 4) DC의 병 인에 평가. C57BL/6 백그라운드에 congenic 쥐 긴장의 가용성은 크게 다른 종류의 세포는 병 인에 관련 된 DC의 역할을 설정 하는 전송 실험 용이. 마지막으로, 모델 및 비 영향을 영향을 받는 장 세그먼트에서 점 막 면역에 지역 개입 (예를 들어, 로컬 미생물 또는 로컬 염증 치료의 수정)의 영향을 평가 하기 위해 기회를 제공 하 고는에 조직의 면역 항상성입니다.

서문

최근 몇 년 동안, 고아 한 선 동적인 장 질병 (IBDs; 다른 비 감염 성 대 장 염 엔터티의 상당수 즉., Crohn의 질병 또는 colitis ulcerosa)는 임상 및 histopathologically 특징 되었습니다 인간에서. 이러한 colitis 형태의 개발을 선도 병 태 생리 기계 장치는 완전히 이해 되지 부분적으로 적절 한 동물 모델은 부족 때문에. 양 대 장 염이 최근 설명된 엔터티 중 하나입니다. 기간 Glotzer¹에 의해 1980 년에 화폐로 주조 되었다, 비록 비슷한 표현 형의 초기 설명 Morson²에 의해 1972 년에 주어졌다. 질병 개발 50%에 enterostomy, 우회 환자의 91%에 그리고 그것의 임상 강도 다릅니다^3,4. 아메리카 합중국에서에서 약 120000 인공 환자의 연간 발생률을 감안할 때,이 질병 엔터티는 중요 한 건강 문제를 구성 합니다.

이 프로토콜을 개발의 전반적인 목표는 인간 DC에서 본 비슷한 colitis 트리거에 의존 하 고 하는 인간 질병의 기본 histopathological 기능을 재현 murine DC 모델을 제공 했다. 다른 murine colitis 모델 달리 우리의 모델에서 colitis 유도 유전자 변형된 동물 (예를 들어, 일리노이-7 유전자 변형 마우스, N cadherin 지배적인 부정적인 쥐, 또는 TGFβ^/- 생쥐), 필요 하지 않습니다 응용 프로그램의 화학적 자극 물질 (예, dextran 황산 나트륨 (DSS)-유도 대 장 염, 또는 trinitrobenzene 술 폰 산 (TNBS)-유도 대 장 염), 또는 특정 세포 인구 (CD45RB^높은 전송에서 면역 결핍 생쥐에서의 전송 colitis의 모델) (검토,⁵참조). 다른 모델과 달리 우리의 DC 모델의 그대로 면역 시스템은 면역 메커니즘의 평가 DC 개발에 관련 된 있습니다. 제외 된 장 세그먼트에 점 막 염증의 제한 위장, 창 자의 다른 면역 구획에 면역 항상성에의 다른 부분에 점 막 면역의 돌아옴의 평가 수 (예: , Peyer의 패치 및 mesenteriale 림프절), 및 전체 유 기체의 면역 항상성. 마지막으로, 우리의 모델 모두는 지역 미생물으로 영양 항 일반 로컬 환경 변화에서 발생 하는 로컬 염증 성 자극을 제어 하는 메커니즘을 조사에 적합 한 도구를 구성 합니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법 수의 정부 기관 (Landesamt에 Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit 및 Fischerei 메클렌부르크-포어 폼 머 른, (LALLF M-V))에 의해 승인 되었습니다가지고.

1. 수술 전 치료와 동물의 준비

1. 동물 시설에 도착, 비슷한 크기의 그룹으로 동물 (C57Bl/6)를 분할 하 고 각 그룹을 함께, 케이지 그룹 실험 내내 일정 하 게 유지.
   참고: 같은 섹스의 동물을 사용 합니다. 설명 결과 남성 쥐와 함께 얻은 했다.
   참고: 남성 동물 사용 되는 경우, 케이지 그룹 함께 시작 하는 때 그들은 나이의 7 주 계층 구조를 설정할 수 있도록, 따라서 위험을 최소화 공격적인 행동의 실험 중.
2. 적어도 1 주일 전에 수술, 높은 에너지로 전환 (> 14 MJ/kg) 및 고 단백 (> 20%) 모든 필수 미 량 원소와 비타민을 포함 하는 피드 (자세한 자료의 목록 참조).
   참고: 수술을 수행할 때 모든 마우스 무게 이상 25 g을 확신 합니다.
3. 케 타 민 (i.p. 87 mg/kg) 및 xylazine 염 산 염 (i.p. 13 mg/kg)의 복 주사로 마 취 및 진통 유발. 마우스는 기계적 자극, 예를 들면 발가락 피치, 모터 응답 없이 허용 될 때까지 기다립니다.
4. 작업 데스크, 안정적인 작업 중 위치 및 체온의 압도적인 손실 방지를 보장에 위치 열 언더레이에 부정사 위치에 테이프와 함께 narcotized 마우스를 보안 합니다.
   참고: 열 언더레이 36 ° C ~ 40 ° C;의 표면 온도가 있어야 합니다. 수술 실 온도 21 ° c.는 이어야 한다

