Aislamiento de células madre intestinales y de la cultura en un modelo porcino de isquemia Intestinal pequeño segmentaria

Resumen

Este protocolo permitirá a los lectores a establecer con éxito un modelo porcino de isquemia intestinal segmentaria y posteriormente aislar células madre intestinales para el estudio de la reparación epitelial después de lesión de la cultura.

Resumen

Isquemia intestinal sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en pacientes humanos y veterinarios. Muchos procesos de la enfermedad como resultado de isquemia intestinal, al disminuir el suministro de sangre y oxígeno al intestino. Esto nos lleva a la pérdida de la barrera intestinal y daño al tejido subyacente. Células intestinales de la madre residen en la base de las criptas de Lieberkühn y son responsables de renovación intestinal durante la homeostasis y las siguientes lesiones. Ex vivo las técnicas de cultivo celular han permitido el estudio exitoso de células madre epiteliales interacciones mediante el establecimiento de las condiciones de cultivo que favorecen el crecimiento de sistemas de órgano como epiteliales tridimensionales (denominado "enteroids" y" colonoids"en el intestino pequeño y grande respectivamente). Estos enteroids son compuesto de cripta y vellosidad-como dominios y maduros contienen todos los tipos de células que se encuentran dentro del epitelio. Históricamente, se han utilizado modelos murinos para estudiar el daño intestinal. Sin embargo, un modelo porcino ofrece varias ventajas incluyendo la similitud de tamaño, así como gastrointestinal anatomía y fisiología a la de los seres humanos. Utilizando un modelo porcino, establecemos un protocolo en que lazos segmentarios de la isquemia intestinal puede crearse dentro de un solo animal, que permite el estudio de los diferentes puntos de lesión isquémica de tiempo y reparar en vivo. Además, se describe un método para aislar y la cultura de las células intestinales de los lazos isquémicas del intestino, lo que permite el estudio continuo de reparación epitelial, modulada por las células de vástago, ex vivo.

Introducción

Lesión isquémica intestinal, el resultado de la disponibilidad de oxígeno disminuida debido a una reducción u obstrucción completa del flujo de sangre al intestino, sigue siendo una causa significativa de morbilidad y mortalidad en pacientes humanos y animales^1,2. Daño isquémico, junto con la posterior inflamación y la infiltración celular, conduce al compromiso de la barrera mucosa. La barrera mucosa es fundamental para la prevención de la traslocación bacteriana y las toxinas asociadas a la circulación sistémica^3,4. La posterior reperfusión de los tejidos isquémicos puede resultar en formación de dañar especies reactivas de oxígeno que pueden exacerbar la lesión⁵. Puesto que rara vez pueden prevenir isquemia intestinal, la investigación más actual ha centrado en el avance de las técnicas para la detección temprana de la isquemia y el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos que reducen la reparación mucosa lesiones o meta de la reperfusión.

Modelos animales se han utilizado para ampliar nuestro conocimiento de ciencia básica de isquemia-reperfusión y siendo imprescindible para la investigación traslacional. Modelos de roedores han sido los más utilizados debido a su capacidad para ser manipulado genéticamente⁶. Más recientemente sin embargo, el uso de modelos animales grandes, especialmente el cerdo, se ha abogado para futuros estudios traslacionales debido a una serie de ventajas como las similitudes anatómicas y fisiológicas del cerdos a los seres humanos^7,8. Han desarrollado una variedad de modelos de la lesión para estudio de isquemia-reperfusión e incluyen oclusión vascular completa, bajo flujo isquemia y oclusión vascular mesentérica segmentaria. Una revisión completa de estos modelos es fuera del ámbito de este artículo sin embargo los autores lectores para una reciente revisión³.

