Una nueva técnica de sutura de tenorrafia con injerto de colágeno de ingeniería tisular para reparar defectos grandes del tendón

Resumen

En este trabajo, presentamos un protocolo in vitro e in situ para reparar un hueco tendinoso de hasta 1,5 cm llenándolo con injerto de colágeno modificado. Esto se realizó mediante el desarrollo de una técnica de sutura modificada para tomar la carga mecánica hasta que el injerto madure en el tejido huésped.

Resumen

El manejo quirúrgico de defectos tendinosos grandes con injertos de tendón es un desafío, ya que hay un número finito de sitios donde los donantes pueden identificarse y usarse fácilmente. Actualmente, este vacío se llena con injertos de tendones auto, aloo, xeno o artificiales, pero los métodos clínicos para asegurarlos no son necesariamente traducibles a animales debido a la escala. Con el fin de evaluar nuevos biomateriales o estudiar un injerto de tendón compuesto de colágeno tipo 1, hemos desarrollado una técnica de sutura modificada para ayudar a mantener el tendón diseñado en alineación con los extremos del tendón. Las propiedades mecánicas de estos injertos son inferiores al tendón nativo. Para incorporar el tendón diseñado en modelos clínicamente relevantes de reparación cargada, se adoptó una estrategia para descargar el injerto de tendón de ingeniería tisular y permitir la maduración e integración del tendón diseñado in vivo hasta que se formó un neoten tendón mecánicamente sólido. Describimos esta técnica utilizando la incorporación de la construcción del tendón de ingeniería tisular de colágeno tipo 1.

Introducción

La ruptura del tendón puede ocurrir debido a factores extrínsecos como laceraciones traumáticas o carga excesiva del tendón. Debido a las fuerzas de tracción externas colocadas en una reparación del tendón, inevitablemente se forma una brecha con la mayoría de las técnicas de reparación del tendón. Actualmente, los defectos / huecos tendinosos se llenan con injertos automáticos, aloo, xeno o artificiales, pero su disponibilidad es finita y el sitio donante es una fuente de morbilidad.

El enfoque de ingeniería tisular para fabricar injerto de tendón a partir de un polímero natural como el colágeno tiene la ventaja distintiva de ser biocompatible y puede proporcionar componentes vitales de matriz extracelular (ECM) que facilitan la integración celular. Sin embargo, debido a la falta de alineación fibrilar, las propiedades mecánicas del tendón diseñado (ET) son inferiores al tendón nativo. Para aumentar las propiedades mecánicas del colágeno más débil, se han utilizado muchos métodos, como la reticulación física al vacío, la radiación UV y los tratamientos dehidrotérmicos¹. Asimismo, a través de la reticulación química con riboflavina, los métodos enzimáticos y no enzimáticos aumentaron la densidad del colágeno y el módulo de Young del colágeno in vitro^2,3. Sin embargo, al añadir agentes reticulantes, la biocompatibilidad del colágeno se ve comprometida, ya que los estudios han demostrado una alteración del 33% en las propiedades mecánicas y una pérdida del 40% de la viabilidad celular^3,4,5. La acumulación gradual de alineación y resistencia mecánica se puede obtener a través de la carga cíclica⁶; sin embargo, esto se puede adquirir de manera eficiente in vivo⁷.

Para que ET se integre in vivo y adquiera resistencia sin la necesidad de alteración química, un enfoque sería utilizar una técnica de sutura estabilizadora para mantener la construcción más débil en su lugar. La mayoría de las reparaciones del tendón se basan en el diseño de la sutura para mantener unidos los extremos del tendón; por lo tanto, la modificación de estas técnicas existentes podría proporcionar una solución lógica^8,9.

Hasta la década de 1980, las reparaciones de 2 hebras eran ampliamente utilizadas, pero la literatura quirúrgica reciente describe el uso de 4 hebras, 6 hebras o incluso 8 hebras en la reparación^10,11. En 1985, Savage describió técnicas de sutura de 6 hebras con 6 puntos de anclaje, y fue significativamente más fuerte que la técnica de sutura de Bunnell que utiliza 4 hebras ¹². Además, las reparaciones de 8 hebras son un 43% más fuertes que otras hebras en modelos de cadáveres e in situ, pero estas reparaciones no se practican ampliamente ya que se vuelve técnicamente difícil reproducir las reparaciones con precisión^13,14,15,16. Por lo tanto, un mayor número de hebras de sutura del núcleo se relaciona con un aumento proporcional de las propiedades biomecánicas del tendón reparado. Sin embargo, hay una pérdida de viabilidad celular alrededor de los puntos de sutura, y el trauma de la sutura excesiva puede ser en detrimento del tendón, lo que puede comprometer la curación del tendón¹⁷. Las técnicas de sutura deben proporcionar una reparación geométrica fuerte que sea equilibrada y relativamente inelástica para minimizar la rotura del tendón después de la reparación. Además, la ubicación de la sutura y sus nudos deben colocarse estratégicamente para que no interfieran con el deslizamiento, el suministro de sangre y la curación hasta que se haya obtenido la acumulación de la fuerza adecuada^10,18.

Para establecer la viabilidad de asegurar un injerto ET más débil u otro material de injerto entre el tendón roto, hemos desarrollado una nueva técnica de sutura que puede descargar el injerto para que pueda madurar e integrarse gradualmente en el tejido huésped in vivo.