2. 원심 인공 작업

1. 복 부 머리를 면도. 시작 하기 전에 수술, 세 번 사용 하 여 알코올 70% 작업 필드와는 iodophor 소독. 무 균 조건에 대 한 보장을 작업 필드에 드러 워 진.
2. 복 부 근육과는 교육에 따라 복 incising 15 m m 중간 개복 술 수행 알바, 혈액 손실이 최소화.
3. 2 기금 atraumatic 집게를 사용 하 여, 신중 하 게 맹, 터미널 회장 및 오름차순 및 가로 결 장 복 막 구멍에서.
   참고: 엄격 하 게 제한 mesenteric 구조에 부상을 방지 하기 위해 내장의 기계 조작에 주의 해야 합니다.
4. Cecal 극, 오름차순 결 장 및 작은 창 자 (그림 1a 및 1b)을 확인 합니다.
   참고: 오름차순 콜론의 올바른 식별은 인공의 올바른 배치에 대 한 근본 이다. Ileocecal 지역의 해부학 모호한 경우에 Peyer의 패치의 존재 확인 소장, 그리고 형성된 된 대변의 존재는 콜론 특징.
5. 눈금자를 사용 하 여 미래의 인공의 위치를 결정. 그것은 배치 되어야 한다 20 mm 원심 원심 인공 ileocecal 밸브.
6. 상단 오른쪽 사분면에서 복 벽에 두 번째 3-m m 절 개를 확인 합니다. 루프를 왜곡 하지 않도록 주의 되는 루프를 형성 하기 위하여이 절 개를 통해 이전 확인된 콜론 세그먼트를 당기십시오.
7. 신중 하 게는 mesocolon 통해 22 게이지 유연한 i.v. 정 통과. 알아서 하지 mesenteric 혈관 구조를 손상.
8. 내장 복 막 구멍을 반환 합니다.
9. 간단한 스티치와 resorbable 봉합 (예를 들어, polyglactin 910 또는 polyfil 4-0 1/2 c)를 사용 하 여 피부에 유연한 튜브의 양쪽 끝을 수정 합니다.
10. 개복 술을 닫기 전에 유체 소생 0.5 mL 0.9% 염 분의 복 주사를 사용 하 여 수행 합니다.
11. Resorbable 봉합 (예: polyglactin 910 또는 polyfil 4-0 1/2 c)를 사용 하 여 연속 봉합으로 복 막과 근육 층을 닫습니다. 예를 들어, polyglactin 910 (polyfil 4-0 1/2 c) resorbable 봉합 사를 사용 하 여 연속 봉합으로 피부를 닫습니다.
12. 좋은 위를 사용 하 여 부분합 transection 수행 하 여 exteriorized 콜론 루프를 엽니다. 피하는 mesentery에 모든 부상. 콜론을 완전히 transect 하지 마십시오.
13. 각 인공 여 복 하 3 단일 전체 두께 바늘을 사용 하 여 수정 하 고 monofil, 흡수 되기 쉬운 봉합 사를 사용 하 여 피부 (예를 들어, polydioxanone 또는 monofil 6-0 3/8s). 기능 끝-인공 인 성의 루프 및 점액 누 인 원심 루프 (그림 1c)이이 시점에서 명확 하 게 구분 됩니다.
    참고: 작업 시간 해야 20 분 미만 유체 및 열 손실을 제한 합니다.
14. 후 악기 제조업체의 지시에 따라 초음파 목욕에 알데하이드 무료 살 균 솔루션을 사용 하 여 소독, 수술을 마무리.

3. 가짜 작업 (Colotomy)

1. 1.1 단계를 수행 합니다. 2.4 through.
2. 눈금자를 사용 하 여 미래 colotomy 위치를 결정. colotomy 실험 그룹에서 인공으로 ileocecal 밸브 로부터 같은 거리 위치 한다.
3. 콜론을 열고 적어도 2/3 잘가 위를 사용 하 여 그것의 둘레.
4. 닫기 단일 층으로 colotomy, 전체 두께 중단 monofil, 흡수 되기 쉬운 봉합 사를 사용 하 여 봉합 (예를 들어, polydioxanone, monofil 6-0 3/8s).
   참고: 작업 시간 실험된 외과 의사, 유체 및 열 손실 제한에 대 일 분 미만 이어야 한다.
5. 2.10 단계를 수행 합니다. 2.11. 그리고 2.14입니다.