Además de modelos en vivo , el uso de sistemas de cultivo celular ex vivo ofrece una herramienta prometedora para el estudio de la homeostasis intestinal y la reparación posterior a la lesión. Las células madre intestinales son responsables de la proliferación celular y la cifra de negocios de la guarnición epitelial intestinal. Cuando aislado de intestino normal o lesionado, células intestinales puede ser mantenidas en la cultura y servir como herramienta o modelo para el estudio de células madre y biología de la célula epitelial. Métodos para aislar y establecer estas tres dimensiones de la cultura sistemas (llamados enteroids y colonoids cuando deriva del intestino pequeño y grande, respectivamente) se han descrito una variedad de especies y órganos sistemas^{9,10 ,11,12,13}. Específicamente, en el tracto gastrointestinal, estos sistemas de cultivo se han utilizado para enfermedades gastrointestinales modelo incluyendo cáncer, infección del patógeno y de la enfermedad inflamatoria intestinal¹⁴. En este momento, no hay ningún informe que describe el aislamiento y mantenimiento de células intestinales del intestino ischemically lesionado en cualquier especie. Por lo tanto, aquí describimos el proceso de isquemia intestinal en un modelo porcino animal grande, novela que resulta en lesión reproducible y la capacidad de aislar células madre intestinales del intestino normal y ischemically lesionado para el estudio adicional de recuperación de ex vivo.

Protocolo

Para estos experimentos, todos los estudios en animales fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de North Carolina State University.

1. preparación para la cultura

Nota: Todos los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales. Concentraciones de factor de crecimiento específico se enumeran en la tabla 1.

1. Preparar una solución de ácido (EDTA) 0,5 m. etilendiaminotetracético en agua desionizada destilada (ddH₂O). Mezclar adecuadamente y ajustar el pH a 7.4 con soluciones de NaOH o HCl.
   Nota: Constituyen solución EDTA fresca antes de cada experimento.
2. Prepare el reactivo de disociación #1 (DR #1) como sigue y coloque en hielo: combinar fosfato tampón salino sin Ca^{2 +} y Mg^{2 +} (PBS), 0,5 M de EDTA, 1 M 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 μm Y27632 y solución antibiótico-antimicótico de X 1 (anti Anti-) que contiene penicilina, estreptomicina y anfotericina B.
   Nota: Agregar Y27632 inmediatamente antes de la recogida de tejido.
3. Prepare el reactivo de disociación #2 (DR #2) como sigue y colocar en un baño de agua de 37 ° C: combinar PBS sin Ca^{2 +} y Mg^{2 +}, 0,5 M de EDTA, 10 μm Y27632 y 1 X anti-Anti. Nota: Agregar Y27632 inmediatamente antes de la recogida de tejido.
4. Preparar los medios de comunicación de células epiteliales intestinales (IESC) como sigue: mezclar 25 mL avanzado medio DMEM/F12 con suplemento de N2 X 1, 1 X B-27 suplemento, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax y 1 X anti-Anti. Almacenar a 4 ° C hasta su uso.
5. Preparar una mezcla maestra de reducido factor de crecimiento de la membrana del sótano (matriz) y factores de crecimiento suplementarios como sigue: descongelar la matriz en el hielo. En un tubo de microcentrífuga, añadir 100 ng/mL Noggin humano recombinante, 500 ng/mL recombinante humana 1 R-Spondin, 50 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento epidérmico (EGF), 100 ng/mL Wnt3a recombinante de humano, nicotinamida, gastrina 10 de nM, de 10 mM 500 nM A-83-01, 10 μm Y-27632 , SB202190 de 10 m m, 500 nM LY2157299 y 2.5 μm glucógeno sintasa 3 inhibidor de la cinasa (GSK3i, CHIR99021). Cuando la matriz es descongelada, complementar con la mezcla de factor de crecimiento (haciendo la mezcla principal) y almacenar en hielo.
   Nota: Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire ya que esto va crear artefacto dentro de la empanada de la matriz durante la galjanoplastia.
6. Precalentar un plato 24-well cultivo de tejidos en una incubadora de 37 ° C antes de iniciar procedimientos de aislamiento celular.

