큰 힘줄 결함을 복구하는 조직 엔지니어링 콜라겐 이식과 새로운 테노르래피 봉합사 기술

요약

이 논문에서는 엔지니어링 콜라겐 이식으로 작성하여 최대 1.5cm의 힘줄 간격을 복구하기 위해 시험관 내 및 현장 프로토콜을 제시합니다. 이것은 접목이 숙주 조직으로 성숙할 때까지 기계적 부하를 취하는 변형된 봉합사 기술을 개발함으로써 수행되었다.

초록

힘줄 이식편을 가진 큰 힘줄 결함의 외과 관리는 기증자가 쉽게 확인하고 사용될 수 있는 사이트의 유한한 수가 있기 때문에, 도전적입니다. 현재, 이러한 간격은 힘줄 자동, 알로, 제노 또는 인공 이식으로 채워지지만, 이를 보호하는 임상 적 방법은 스케일 때문에 반드시 동물에게 번역할 수 있는 것은 아니다. 새로운 생체 물질을 평가하거나 콜라겐 유형 1로 구성된 힘줄 이식편을 연구하기 위해, 우리는 힘줄 끝에 맞춰 설계된 힘줄을 유지하는 데 도움이 변형 된 봉합사 기술을 개발했습니다. 이러한 이식편의 기계적 특성은 기본 힘줄보다 열등합니다. 엔지니어링 된 힘줄을 임상적으로 관련된 수리 모델에 통합하기 위해 조직 엔지니어링 힘줄 이식편을 오프로드하고 기계적으로 건전한 신힘줄이 형성될 때까지 생체 내에서 엔지니어링 된 힘줄의 성숙과 통합을 허용하는 전략이 채택되었습니다. 우리는 콜라겐 타입 1 조직 설계 힘줄 구조의 통합을 사용하여이 기술을 설명합니다.

서문

힘줄 파열은 외상성 열상 이나 힘줄의 과도한 하중과 같은 외장 요인으로 인해 발생할 수 있습니다. 힘줄 수리에 배치 외부 인장 력으로 인해, 간격은 필연적으로 대부분의 힘줄 수리 기술과 형성. 현재 힘줄 결함 /간격은 자동, 알로, 제노 또는 인공 접목으로 채워지지만 가용성은 유한하며 기증자 사이트는 이환율의 원천입니다.

콜라겐과 같은 천연 폴리머로부터 힘줄 이식편을 제조하는 조직 설계 접근법은 생체 적합성이라는 독특한 장점을 가지며 세포 통합을 용이하게 하는 중요한 세포외 매트릭스(ECM) 성분을 제공할 수 있다. 그러나, 세브릴라 정렬의 부족으로 인해, 엔지니어링 힘줄 (ET)의 기계적 특성은 기본 힘줄보다 열등하다. 약한 콜라겐의 기계적 특성을 높이기 위해 진공, UV 방사선 및 탈수열 처리^1하에서물리적 교차 연결과 같은 많은 방법이 사용되었습니다. 또한, 리보플라빈과의 화학적 교차 연결을 통해, 효소 및 비효소 적 방법을 통해 콜라겐 밀도를 증가시키고 체외^2,3에서콜라겐의 영의 계수를 증가시다. 그러나, 교차 연결 제체를 첨가함으로써, 콜라겐의 생체 적합성은 손상되고, 연구 결과에 따르면 기계적 특성의 33% 변경 및 세포 생존가능성^3,4,5의40% 손실을 나타냈다. 정렬 및 기계적 강도의 점진적 발생은 순환 적재^6을통해 얻을 수 있다; 그러나, 이것은 효율적으로 in vivo 7을획득할 수 있다.

ET가 생체 내에서 통합하고 화학적 변화 없이 강도를 획득하기 위해, 한 가지 방법은 안정화 봉합사 기술을 사용하여 약한 구조를 제자리에 유지하는 것입니다. 대부분의 힘줄 수리는 힘줄을 함께 유지하기 위해 봉합사 설계에 의존합니다. 따라서 이러한 기존 기술을 수정하면 논리적 해결 솔루션^8,9를제공할 수 있습니다.

