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Erratum Notice

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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el desarrollo de corazón en pez cebra en 4 dimensiones (4D). Imagen 4-D, mediante microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM), toma 3 dimensiones (3D) imágenes en el tiempo, reconstruir el corazón en desarrollo. Mostramos cualitativamente y cuantitativamente que esa tensión de esquileo activa endocárdica muesca señalización durante el desarrollo de la cámara, que promueve la trabeculación cardiaca.

Resumen

Las fuerzas hemodinámicas experimentadas por el desarrollo cardíaco corazón influencia, especialmente trabeculación, que forma una red de ramificación crecimientos del miocardio. Programa genético de defectos en la muesca de señalización cascada participan en defectos ventriculares como cardiomiopatía no compactación Ventricular izquierda o síndrome de corazón izquierdo hipoplásico. Mediante este protocolo, puede determinarse que tensión de esquileo conducido trabeculación y señalización Notch están relacionados con uno otro. Usando microscopía de fluorescencia de luz-hoja, visualización del corazón de pez cebra en desarrollo era posible. En este manuscrito, se evaluó si las fuerzas hemodinámicas modulan el inicio de la trabeculación vía de señalización Notch y por lo tanto, influyen en la función contráctil se produce. Cualitativa y cuantitativa del esquileo tensión análisis, 4-D (3-D + tiempo) imágenes fueron adquiridas durante la morfogénesis cardiaca de pez cebra, y de microscopía de fluorescencia de luz hoja integrada con 4 D sincronización capturado el movimiento ventricular. Viscosidad de la sangre se redujo gata1a- morfolino oligonucleótidos (MO) micro-inyectable para disminuir la tensión de esquileo, de tal modo, abajo-regulación de la muesca señalización y atenuando trabeculación. La inyección de mRNA de Nrg1 con gata1a MO rescatado genes relacionados con la muesca para restaurar trabeculación. Para confirmar la tensión de esquileo por señalización Notch influencias trabeculación, contracción de cardiomiocitos más fue detenida por tnnt2a-MO para reducir las fuerzas hemodinámicas, por lo tanto, abajo-regulan genes de la blanco del muesca para desarrollar no trabeculada miocardio. Por último, corroboración de los patrones de expresión de genes sensibles a la tensión de esquileo de muesca se realizó sometiendo las células endoteliales a flujo pulsátil. Así, la microscopía de luz-hoja 4-D al descubierto las fuerzas hemodinámicas subyacentes de señalización Notch y trabeculación con importancia clínica a la cardiomiopatía no compactación.

Introducción

Fuerzas biomecánicas, como hemodinámica tensión de esquileo, están involucradas íntimamente en la morfogénesis cardiaca. En respuesta a las fuerzas de corte hemodinámica, surcos y crestas miocardio desarrollan en una red trabecular ondulatorio en alineación con la dirección de la tensión de esquileo en el auriculoventricular (AV) válvula1. Trabeculación cardiaca es necesario aumentar la función contráctil y masa miocárdica2. Mutaciones en vías de señalización Notch dan lugar a defectos congénitos del corazón en los seres humanos y otros vertebrados3. Por ejemplo, gata1a4 y tnnt2a5 morfolino oligonucleótidos (MO) han demostrado reducir la eritropoyesis, mientras aumenta el de mRNA (EPO) la eritropoyetina6 y7 de Isoproterenol (ISO) rojos de la sangre las células y la frecuencia cardíaca respectivamente y por lo tanto la pared tensión de esquileo (WSS). Además, señalización de ErbB2, aguas abajo de la muesca, promueve la proliferación de los cardiomiocitos y la diferenciación para generar la fuerza contráctil, que a su vez activa la muesca señalización8,9. Se sugiere que tensión de esquileo gobierna conducido trabeculación ventricular desarrollo de señalización de Notch. Actualmente, hay muchos estudios que intentan comprender aún más los eventos programación genéticos conduce a cardiopatía congénita (CHD) de defectos10,11,12, pero muy poco están investigando cómo fuerzas mecánicas influyen en el centro de formación.