2. quirúrgico modelo de isquemia y colección de tejido

1. Uso ocho a diez semanas de edad Yorkshire cruza cerdos de ambos sexos (recomendado). Eliminar todo alimento 16-18 h antes de la cirugía. Acceder a los cerdos al agua en todo momento.
2. Programar los cerdos para llegar por lo menos 48 h antes de los experimentos para permitir la aclimatación ambiental.
   Nota: Técnicos capacitados de veterinaria o laboratorio bajo la supervisión de un veterinario con licencia proveen cuidado rutinario de los animales y asistencia en procedimientos anestésicos.
3. Premedicate el cerdo con xilacina (1,5 mg/kg por vía intramuscular (IM)) y ketamina (11-20 mg/kg (IM))¹⁵. Una vez tranquilo, intubar la orotracheally de cerdo.
4. Mantener los cerdos bajo anestesia general con isoflurano (2-5%) vaporizado en el 100% O₂ hasta el momento de la eutanasia.
5. Colocar un catéter (IV) intravenoso (vena de la oreja se recomienda) y administrar un fluido de reemplazo como solución de Ringer a una tasa de mantenimiento de 15 mL/kg/h.
6. Realizar anestesia monitorización incluyendo oximetría de pulso, Electrocardiografía y presión arterial indirecta medidas¹⁵. Vigilar frecuencia respiratoria y el esfuerzo del Chancho y ventile manualmente o mecánicamente según sea necesario si extremo marea CO₂ se eleva por encima de 55-60 mmHg.
   Nota: Anestesia adecuada es confirmada por la supervisión continua de las tendencias de frecuencia cardíaca (rango 80-130 lat/min), presión arterial no invasiva (media presión arterial 75-100 mmHg) y frecuencia respiratoria (10-25 respiraciones/min)¹⁶y verificación periódica ausencia de mandíbula y tono anal. Profundidad de la anestesia también puede ser juzgado por el grado de relajación muscular y fasciculaciones de los músculos tras estímulo quirúrgico. Reflejos oculares suelen ser de ningún valor¹⁶. Puede proporcionar analgesia según las indicaciones de la política de las instituciones IACUC. En este caso un opiáceo, como la buprenorfina, puede ser administrado durante la cirugía.
7. Coloque el cerdo en una almohada y restringir en recumbency dorsal para el procedimiento quirúrgico.
8. Afeitar el abdomen ventral y preparación mediante lavado quirúrgico (solución de clorhexidina) y alcohol isopropílico.
9. Hacer una incisión de 8-10 cm de la línea media ventral usando una hoja de bisturí, centrada en el ombligo para acceder el abdomen.
10. Identificar el intestino delgado (yeyuno) oral aproximadamente 40 cm hasta la Unión ileocecal. Delinear lazos largo 10 cm de yeyuno por ligadura circunferencial el intestino dos veces, un centímetro entre cada ligadura, antes de crear posteriores lazos 10 cm localizado por vía oral (figura 1).
11. Crear dos circuitos por cada punto del tiempo de isquemia adyacentes entre sí, uno para isquemia y otro para la isquemia con una 1h adicional de reperfusión si lo desea. Para crear la isquemia completa (no flujo de las arterias o venas), abrazadera o ligar la vasculatura mesentérica con pinzas vasculares bulldog, curva pinzas hemostáticas de mosquito de Halstead o seda no absorbible 2-0 para 1, 2, 3 y 4h y luego retire las abrazaderas para 1h de reperfusión, si lo desea.
    Nota: Los autores crearon todos los bucles de la isquemia en orden comenzando por el bucle isquémica 4h y progresaban hacia proximal (minimizar el tiempo total de la cirugía). Para hacer frente a la posibilidad de que los vecinos de segmentos de intestino isquémicos pueden dañar lazos adyacentes, se puede variar el orden de las asas isquémicas. Esto puede alterar el tiempo quirúrgico total.
    Nota: El tiempo de reperfusión puede variar en base a la pregunta de investigación de interés o si las terapias desean analizarse durante el período de reperfusión. Sin embargo, como daño a los tejidos se convierte en más grave del aumento de duración de la isquemia solo, reperfusión probablemente no contribuye a más lesiones epiteliales. Reperfusión probablemente desempeñan un papel tras periodos leves de lesión isquémica.
12. Entre puntos de tiempo de isquemia, mantener el abdomen cubierto o cerrado utilizando una toalla estéril o una abrazadera de toalla.
    Nota: Dentro de un solo animal para este experimento, se pueden crear ocho segmentos isquémicos. Identificar un segmento yeyunal adicional, por lo menos 5-10 cm proximal al último bucle isquémico, que servirá como un control interno normal.
13. Obstruir aproximadamente tres recipientes mesentéricos por bulldog pinza vascular o curva pinza hemostática mosquito de Halstead. Debe tenerse cuidado durante la aplicación de la pinza porque los vasos están fácilmente traumatizados. Tratar de apilar los vasos entre las mordazas de las pinzas.
14. Al final del experimento, siguiente eutanasia pentobarbital 85-100 mg/kg IV, recoge todos los bucles de tejido con tijeras de metzenbaum, después de la muerte ha sido confirmada sin auscultar latido y pérdida del reflejo corneal. Empezar por recoger una pieza de control de yeyuno normal por lo menos 5 - 10 cm proximal al último bucle isquémico.
15. Separar y almacenar los lazos de cada momento de la lesión en pequeños recipientes de PBS helado hasta que esté listo para el aislamiento de la cripta.
    Nota: Si lo desea, hacer isquémica bucles de tiempo suficiente para dividir las muestras separadas para la histología y cultivo de células madre intestinales; sin embargo, los autores han encontrado que lazos más de aproximadamente 10 cm de largo son más propensos a convertirse en hemorrágica.

