Новый метод наложения швов теноррафи с тканевым коллагеновым трансплантатом для восстановления больших дефектов сухожилий

Резюме

В этой статье мы представляем протокол in vitro и in situ для восстановления сухожильного промежутка до 1,5 см путем заполнения его инженерным коллагеновым трансплантатом. Это было выполнено путем разработки модифицированной техники шва для принятия механической нагрузки до тех пор, пока трансплантат не созреет в ткани хозяина.

Аннотация

Хирургическое лечение больших дефектов сухожилий с помощью сухожильных трансплантатов является сложной задачей, поскольку существует конечное количество участков, где доноры могут быть легко идентифицированы и использованы. В настоящее время этот пробел заполняется сухожильными ауто-, алло-, ксено- или искусственными трансплантатами, но клинические методы их защиты не обязательно переводятся на животных из-за масштаба. Чтобы оценить новые биоматериалы или изучить сухожильный трансплантат, состоящий из коллагена типа 1, мы разработали модифицированную технику шва, чтобы помочь поддерживать спроектированное сухожилие в выравнивании с концами сухожилий. Механические свойства этих трансплантатов уступают нативному сухожилию. Для включения инженерного сухожилия в клинически значимые модели восстановления нагрузки была принята стратегия разгрузки тканевого сухожильного трансплантата и обеспечения созревания и интеграции инженерного сухожилия in vivo до тех пор, пока не будет сформирован механически здоровый неотендон. Мы описываем эту технику, используя включение коллагенового типа 1 тканевой конструкции сухожилия.

Введение

Разрыв сухожилия может произойти из-за внешних факторов, таких как травматические рваные раны или чрезмерная нагрузка на сухожилие. Из-за внешних сил растяжения, приложенных к восстановлению сухожилий, неизбежно образуется зазор при большинстве методов восстановления сухожилий. В настоящее время дефекты сухожилий/промежутки заполняются ауто-, алло-, ксено- или искусственными трансплантатами, но их доступность конечна, а донорский участок является источником заболеваемости.

Тканеинженерный подход к изготовлению сухожильного трансплантата из природного полимера, такого как коллаген, имеет отличительное преимущество в том, что он биосовместим и может обеспечить жизненно важные компоненты внеклеточного матрикса (ECM), которые облегчают интеграцию клеток. Однако из-за отсутствия фибриллярного выравнивания механические свойства инженерного сухожилия (ET) уступают нативному сухожилию. Для повышения механических свойств более слабого коллагена использовались многие методы, такие как физическое сшивание под вакуумом, УФ-излучение и дегидротермические обработки^1. Также за счет химического сшивания с рибофлавином ферментативным и неферментативным методами повышается плотность коллагена и модуль Юнга коллагена in vitro^2,3. Однако при добавлении сшивающих агентов биосовместимость коллагена ставится под угрозу, так как исследования показали 33% изменение механических свойств и 40% потерю жизнеспособности клеток^3,4,5. Постепенное накопление выравнивания и механической прочности может быть получено за счет циклической нагрузки^6; однако это может быть эффективно приобретено in vivo⁷.

Для того, чтобы ET интегрировался in vivo и приобрел прочность без необходимости химического изменения, одним из подходов было бы использование стабилизирующей шовной техники для удержания более слабой конструкции на месте. Большинство ремонтов сухожилий полагаются на конструкцию шва, чтобы удерживать концы сухожилий вместе; следовательно, модификация этих существующих методов могла бы обеспечить логическое решение^8,9.

До 1980-х годов широко использовались 2-прядные ремонты, но в недавней хирургической литературе описывается использование 4 прядей, 6 прядей или даже 8 прядей в ремонте^10,11. В 1985 году Сэвидж описал методы 6-прядного шва с 6 точками крепления, и он был значительно сильнее, чем метод шва Баннелла, который использует 4 пряди ^12. Кроме того, 8-прядный ремонт на 43% прочнее, чем другие пряди в моделях cadaver и in situ, но этот ремонт не широко практикуется, так как становится технически трудно точно воспроизвести ремонт^13,14,15,16. Поэтому большее количество стержневых нитей шва связано с пропорциональным увеличением биомеханических свойств восстановленного сухожилия. Тем не менее, происходит потеря жизнеспособности клеток вокруг точек шва, и травма от чрезмерного наложения швов может быть в ущерб сухожилию, что может поставить под угрозу заживление сухожилия^17. Шовные методы должны обеспечивать сильное геометрическое восстановление, которое является сбалансированным и относительно неэластичным, чтобы свести к минимуму разрыв сухожилия после ремонта. Кроме того, расположение шва и его узлов должно быть стратегически размещено, чтобы они не мешали скольжению, кровоснабжению и заживлению до тех пор, пока не будет получено достаточное количество прочности^10,18.