4. 수술 후 관리

1. 그들의 감 금 소에 동물을 반환 합니다. 37 ° C (예를 들어, 적외선 램프로)의 잘 단련 된 분위기를 제공 마우스는 완전히 깨어 때까지. 다음, 온도 및 습도 통제 환경 (21 ° C, 상대습도 30% ± 10%)에서 마우스를 유지. 음식과 식 수를 무료로 이용할을 수 있습니다. 유체 이해를 촉진 하기 위하여 추가 물에 젖은 사료를 제공 합니다.
2. 0.1 mg/kg 몸 무게 buprenorphine를 주입 하 여 수술 후 진통 시작 때 동물 기계적 자극에 반응을 보여 사우스 캐롤라이나. 호흡을 하지 않도록 주의 해야 합니다.
3. 수술 후 첫 주 동안 지속적인된 진통에 대 한 1 mg/mL tramadol와 식 수를 보충 한다.
4. 로 인해 감소 액체 섭취 량에 대 한 보상 이동성 감소, 수술 후 첫 주 동안 장에 단단한 음료 패드를 공급.
5. 첫 주, 첫 달의 나머지 동안 매초 마다 하루 그리고 Kleinwort 외 에 설명 된 질병 심각도 점수를 사용 하 여 두 번째 달 동안 모든 3 일 동안 매일 동물과 동물 행동 점수를 무게 ⁶.

결과

수술은 모두 실험 (인공), 가짜 (colotomy) 그룹에 잘 용납입니다. 수술 및 수술 관리 올바르게 수행 하는 경우 수술 사망률 10%를 넘지 말아야 한다. 첫 수술 후 주에 상당한 체중 감소 실험와 가짜 그룹에서 볼 수 있다. 가짜 그룹의 동물 달성 4 번째 수술 후 날 향해 일반적으로 그들의 체중 최하 하지만 실험 그룹의 뒷부분에 나오는 1 일 발생. 체중 감량은 초기 체중의 21.7%에 ?...

토론

이 프로토콜에 안정적으로 제공 하는 DC의 murine 모델 (예를 들어, 드 노 보 개발 염증이 대 장 세그먼트, 단축, 토 굴 및 절감 submucosa 림프 낭의 인간 DC의 histopathological 기능을 재현 잔 셀 번호)입니다. 이 이점 이외에도이 모델 매우 비슷한 트리거링 요인에 의해 유발 고 가장 영향을 받는 인간의 경우 가벼운 심각도에 온건한의 임상 과정을 선물 한다.

재현할 결과 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Operation material
heat underlay, 6 watt	ThermoLux, Witte + Sutor GmbH	461265
Ethanol 70% (with methylethylketon)	Pharmacie of the University Hospital Greifswald
Wooden applicators, small cotton head onesided, wooden stick, 150 mm length	Centramed GmbH, Germany	8308370	for disinfection of operation field
Scissor	Aesculap (BRAUN)	BC064R
Atraumatic DeBakey forceps	Aesculap (BRAUN)	OC021R
Needle holder	Aesculap (BRAUN)	BM012R
Vasofix Safety i.v. cannula 22G	Braun Melsungen AG, Germany	4268091S-01
VICRYL Plus 4-0 violet braided; V-5 17 m 1/2c; 70 cm	ETHICON, Inc.	VCP994H
PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm	ETHICON, Inc.	Z991H
BD Plastipak 1 mL (Syringes with needle with sterile interior)	BD Medical	305501
Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin)	ANTISEPTICA, Germany	18824-01	disinfection of surgical instruments in ultrasonic bath
Medications
ketamine 10%, 100 mg/mL (ketamine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	9089.01.00	87 mg/kg i.p.
Xylasel, 20 mg/mL (xylazine hydrochloride)	selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH	400300.00.00	13 mg/kg i.p.
NaCl 0.9%	Braun Melsungen AG, Germany	6697366.00.00
Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorphine)	Bayer, Germany	PZN: 01498870	0.1 mg/kg s.c.
Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadol hydrochloride)	Grünenthal GmbH, Germany	10116838	1 mg/mL drinking water
Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxone)	Cephasaar GmbH, Germany	PZN: 08844252	25 mg/kg body weight i.p.
metronidazole 5 mg/mL	Braun Melsungen AG, Germany	PZN: 05543515	12.5 mg/kg body weight i.p.
Food
ssniff M-Z Ereich	ssniff, Germany	V1184-3
Solid Drink Dehyprev Vit BIO, pouches	TripleATrading, the Netherlands	SDSHPV-75
Equipment
Nikon Eclipse Ci-L	Nikon Instruments Europe BV, Germany		light microscopy
VetScan HM 5	Abaxis, USA	770-9000	Veterinary hematology analyzer of 50 µl venous EDTA-blood
Bandelin SONOREX (Ultrasonic bath)	Bandelin electronics, Germany	RK 100 H	disinfection of surgical instruments
Software
NIS-Element BR4 software	Nikon Instruments Europe BV, Germany
GraphPad Prism Version 6	GraphPad Software, Inc.