3. cripta (células madre) aislamiento de isquémica y lazos de Control

1. Invertir cada lazo del pequeño intestino usando un alambre de calibre 20 y fórceps de tejido para exponer la superficie de la mucosa. Atar la parte superior e inferior del asa firmemente al cable mediante sutura (seda no absorbible 2-0 o equivalente).
2. Después de la inversión, enjuague cada bucle en PBS frío hielo para quitar escombros luminal.
3. Coloque inmediatamente las muestras en tubos cónicos de 50 mL que contiene DR #1 en hielo durante 30 minutos.
4. Bucles de control a partir de recoger y seguir con lazos de progresivamente aumentar la duración de la isquemia. Bucles de menos tejido dañado (es decir, control y 1 h tejido isquémico) pueden agitarse con fuerza, ajustando la muñeca para obtener mejores resultados. Tejidos de tejido dañado severamente (3 y 4 h de isquemia) deben sacudió suavemente o invertidos solamente como demasiada agitación causará interrupción de cripta y destrucción del tejido adicional. Tubos deben agitarse o invertidos cada 5 min en el hielo.
5. Transferir las muestras a DR #2 para 10 min en un baño de agua de 37° C. Sacuda o invertir los tubos cada 5 min.
6. Después de transferir los tejidos, centrifugar los tubos cónicos que contienen DR #1 de los bucles de 2-4 h dañada para eliminar el EDTA sobrenadante (200 x g durante 5 min). Como estos tejidos están muy dañados es posible que las criptas ya han se disocian. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con un pequeño volumen de PBS (5 mL) y continúe con el paso 3.9.
7. Extraer muestras de DR #2 y colocar las muestras de tejido directamente en 25 mL de PBS frío en hielo (etiqueta como lavado #1). Coloque las muestras en un agitador orbital de hielo a 60 rpm. Seguir a agitar o invertir cada tubo por 30 s cada 2 a 5 min.
8. Después de la transferencia a los tejidos, hacer girar los tubos cónicos con DR #2 de 2-4 h dañados lazos para eliminar el EDTA sobrenadante (200 x g durante 5 min). Como estos tejidos están muy dañados es posible que las criptas han se disocian. Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet con un pequeño volumen de PBS (5 mL) y continúe con el paso 3.9.
9. Sacar una alícuota de 50 μl de lavado #1 (o de la República Dominicana) para comprobar el grado de disociación de la cripta y cantidad de residuos. Coloque el tejido en un tubo cónico de 50 mL nuevo (lavado #2, #3, etc.) llenos con 25 mL de frío PBS y agitar hasta que están aisladas con residuos mínimos y vellosidades criptas intactas.
   Nota: El objetivo es ser capaz de aislar una fracción limpia de criptas intactas y desperdicios mínimos. Cada lavado adicional limpiará las células sin embargo demasiada agitación comenzará a causar daño de célula de tejido secundario. Además, se logrará los mejores resultados con menos contaminación si criptas están revestidas de un paso de lavado y no de un paso de reactivo de disociación.
10. Remover el tejido restante Centrifugue los tubos cónicos de 50 mL a 200 x g durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante y resuspender restante la pelotilla de la cripta en menor volumen de PBS (5 mL).
11. Usando un microscopio invertido, examinar 50 alícuotas de μl de cada muestra para determinar el número de criptas/fracción. La meta es 50-100 criptas/50 μL, como será el tamaño de la empanada de la matriz final.