Para investigar las fuerzas mecánicas actuando sobre el endocardio, una observación más cercana durante el período de desarrollo debe aplicarse. Sin embargo, es difícil obtener imágenes de buena calidad en vivo a las muestras debido a la injerencia de microscopía tradicional13. Para observar el desarrollo en el tiempo dentro de una muestra, física de seccionamiento y coloración, por lo tanto, deben ocurrir13,14,15. Aunque la microscopía confocal es ampliamente utilizada a la imagen de la estructura 3D de las muestras14,16, adquisición de estos sistemas de imagen todavía está limitado por bajas velocidades de barrido.

Microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM) es una única técnica de imagen que permite visualizar en vivo eventos dinámicos con largos de distancia de trabajo13. Esta técnica utiliza un microscopio fluorescente de luz de hoja a la sección ópticamente una muestra17. Debido a la iluminación de solo una hoja fina de la luz sobre la muestra, hay una reducción en el blanqueo de foto y foto toxicidad13,18. El gran campo de visión y distancia de funcionamiento larga permite muestras grandes a permanecer intacto como imagen13,14,17. La ampliación baja permite un área más grande al ser reflejada, mientras que la larga distancia de trabajo permite para que muestras más gruesas ser reflejada sin comprometer la relación señal a ruido. Muchos grupos han utilizado LSFM a imagen todo embriones17, cerebros de14,18, músculos y corazón19 entre otros tejidos, mostrando los diversos tipos de muestras que pueden ser reflejadas.

Aunque investigaciones previas demostraron fuerza hemodinámica reducida por oclusión de las vías de entrada o salida del corazón del pez cebra, la información es exclusivamente cualitativa. Traduce en una sala tercera anormal, bucle cardiaca disminuida y válvula deteriorada formación20. Las imágenes de 4D LSFM dan una nueva perspectiva en la manera de que la cizalla hemodinámica las fuerzas afectan el desarrollo del tejido cardiaco. Estas fuerzas mecánicas pueden activar moléculas de señalización sensibles a la fuerza e inducir la formación de las crestas trabeculares. Por el aspecto de mayor tiempo de proyección de imagen de 4-D, uno es capaz de seguir los cambios en el desarrollo en tiempo real, que podría conducir a nuevas revelaciones que habían pasado desapercibidas anteriormente. El pez cebra es un modelo ideal para la proyección de imagen porque los científicos pueden observar un animal vertebrado todo versus sólo interacciones de célula. Oxígeno puede difundir también por el embrión completo, que permite el desarrollo que se produzca sin dependiendo del sistema vascular, a diferencia de en el desarrollo de mamífero. A pesar de que el corazón del pez cebra carece de los órganos pulmonares, que requieren un corazón de cuatro cámaras, hay un gran número de genes cardíacos que se conservan entre el pez cebra y los seres humanos21.

En este manuscrito, se describe cómo utilizar microscopía de fluorescencia de la hoja de luz a la imagen de las trabéculas en desarrollo en el corazón del pez cebra bajo circunstancias diversas. En primer lugar, la inyección de gata1a4 o tnnt2a5 MOs utilizaron para baja la viscosidad de la sangre y por lo tanto WSS. Luego se registró la morfología del corazón. En un grupo separado de los peces, aumentamos el WSS mediante la administración de EPO mRNA6 o isoproterenol7 y observa los resultados. También se realizó un estudio de la célula con las tasas de flujo pulsátil u oscilatoria diferente. Después de cada grupo de imágenes, encontramos que WSS percibido por el endocardio mediante muesca señalización inicia trabeculación.

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Protocolo

Los métodos siguientes se realizaron en cumplimiento de protocolos de UTA y UCLA IACUC. Estos grupos experimentales fueron utilizados con transgénicos Tg(cmlc2:gfp), los mutantes wea (atrio débil) o clo (cloche) : (a) tipo salvaje (WT) control, (b) gata1a MO y (c) tnnt2a MO inyecciones (tabla 1).

ModeloNombreGenes modificadosFenotipoReferencia
ControlTipo salvajeNingunoN / A
TG(cmlc2:GFP)Cadena ligera de la miosina cardiacaFluorescencia verde específicamente expresado en el miocardio34
Tensión de esquileo de la pared menorMutante de atrio débil (wea)Cadena de heacy atrio específicos miosinaAtrio no contrato, compacto grosor de la pared miocárdica, lumen estrecho, ventrículo, aurícula dilatada,37
Mutante de Cloche (clo)N / ARetiro completo del endocardio, unaturally atrio grande con pequeño ventrículo, colchones cardiaca inexistente41
gata1a MO gata1a Anemia por falta de glóbulos rojos4
tnnt2a MOtnnt2a39
Tensión de esquileo de la pared mayor MRNA de la EPONingunoPolicitemia severa, aumento de circulación de las células de la sangre, aumenta la viscosidad6
IsoprotenerolNingunoAumento de la frecuencia cardiaco7

Tabla 1: Descripción de pez cebra. Definiciones y descripciones de pez cebra utilizados en experimentos.