1980 년대까지, 2 가닥 수리가 널리 사용되었지만, 최근 수술 문헌은 4 가닥, 6 가닥 또는 수리^10,11에8 가닥의 사용을 설명합니다. 1985년, 야만인은 6개의 앵커 포인트로 6가닥 봉합사 기술을 설명했으며, 4가닥 ^12를사용하는 Bunnell 봉합사 기술보다 훨씬 강했습니다. 또한, 8가닥 수리는 시체 및 현장 모델에서 다른 가닥보다 43% 강하지만, 이러한 수리는 기술적으로^{13,14,15,16을}정확하게 재현하기 어려워짐에 따라 널리 실행되지 않는다. 따라서, 더 많은 수의 코어 봉합사 가닥은 수리된 힘줄의 생체 역학적 특성의 비례증가에 관한 것이다. 그러나, 봉합점 주위의 세포 생존가능성이 상실되고, 과도한 봉합으로 인한 외상은^{힘줄치유(17)를}손상시킬 수 있는 힘줄의 손해에 가해질 수 있다. 봉합사 기술은 수리 후 힘줄 간격을 최소화하기 위해 균형과 상대적으로 탄력성이 강한 기하학적 수리를 제공해야 합니다. 또한, 합사 및 매듭의 위치는 적절한 강도의 발생이^10,18까지글라이딩, 혈액 공급 및 치유를 방해하지 않도록 전략적으로 배치되어야 한다.

파열된 힘줄 사이에 약한 ET 이식편 또는 기타 이식 물질을 확보할 수 있는 타당성을 확립하기 위해 이식편을 오프로드하여 성숙하고 서서히 숙주 조직에 생체 내에서 통합할 수 있는 새로운 봉합기술을 개발했습니다.

프로토콜

참고: UCL 기관 검토 위원회(IRB)에서 실험 설계 및 윤리적 승인을 받았습니다. 모든 실험은 홈 오피스의 규정및 동물의 지침에 따라 수행되었다 (과학 절차) 유럽 지침의 개정 법안1986 2010/63/ EU (2013). 토끼는 명명 된 수의외과 의사 (NVS)에 의해 정기적으로 그리고 하루에 두 번 명명 된 동물 관리 및 복지 책임자 (NACWO)에 의해 검사되었습니다 (홈 오피스의 지침 및 규정에 따라). 그들은 안락사될 때까지 고통의 흔적을 보이지 않았습니다.

1. 조직 설계 힘줄 (ET) 이식의 준비

1. 콜라겐 하이드로겔을 제조하려면 쥐 꼬리 콜라겐 1형 1단모름 콜라겐 용액(총 단백질의 0.2%w/v/v)과 10x 최소 필수 배지의 500 μL을 추가합니다. 5M 및 1M 수산화 나트륨에 대해 적발하여 이를 중화하고 덜벡코의 수정된 이글 매체(DMEM)의 500 μL을 추가합니다.
2. 이 용액의 5mL를 사용자 정의 내장 직사각형 금속 금형 (33mm × 22mm × 10mm, 120g 중량)에 붓습니다(그림 1). 금형을 CO₂ 인큐베이터에 37°C, 5%_CO2를 15분간 유지하여 매트릭스^{조립(19)을}허용한다.