    Nota: Si la muestra es demasiado concentrada, continuar a añadir PBS frío hasta que se alcance la concentración deseada. Si la muestra está muy diluida, determinar número de alícuotas necesarias para alcanzar el rendimiento deseado de la cripta y ajustar.
12. Alícuotas o los volúmenes apropiados de las criptas (determinados por observaciones alícuotas) en un tubo de microcentrífuga. Por ejemplo, si la muestra contiene 50 μl de criptas/50 alícuotas de 50 μL por patty X 3 repeticiones = 150 μL / tubo de microcentrífuga. Si la muestra sólo contiene 25 μl de criptas/50 2 alícuotas necesitadas patty X 3 Replica = 300 μL/tubo.
13. Criptas de pellets a 200 x g durante 5 min a 4° C.
14. Resuspender suavemente granuladas criptas con volumen apropiado de mezcla principal (50 μL por pocillo). Mezclar bien mediante pipeteo rápidamente 15 veces sin crear burbujas de aire.
    Nota: Pre-enfriar la punta de la pipeta con PBS estéril fría antes de aspirar la mezcla principal. Esto le ayudará a mantener la mezcla principal de separarse hacia fuera. Consejos pueden mantenerse en el refrigerador y colocados en la campana inmediatamente antes de usar.
15. Dispensar un 50 μl mezclar maestro más gotas de la cripta en centro de cada pocillo de una placa bien 24 precalentado.
16. Incubar la placa de cultivo durante 30 min a 37 ° C.
17. Superpón cada patty matriz con 500 μl / pozo de medios IESC (no otros factores de crecimiento necesarios en el día 0 como están contenidas dentro de la mezcla principal).
18. Añadir 500 μl PBS estéril a cualquier pocillos no utilizados en la placa para mantener la humedad.
19. Contar el número de criptas enchapadas en el día 0.
    Nota: Es útil a la red cada célula cultura placa en cuadrantes para asegurar la cuenta más exacta.
20. Contar número de enterospheres cada 24 h y vigilar para el desarrollo de enteroide diariamente.
21. Añadir factores de crecimiento para cada bien cada 48 h. Quite los medios de comunicación IESC cada 96 h y reemplácelo con medio fresco de 500 μl (factores de crecimiento debe añadirse a los medios de comunicación).

Resultados

Isquemia intestinal completa fue creada en pequeños bucles intestinales utilizando oclusión vascular con sutura o grapas como se muestra en la figura 1. Soltando las abrazaderas, puede realizarse un período controlado de la reperfusión, lo que permite un estudio adicional de lesión de la reperfusión posterior si lo desea. Todos los animales sobrevivieron durante el procedimiento con la mínima complicación hasta la eutanasia. La complicación quirúrgica más frecuente fue la hipotensión, que resolvió con la suplementación de un positivo inotrópico como la dobutamina.

Si se realiza correctamente, lesión isquémica comenzará en la punta de la vellosidad intestinal y migran hacia abajo dentro de la cripta como la duración de los aumentos de isquemia (figura 2). Un error común con la técnica quirúrgica puede ocurrir cuando los vasos sanguíneos no ligados o afianzado con abrazadera uniformemente. El resultado es una isquemia hemorrágica (figura 3), en la que la vena de paredes delgadas se derrumba antes de la arteria, permitiendo sangre adicional para infiltrarse en los tejidos. Esto se ve manifiestamente como una superficie serosal púrpura oscurezca (figura 3, izquierda) en comparación con una superficie más clara durante la isquemia completa (figura 3, derecha).