1. estudiar la configuración

  1. Preparar Nrg1 y EPO mRNA para rescate de trabeculación.
    1. Obtener cDNA humano Nrg1 y amplificación de un plásmido donante.
      Nota: El cDNA humano Nrg1 fue dotado de William Talbot de la Universidad de Stanford.
      1. Sacar los reactivos necesarios y materiales, es decir PCR mastermix (almacenados en-20 ° C), iniciadores (ver tabla 2) (almacenados en-20 ° C), una placa PCR (almacenado a temperatura ambiente) y una pipeta de 20 μL (almacenado a temperatura ambiente). Ver la tabla de materiales para productos de ejemplo.
        figure-protocol-2955
        Tabla 2: Cartillas para Nrg1 clonación.
      2. Preparar el mastermix para cada cartilla en triplicado usando la pipeta de 20 μL. 1 conjunto de triplicados, uso 37.5 μL del mastermix, 3 μL de agua libre de ADN, 4.5 μL de cebador. Para más de triplicado, simplemente multiplique por el número de muestras.
      3. Diluir la solución de trabajo del cDNA humano Nrg1 (concentración de 20 ng/μg) en la franja de imprimación con agua libre de ADN por lo que hay 10 μL por pozo por muestra total.
        Nota: Asegúrese de que cada solución en el paso 1.1.1 está distribuido uniformemente. Para ello, mezclar cada solución mediante pipeteo arriba y abajo. Para evitar la contaminación cruzada, utilizar una pipeta para sólo una muestra.
      4. Alícuota del cDNA Nrg1 con la pipeta de varios canales de 10 μL a deseado pozos en la placa de la polimerización en cadena.
      5. Añadir 14,5 μL del mastermix a cDNA en los pozos. Aplicar una cubierta pegajosa a la placa de la polimerización en cadena para sellar los pozos y colocar en la máquina de la polimerización en cadena.
      6. En marcha la máquina de la polimerización en cadena y garantizar que el ciclo llegue a temperaturas adecuadas según las enzimas y los cebadores utilizados.
    2. Clon de cDNA Nrg1 en el plásmido pCS2+ en los sitios BamHI y EcoRI usando exceso enzimas BamHI y EcoRI para cDNA está ligado en los plásmidos.
      1. Mezclar el Nrg1 cDNA con el donante plásmido pCS2+, disponible en el mercado principal mezcla solución y cartillas (tabla 2).
        Nota: El volumen de reacción total debe ser 50 μL con 25 μL de la mezcla principal, 3 μL de primers y 1 μL del plásmido de donante de 20 ng/μL con cDNA Nrg1 .
      2. Coloque la mezcla del paso 1.1.2.1 en la máquina de la polimerización en cadena y establezca los parámetros para cumplir con las siguientes especificaciones: 98 ° C por 10 s, 55 ° C de 5 y 15 s y 72 ° C durante 5 s/kb.
      3. Purificar el producto PCR utilizando un kit de purificación siguiendo las instrucciones del fabricante. Responsables del producto en 50 μL de tampón de elución.
      4. Digerir el producto PCR purificado y 5 μg de pCS2+ con BamHI y EcoRI por separado en 37 ° C durante 2 h en un volumen de 200 μL de la reacción. Purificar la digestión resultante con un kit comercial y eluir en 20 μL y 100 μL de Tris-HCl (pH 8,5), respectivamente.
      5. Ligar 4 μL de cDNA Nrg1 y 2 μL de la pCS2 digerido+ plásmido en 25 μL reacción con 1 μL de un catalizador de ligasa a 16 ° C durante la noche.
        Nota: El procedimiento puede detener aquí por incubación durante la noche.
      6. Utilice 2 μL de la solución de la ligadura del paso 1.1.2.5 y transformar en 50 μL de células de las bacterias e. coli adecuadas para la clonación (véase Tabla de materiales).
    3. Confirman que la transformación llevó a cabo por proyección que el Nrg1 cDNA clones usando PCR. Elegir al azar clones y añadir a una solución de iniciadores específicos, polimerasa y trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTPs).