Чтобы установить возможность обеспечения более слабого трансплантата ET или другого материала трансплантата между разорванным сухожилием, мы разработали новую технику шва, которая может разгрузить трансплантат, чтобы он мог созревать и постепенно интегрироваться в ткань хозяина in vivo.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Дизайн эксперимента и этическое одобрение были получены от Институционального наблюдательного совета UCL (IRB). Все эксперименты проводились в соответствии с постановлением Министерства внутренних дел и руководящими принципами Закона о животных (научная процедура) 1986 года с пересмотренным законодательством Европейской директивы 2010/63 / ЕС (2013). Кролики периодически осматривались названным ветеринарным хирургом (NVS) и два раза в день названным сотрудником по уходу за животными и благополучию (NACWO) (в соответствии с руководящими принципами и правилами Министерства внутренних дел). Они не проявляли никаких признаков боли, пока их не усыпили.

1. Подготовка тканеинженерного сухожильного (ET) трансплантата

1. Для изготовления гидрогеля коллагена добавьте 4 мл мономерного коллагена типа 1 крысиного хвоста (2,15 мг/мл в 0,6% уксусной кислоты с 0,2% мас./об.общего белка) и 500 мкл 10x Минимальной необходимой среды. Нейтрализуйте это, титруя против гидроксида натрия 5 M и 1 M и добавьте 500 мкл модифицированной среды Dulbecco Eagle Medium (DMEM).
2. Налейте 5 мл этого раствора в специально построенную прямоугольную металлическую форму (33 мм × 22 мм × 10 мм, вес 120 г)(рисунок 1). Храните форму в инкубаторе CO₂ при 37 °C и 5% CO₂ в течение 15 минут, чтобы обеспечить сборку матрицы^19.

2. Изготовление трансплантата

1. После полимеризации извлекают гидрогель коллагена из формы и помещают в стандартный пластиковый компрессионный узел(Рисунок 2А)^19.
2. Поместите коллагеновый гидрогель между двумя листами нейлоновой сетки по 50 мкм и приложите статическую нагрузку 120 г (общая площадь поверхности^{7,4 см2,}что является давлением, эквивалентным 1,6 кПа) в течение 5 минут для удаления интерстициальной жидкости из гидрогеля(рисунок 2А). Используйте четыре слоя фильтровальной бумаги для поглощения сбрасываемой жидкости из гидрогелей.
3. Используйте четыре слоя спрессованных гелей, свернутых друг на друга(рисунок 2B)и разрезанных на сегменты по 15 мм(рисунок 2C),чтобы изготовить ET.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах использовались белые самцы новозеландских кроликов в возрасте 16 - 25 недель.
4. Седативные животные с внутримышечной (i.m.) дозой Гипнорма (0,3 мг/мл) и усыпляют путем введения передозировки пентобарбитона.
5. Сразу после эвтаназии подстригите волосы на обеих задних лапах. Затем с помощью хирургического лезвия размером 20 сделайте разрез 9 см вокруг нижней большеберцовой области, чтобы обнажить заднее сухожилие большеберцовой кости (TP).
6. С помощью хирургического лезвия того же размера иссекайте лапинные сухожилия TP средней длиной 70 мм и сохраняйте влажность в PBS во время экспериментального процесса, чтобы избежать высыхания.

3. Разработал новую технику теноррафии

ПРИМЕЧАНИЕ: Швы (см. Таблицу материалов)являются нерассасывающимися и изготовлены из изотаксического кристаллического стереоизомера полипропилена, который представляет собой синтетический линейный полиолефин. Основные взаимосвязанные швы в основном состояли из 3-0, а периферические швы были 6-0. Это были два основных шва, используемых во всех экспериментах.

1. Хирургическим лезвием отрежьте сухожилие ТП в средней точке. Вырежьте 15-миллиметровый сегмент сухожилия из середины сухожилия и замените его коллагеновым трансплантатом ET(рисунок 2D). Заблокируйте шов 3-0 проксимально от родных сухожильных концов(рисунок 3A).
2. Пройдите 3-0 стержневых швов по всей длине трансплантата и сцепитесь дистально от разрезанного конца.
3. Закрепите оба конца ET к нативному сухожилию с помощью 6-0 и непрерывных бегущих швов по периферии путем соединения двух концов сухожилия(рисунок 3B). Это делается для того, чтобы трансплантат можно было легко перемещать на шов, накладывая напряжение на родное сухожилие^20.
4. После закрепления шва, как описано выше, вручную убедитесь, что натяжение на швах является уместным и что нет вялости во всем шве.

Результаты

Мы использовали коллагеновые трансплантаты, изготовленные из коллагена I типа, так как это преобладающий белок, обнаруженный в сухожилии. Он составляет почти 95% от общего количества коллагена в сухожилии; следовательно, коллаген обладает всеми идеальными свойствами д...

Обсуждение

В этом исследовании тканевые коллагеновые трансплантаты типа I были выбраны в качестве сухожильного трансплантата, потому что коллаген является природным полимером и используется в качестве биоматериала для различных применений тканевой инженерии^27,28....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat tail type 1 Collagen	First Link, Birmingham, UK	60-30-810
prolene sutures 6-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	EP8726H
prolene sutures 3-0	Ethicon Ltd, Edinburgh, U.K.	D8911
Whatman filter paper	SIGMA-ALDRICH	WHA10010155
Gibco DMEM, high glucose	Thermo Fisher Scientific	11574486
Nylon mesh	Plastok (Meshes and Filtration) Ltd.	NA