Después del retiro de las asas intestinales isquémicas, criptas intestinales se aislaron con éxito siguiendo el protocolo de la disociación (figura 4). Como era de esperar, criptas de horarios más severamente dañado a menudo se rompieron (f; fragmento) y fracciones de la cripta contienen detritos celulares más fondo en comparación con aquellos que experimentaron no o daño leve. Durante el protocolo, el intestino severamente lesionado debe agitarse suavemente para evitar daños a los tejidos subyacentes. Sacude demasiado áspero puede resultar en daño adicional de la cripta y la mayoría de las criptas en el DR las soluciones que contienen EDTA, dando por resultado la interrupción adicional.

Una vez plateado, criptas desde todos los puntos de tiempo de isquemia sobreviven y son capaces de establecerse en la cultura (figura 5). Cuando criptas intestinales normales y levemente dañadas se platean en la cultura, forma de enterospheres dentro de las 24-48 h. Con daño isquémico severo (3 y 4 h), las criptas intestinales sobrevivirán pero que están dañadas, resultando en la formación de esferas mucho más pequeñas inicialmente. 72-120 h, enteroids convertido en más compleja con evidente lúmenes central y estructuras de florecimiento. En general, existe una eficiencia de crecimiento disminución de las criptas, así como una disminución del tamaño de enteroids derivados del tejido intestinal severamente dañado (González, L.M., datos no publicados, 2017).

Figura 1 : Modelo quirúrgico mas isquemia intestinal en un modelo porcino. A) yeyuno porcino normal que exteriorizado. B) mesentéricos buques han sido ligados con sutura creación de isquemia intestinal. C) isquemia creada con pinzas vasculares bulldog para permitir la reperfusión del tejido si se desea. D) vasculatura intestinal inmediatamente después del retiro de las abrazaderas vasculares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Evidencia histologic (hematoxilina y eosina (H & E) Mancha) de aumento de daño epitelial después de más larga duración de isquemia intestinal completada. Daño comienza en la punta de la vellosidad con pérdida gradual de la capa epitelial de la célula, vellosidad embotar y daño celular que se extiende a la cripta con lesiones graves (hasta 4 h duración). barra de escala de 100 μm. I = isquemia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Evidencia bruto e histologic de la hemorrágica isquemia. A) fotografía bruto comparando hemorrágica isquemia (lazo izquierdo) y la isquemia completa (lazo de la derecha). Cuando la vasculatura no ligada o afianzado con abrazadera uniformemente, sangre puede continuar para infiltrarse en los tejidos, resultando en daños e inflamación adicional. B) H & E imágenes de hemorrágica isquemia de aumento de la duración de 1-4 h. Además de daño celular considerado isquemia completa, existen evidencias de infiltración de glóbulos rojos dentro de la lámina propia circundante. barra de escala de 100 μm. I = isquemia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Alícuotas de criptas intestinales aisladas por los lazos del intestino isquémico y normal de. Completadas, intactas criptas intestinales (asteriscos) se aislaron con éxito de cada asa del intestino. Como era de esperar, criptas de más puntos de tiempo severamente dañado a menudo se rompieron (f; fragmento) y fracciones de la cripta contienen detritos celulares más fondo en comparación con aquellos que experimentaron no o daño leve. barra de escala de 100 μm. I = isquemia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Curso del tiempo de crecimiento de células intestinales tras aislamiento de lazos isquémicas del intestino pequeño. Cuando criptas intestinales normales fueron plateadas en la cultura, enterospheres formado dentro de las 24-48 h. Con daño isquémico severo (3 y 4 h), criptas sobrevivirán pero forman esferas mucho más pequeñas inicialmente. 72-120 h, enteroids convertido en más compleja con evidente lúmenes central y estructuras de florecimiento. 20 μm escala bar si no se indica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Factor de crecimiento	Diluyente	Concentración stock	Dilución de stock	Dilución de trabajo
R-Spondin	PBS	100 X	100 μg/ml	1 μg/ml
Noggin	SW/0.1%BSA	1000 X	100 μg/ml	100 ng/ml
EGF	10mM de ácido acético	10.000 X	500 μg/ml	50 ng/ml
A-83-01	DMSO	1000 X	500 ΜM	500 nM
SB202190	DMSO	3000 X	30 mM	10 ΜM
Nicotinamida	SW	1000 X	1 M	1 mM
Gastrina	PBS	10.000 X	100 ΜM	10 nM
Y-27632	PBS	1000 X	10 mM	10 ΜM
LY2157299	DMSO	10.000 X	5 mM	0,5 ΜM
CHIR99021	PBS	1000 X	2,5 mM	2.5 ΜM
Wnt3a	PBS	2000 X	200 μg/ml	100 ng/ml