      Nota: Los controles fueron el vector (pCS2+) con y sin el inserto (cDNA humano). No demasiado grande de una colonia porque las bacterias excesiva pueden inhibir la PCR.
      1. Recoger 8 colonias de la pCS2 transformación y pantalla+-Nrg1 clones usando los cebadores PCR de tabla 2.
      2. Cultura un clon con Nrg1 cDNA para aislar la pCS2+-Nrg1 plasmid DNA. Inocular con 100 μL de la bacteria e. coli con pCS2+-plásmido Nrg1 en 100 mL de medio LB y cultura agitando (160-225 RPM) a 37 ° C.
    4. Transfectar pCS2 purificada+-plásmido Nrg1 en HEK-293 células en una placa de 6 pozos utilizando un reactivo de transfección comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante.
    5. 24 h después de la transfección, lyse las células usando un tampón de lisis y ejecutar a través de un gel de SDS-PAGE, transferencia a una membrana de gel y luego la mancha con anti-Nrg1 anticuerpo22. Verificar la expresión de proteína Nrg1 mediante un Western Blot.
      Nota: El control es un pCS2 vacío+ plásmido. Puede hacer una pausa aquí si transferencia de membrana de gel se presenta durante la noche.
    6. Sintetizar mRNA Nrg1 utilizando un producto comercial similar a la de la Tabla de materiales y seguir las instrucciones del fabricante.
      1. Tomar 5 μL de la pCS2+-Nrg1 ADN de la bacteria aislada cultura y digerir con NotI en una reacción de 200 μL por 2 h a 37 ° C para alinear el plásmido.
      2. Purificar el plásmido linearizado con un kit comercial y eluir en 20 μL de Tris-HCl (pH 8.5).
      3. Conducta en vitro la transcripción con un kit comercial de aislamiento de RNA en una reacción de 20 μL con 5 μL del plásmido lineal siguiendo las instrucciones del fabricante.
      4. Añadir que el en vitro transcritos Nrg1 a 350 μL de tampón de lisis de RNA y luego purificar con un kit de aislamiento de RNA. Eluir el RNA en 60 μL de Tris-HCl (pH 8.5).
      5. Medir la concentración de RNA y almacenar a-80 ° C para su uso futuro.
    7. Siga los pasos 1.1.6.1 - 1.1.6.5 encima para el cDNA EPO y preparación de ARNm pero clon cDNA en el plásmido pCS2 + en EcoRI y XhoI sitios en lugar de otro.
  2. Inyecte morfolino en pez cebra
    1. Diseño23 las inyecciones MO utilizando una herramienta en línea (Tabla de materiales) contra la secuencia ATG de gata1a4 (5-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3 ') y tnnt2a5 (5-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3 ').
    2. Agregar por separado gata1a y tnnt2a MO al agua libre de nucleasa para hacer las concentraciones finales de 8 ng/nL y 4 ng/nL, respectivamente. Repita con el mRNA de la EPO con una concentración final de 20 pg/nL. Asegúrese de que el volumen final es de 1 mL.
    3. Inyectar 1 nL de la ng/nL 8 de gata1a MO y 1 nL de los 4 ng/nL del tnnt2a MO en embriones de pez cebra independiente en el 1 a la fase de 4 células para reducir la tensión de esquileo (WSS) de pared ventricular24. Para aumentar la WSS, inyectar 1 nL de 20 pg/nL de EPO mRNA6 en los embriones de pez cebra en la etapa de 1 a 4 células.
  3. Tratar químicamente el pez cebra para inhibir la trabeculación
    1. Con una pipeta de 20 mL, diluir 10 mg/mL AG1478 en DMSO 1% en medio de la E3 a una concentración final de 5 μM a 30 hpf en un tubo de 15 mL. Como control, tratar cada pescado con DMSO 1% solamente.
    2. Añadir éster del t-butil N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine (DAPT) en DMSO 1% (100 μM) al medio de E3 en un tubo de 15 mL para inhibir la señalización de Notch en 40 hpf en una manera similar. Como control, tratar con DMSO 1% solamente.