Protocolo

NOTA: El diseño del experimento y la aprobación ética se obtuvieron de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de UCL. Todos los experimentos se llevaron a cabo según la regulación del Ministerio del Interior y las directrices de la Ley de Animales (procedimiento científico) de 1986 con la legislación revisada de la Directiva Europea 2010/63/UE (2013). Los conejos fueron inspeccionados por un cirujano veterinario nombrado (NVS) periódicamente y dos veces al día por un oficial de cuidado y bienestar animal nombrado (NACWO) (según las pautas y regulaciones del Ministerio del Interior). No mostraron ningún signo de dolor hasta que fueron sacrificados.

1. Preparación del injerto de tendón de ingeniería tisular (ET)

1. Para fabricar el hidrogel de colágeno, agregue 4 ml de solución de colágeno monomérico tipo 1 de cola de rata (2.15 mg / ml en ácido acético al 0.6% con 0.2% p / v de proteína total) y 500 μL de 10x Medium Esencial Mínimo. Neutralice esto titulando contra hidróxido de sodio de 5 M y 1 M y agregue 500 μL de Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco.
2. Vierta 5 ml de esta solución en un molde de metal rectangular hecho a medida (33 mm × 22 mm × 10 mm, 120 g de peso) (Figura 1). Mantenga el molde en una incubadora de CO₂ a 37 °C y 5% de CO₂ durante 15 minutos para permitir el montaje de la matriz¹⁹.

2. Fabricación del injerto

1. Después de la polimerización, retire el hidrogel de colágeno del molde y colóquelo en un conjunto de compresión de plástico estándar (Figura 2A)¹⁹.
2. Coloque el hidrogel de colágeno entre dos láminas de malla de nylon de 50 μm y aplique una carga estática de 120 g (área de superficie total 7.4 cm^2,que es una presión equivalente a 1.6 kPa) durante 5 minutos para eliminar el líquido intersticial del hidrogel (Figura 2A). Use cuatro capas de papel de filtro para absorber el líquido descargado de los hidrogeles.
3. Utilice cuatro capas de geles comprimidos enrollados uno encima del otro (Figura 2B) y corte en segmentos de 15 mm (Figura 2C) para fabricar el ET.
   NOTA: En los experimentos se utilizaron conejos machos blancos de Nueva Zelanda de 16 a 25 semanas de edad.
4. Sedar animales con una dosis intramuscular (i.m.) de Hypnorm (0,3 mg/ml) y practicar la eutanasia administrando una sobredosis de pentobarbitona.
5. Inmediatamente después de la eutanasia, recorte el cabello en ambas patas traseras. Luego, con una cuchilla quirúrgica de tamaño 20, haga una incisión de 9 cm alrededor del área tibiofibular inferior para exponer el tendón tibial posterior (TP).
6. Con la cuchilla quirúrgica del mismo tamaño, extirpa los tendones TP lapina con una longitud promedio de 70 mm y manténgalos húmedos en PBS durante el proceso experimental para evitar el secado.

3. Desarrolló una nueva técnica de tenorrafia

NOTA: Las suturas (ver Tabla de Materiales)son no absorbibles y están hechas de un estereoisómero cristalino isotáctico de polipropileno, que es una poliolefina lineal sintética. Las suturas de enclavamiento del núcleo consistían principalmente en 3-0 y las suturas periféricas eran 6-0. Estas fueron las dos suturas principales utilizadas en todos los experimentos.

1. Con una cuchilla quirúrgica, corte el tendón TP en el punto medio. Extirpar un segmento de 15 mm del tendón desde la mitad del tendón y reemplazarlo con el injerto de colágeno ET(Figura 2D). Entrelazar la sutura 3-0 proximalmente lejos de los extremos del tendón nativo(Figura 3A).
2. Pase las suturas de núcleo 3-0 por encima de toda la longitud del injerto y enclave distalmente lejos del extremo cortado.
3. Asegure ambos extremos del ET al tendón nativo con 6-0 y suturas de funcionamiento continuo alrededor de la periferia acoplando dos extremos del tendón(Figura 3B). Esto se hace para que el injerto se pueda mover fácilmente sobre la sutura colocando tensión sobre el tendón nativo²⁰.
4. Después de asegurar la sutura como se describió anteriormente, asegúrese manualmente de que la tensión en las suturas sea adecuada y que no haya flacidez en la totalidad de la sutura.

Resultados

Hemos utilizado injertos de colágeno fabricados a partir de colágeno tipo I, ya que esta es la proteína predominante que se encuentra en el tendón. Constituye casi el 95% del colágeno total en el tendón; por lo tanto, el colágeno ha exhibido todas las propiedades ideales para imitar el tendón in vivo^21,22.

En este estudio, el colágeno tipo I utilizado s...

Discusión

En este estudio, se eligieron injertos de colágeno tipo I de ingeniería tisular como injerto de tendón porque el colágeno es un polímero natural y se utiliza como biomaterial para diversas aplicaciones de ingeniería de tejidos^27,28_. Además, el colágeno constituye el 60% de la masa seca del tendón, de la cual el 95% es colágeno tipo ^{1 21,29,30,}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat tail type 1 Collagen	First Link, Birmingham, UK	60-30-810
prolene sutures 6-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	EP8726H
prolene sutures 3-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	D8911
Whatman filter paper	SIGMA-ALDRICH	WHA10010155
Gibco DMEM, high glucose	Thermo Fisher Scientific	11574486
Nylon mesh	Plastok (Meshes and Filtration) Ltd.	NA