Tabla 1: tabla de factor de crecimiento reactivo. Resumen de soluciones madre de factor de crecimiento y soluciones de trabajo utilizadas en el presente Protocolo.

Discusión

El desarrollo de un modelo porcino de isquemia intestinal segmentaria amplía modelos murinos anteriores permitiendo el estudio de varios puntos de tiempo de lesión del tejido en el mismo animal. Hay varios puntos de la discusión crítica de este protocolo, incluyendo ligadura de vaso adecuado, la reperfusión del tejido y cultivo de células de la cripta exitosa.

Ligadura de vaso adecuada es esencial para la creación de un modelo de isquemia completa. Si la sutura se ata irregularmente o la abrazadera no apretó totalmente, sangre de la arteria de pared gruesa puede continuar entrar en el tejido y no puede salir por el colapso de la vena de paredes delgadas. Esto resulta en extravasación de sangre en la lámina propia que causa daño tisular adicional. Sin embargo, dependiendo del tipo de lesión isquémica en estudio, puede desear la isquemia completa o hemorrágica. Por ejemplo, en el proceso de trasplante intestinal, el intestino completamente es separado de la fuente vascular (arteria y vena) durante la fase de resección del procedimiento, que resulta en isquemia intestinal completa. Como alternativa, sin embargo, cuando el mesenterio está doblado durante un evento como un vólvulo intestinal, el retorno venoso es a menudo obstruido en primer lugar, hacia la sangre adicional dentro del tejido antes de la fuente arterial obstruido, creando así hemorrágica isquemia.

Lesión isquémica resulta en daño a los tejidos a partir de la punta de la vellosidad y extendiéndose hasta el fondo de la cripta³. Durante la isquemia, energía en forma de trifosfato de adenosina se sigue utilizando y genera la hipoxantina metabolito. Cuando el tejido está reperfused con oxígeno, hipoxantina llega a ser metabolizado por la xantina oxidasa y produce radicales libres de superóxido llevando a lesión de la mucosa y la atracción de neutrófilos^17,18de daño del tejido. Diferencias de especie en arquitectura vascular mucosa así como la expresión diversa de la xantina oxidasa, resultan en diferentes grados de lesión de la reperfusión³. Felinos y roedores modelos de isquemia-reperfusión son más susceptibles a daño por reperfusión de metabolitos de oxígeno reactivo^19,20. Por el contrario, los cerdos fueron encontrados para tener menos xantina oxidasa y por lo tanto, menos daño por reperfusión, hacer este modelo más comparable a la de isquemia intestinal humano²¹. En este momento, el uso de nocaut o modelos porcinos transgénicos para estudiar el daño intestinal no se ha descrito, haciendo de este una limitación importante de este modelo. Selección del modelo animal adecuado depende del proceso de enfermedad o condición específica que el investigador desea estudiar. Por ejemplo, modelos porcinos de lesión isquémica hasta 6 h han sido descrito²², considerando que los procedimientos más isquémicos en modelos murinos se 45-60 min²³.