2. 접목 의 제조

1. 중합 후, 금형에서 콜라겐 하이드로겔을 제거하고 표준 플라스틱 압축 어셈블리에 배치(도 2A)^19.
2. 콜라겐 하이드로겔을 50μm 나일론 메쉬 시트 2개 에 놓고 120g(총 표면적 7.4cm^2,1.6kPa에 해당하는 압력)을 5분간 적용하여 하이드로겔(그림2A)에서간질 유체를 제거한다. 4층의 필터 용지를 사용하여 하이드로겔에서 배출된 유체를 흡수합니다.
3. 서로 위에 압연 된 압축 젤 4 층(그림 2B)을사용하고 ET를 제조하기 위해 15mm 세그먼트(그림2C)로절단합니다.
   참고 : 16 - 25 주의 새로운 젤랜드 백인 남성 토끼가 실험에 사용되었습니다.
4. 자궁 내 (i.m.) 최면 (0.3 mg/mL)의 복용량으로 동물을 진정시키고 펜토바르비톤의 과다 복용을 투여하여 안락사하십시오.
5. 안락사 직후, 양쪽 뒷다리에 머리카락을 다듬습니다. 그런 다음 크기 20 수술 블레이드로, 티비알리스 후방 (TP) 힘줄을 노출하기 위해 열등한 경골 부위 주위에 9cm 절개를합니다.
6. 동일한 크기의 수술 블레이드로 평균 길이가 70mm인 라핀 TP 힘줄을 소비하고 건조를 피하기 위해 실험 과정에서 PBS에서 촉촉한 상태를 유지합니다.

3. 소설 테노르래피 기술 개발

참고: 봉합사(재료표참조)는 흡수가 불가능한 것으로 합성 선형 폴리올레핀인 폴리프로필렌의 이소성 결정 스테레오이소머로 만들어집니다. 핵심 연동 봉합사는 주로 3-0으로 구성되었고 주변 봉합사는 6-0이었다. 이들은 모든 실험에 사용된 2개의 주요 봉합사이었습니다.

1. 수술용 블레이드를 사용하면 중간점에서 TP 힘줄을 잘라냅니다. 힘줄의 중간에서 힘줄의 15mm 세그먼트를 소비하고 ET 콜라겐 이식편(도 2D)로대체한다. 네이티브 힘줄 끝에서 멀리 3-0 봉합사를 인터록(그림 3A).
2. 접목의 전체 길이 위에 3-0 코어 봉합사를 전달하고 절단 끝에서 분리됩니다.
3. ET의 양끝을 6-0으로 원어민 힘줄에 고정하고 두 개의 힘줄 끝(그림 3B)을결합하여 주변을 중심으로 연속 실행 봉합사를 연결합니다. 이것은 접목이 원어민^{힘줄(20)에}장력을 배치하여 봉합사에 쉽게 이동할 수 있도록 수행된다.
4. 위에서 설명한 바와 같이 봉합사를 확보한 후 봉합사의 장력이 적절하고 봉합사 전체에 노만함이 없음을 수동으로 확인합니다.

결과

우리는 I 형 콜라겐에서 제조 된 콜라겐 이식을 사용 했습니다., 이것은 힘줄에서 발견 하는 주요 단백질으로. 그것은 거의 구성 95 힘줄에 총 콜라겐의%; 따라서, 콜라겐은 생체 내 힘줄을 모방하기위한 모든 이상적인 특성을전시하고있다^21,22.

이 연구에서는, 사용된 타입 I 콜?...

토론

본 연구에서는, 조직 설계형 I 콜라겐 이식편은 콜라겐이 천연 중합체이기 때문에 힘줄 이식편으로 선택되었으며, 다양한 조직 공학 응용^{분야(27,28)를}위한 생체재료로_{사용되었다.} 또한, 콜라겐은 힘줄의 건조 질량의 60%를 구성하며, 그 중 95%는 1형 콜라겐 ^21,29,30,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat tail type 1 Collagen	First Link, Birmingham, UK	60-30-810
prolene sutures 6-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	EP8726H
prolene sutures 3-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	D8911
Whatman filter paper	SIGMA-ALDRICH	WHA10010155
Gibco DMEM, high glucose	Thermo Fisher Scientific	11574486
Nylon mesh	Plastok (Meshes and Filtration) Ltd.	NA