Aislamiento exitoso de las criptas intestinales del intestino normal y ischemically dañado permite el estudio de la recuperación epitelial en la cultura. Este sistema permite al investigador a centrarse únicamente en el epitelio sólo como fuente no vascular o células inmunitarias componente a considerar. Esto ofrece la oportunidad de estudiar las interacciones de la célula epitelial y la recuperación después de la lesión además de la respuesta a diferentes factores de crecimiento o tratamientos administrados durante la cirugía o siguientes aislamiento cripta complementando los medios de cultivo. Este paso es el más difícil, como aislamiento de los lazos severamente dañados requiere agitación suave y rápida eliminación de las soluciones que contienen el EDTA en el caso de las criptas tienen se prematuramente disocian. Si estos lazos del intestino no se lavan bien, las criptas tienen el potencial de contaminación en la cultura. Como resultado, ambas soluciones Dr. Además de los medios de comunicación IESC añadido solución antibiótico-antimicótico. Otro punto de discusión se centra en el intestino como un control normal. Como los animales se someten a anestesia con posibles alteraciones en la perfusión sistémica tejido, junto con la posibilidad de circulación de mediadores inflamatorios secundarios a la isquemia, tejido de control incluso "normal" puede no representar un verdadero control. En estos experimentos, es de nota que el tejido de control aparecieron grueso e histológico comparable al tejido de animales que no se someten a isquemia en otros experimentos (González, L.M., datos no publicados, 2017).

En Resumen, este método describe un modelo reproducible de la isquemia intestinal porcina, que modela de cerca lo que ocurre en humano lesión isquémica. Además, se describe el aislamiento de células intestinales de bucles isquémicas, que sirve para estudiar la reparación epitelial y posible respuesta al tratamiento en la cultura.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free	Fisher Scientific	BP-399	Dilute 1:10
Distilled, deionized water (ddH2O)			Used to prepare EDTA and PBS
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Thermo Scientific	20688
Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	ED45	Make fresh before each experiment; pH 7.4
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	646563
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
N2 Supplement	Life Technologies	17502-048
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
HEPES	Life Technologies	15630-106
Glutamax	Life Technologies	35050-061
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B	Gibco	15240-096	Anti-Anti solution
Recombinant human Wnt-3a	R & D Systems	5036 WN/CF
Recombinant human Rspondin1	R & D Systems	4645- RS
Recombinant human Noggin	R & D Systems	6057-NG
Recombinant human EGF	R & D Systems	236-EG
LY2157299	SelleckChem	52230
CHIR99021	Cayman Chemical	13122
Human [leu]15-Gastrin 1	Sigma Aldrich	G9145
SB202190	Sigma Aldrich	57067
A83-01	Tocris	2939
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Water, WFI Quality	Corning, Inc.	25-055-CM	Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Matrigel Matrix, GFR	Corning, Inc.	356231	Phenol red free
24 Well Culture Dish	Corning, Inc.	3524
Conical Tube, 50 ml	Corning, Inc.	430828
Scalpel Handle	World Precision Instruments	500236
Carbon Steel Surgical Blade, No. 10	World Precision Instruments	504169
Tissue Forceps	World Precision Instruments	15918
Debakey Tissue Forceps	World Precision Instruments	501239
Mayo Scissors	World Precision Instruments	501752	Curved or straight
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments	501739
Mosquito Forceps, Curved	World Precision Instruments	503724-12	Curved or straight (503728-12)
Hopkins Bulldog Clamp	Stoelting Co.	52120-40P	Straight
Silk, 2-0	Henry Schein	685S-BUT	Any similar brand is acceptable
Towel Clamps	World Precision Instruments	501700
Needle Holder	World Precision Instruments	V503382
Wire suture, 20 gauge	Henry Schein	19075	Cut and straighten before use.
Surgical Towels	Henry Schein	ST1833	Any similar product is acceptable.
Lactated Ringers Solution	Henry Schein	9851
Chlorhex antiseptic scrub (4%)	Henry Schein	VINV-CHMX-SCRB	Any similar brand is acceptable
Isopropyl Alcohol 70%	Henry Schein	MS071HS	Any similar brand is acceptable
IV catheter, 22 gauge	Henry Schein	2225PUR	May need 20g or 24 g depending on size of the vein
Xylazine (100 mg/ml)	Henry Schein	33198
Ketamine (100 mg/ml)	Henry Schein	11695-6835-1	Controlled medication
Isoflurane solution	Henry Schein	10015516
Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))	Vortech Pharm.		Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.
Heating pad	Gaymar		Tpump Core Warming System; others are available.
Mindray Datascope Monitor	Mindray North America		Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable
Vaporizer	Vetland Medical		Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.
Fluid Pump	Abbott Hospira		Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.