2. técnicas de imagen

  1. 4-D cardiaca LSFM proyección de imagen con algoritmo de sincronización
    1. Tomar imágenes 2-D del embrión de pez todo sobre múltiples cardiaco a ciclos con los siguientes pasos (figura 1). Asegúrese de que el espesor de la hoja de luz es de aproximadamente 5 μm. Tomar 500 marcos de x-y con un tiempo de exposición de 10 ms. sistema de la exploración de z a 1 μm para el muestreo digital sin pérdidas según el muestreo de Nyquist principio25.
      1. Agregar 1 g de agarosa a 100 mL y calentar hasta que se disuelva la agarosa todos para crear un gel de agarosa al 1% (p/v). Cargar un tubo de plástico pequeño con el embrión y con una pipeta de 20 μL de la agarosa y fijarlo en el escenario.
      2. Abra el software de visualización de imagen y haga clic en Live para ver la vista en vivo de la muestra. Ajustar el objetivo usando la perilla para que la muestra está en foco. Del mismo modo, mover el escenario para que la vista en vivo de la muestra muestra la parte superior del embrión.
      3. Tomar imágenes 500 veces durante 5 s a 10 aumentos, utilizando software26 del microscopio.
      4. Mover el escenario utilizando el motor a una nueva capa (1 μm en el eje z) y repetir el procedimiento por imágenes.
      5. Repita los 2 pasos anteriores hasta que todo corazón está plenamente reflejada.
    2. Haciendo caso omiso de las imágenes del primer y último ciclo cardiaco para asegurar integridad de datos. Encontrar el período del ciclo cardíaco haciendo coincidir las imágenes que fueron tomadas en el mismo momento en el ciclo cardiaco, pero en diferentes períodos. Utilice la siguiente ecuación desarrollada para encontrar el período:
      figure-protocol-12252(1)
      donde D es la función de coste utilizada para el montaje de una hipótesis del período, m la imagen capturada, τ' el tiempo la imagen fue capturada, zk el índice de la dirección z de la imagen, xm es la Vector de los índices del pixel, y T' es la hipótesis de periódicos.
    3. Utilice la siguiente ecuación para encontrar el desplazamiento relativo entre dos imágenes en etapas similares:
      figure-protocol-12811(2)
      donde Qk', k denota una función de costo para el cambio relativo, R es la vecindad espacial posible, L es el tiempo total de la captura de la imagen, x es la z pixel índice, zk y k' son los cortes de primera y segunda de la dirección de z, t es el tiempo, y s es la hipótesis de cambio relativo.
    4. Convertir el cambio relativo a cambio absoluto con respecto a la primera imagen y resolver la ecuación lineal que utilizan el enfoque pseudo inverso, para encontrar la relación absoluta para alinear la siguiente sección de imágenes como se describió anteriormente27.
    5. Las imágenes 4-D finales se procesaron utilizando el software de procesamiento de imagen (Tabla de materiales).
      1. Apilar imágenes 2-D en 3-d
        1. Abra un software de procesamiento de imágenes comerciales.
        2. Haga clic en datos abiertos.
        3. Seleccione todas las imágenes que se apilan en 3-d > haga clic en carga.
        4. Añadir en el tamaño del voxel de 0.65 x 0.65 x 1 > haga clic en Aceptar.
        5. Haga clic en el cuadro Vista de reformación para visualizar la imagen 3D.
        6. Haga clic en el cuadro azul slice_1.tiff > seleccione visualización > seleccionar Volren.
        7. Haga clic en Editar > seleccionar Opciones > seleccionar Editar mapa de colores.
        8. Ajustar el color utilizando las casillas en rojo > haga clic en Aceptar.
      2. Conversión de 3D a 4D
        1. Haga clic en "archivo > abrir datos de Series temporales.
        2. Seleccione el TIFF 3D que se acaba de hacer > haga clic en carga.
        3. Entrar en el mismo tamaño de voxel como antes.
        4. Haga clic con el botón derecho el cuadro azul slice_1.tiff > seleccione "Display" > seleccionar Volren.
        5. Haga clic en Editar > seleccionar Opciones > seleccionar Editar mapa de colores. Ajustar el color utilizando las casillas de > haga clic en Aceptar.
        6. Haga clic con el botón derecho Control de Series de tiempo > Movie maker , haga clic en > Pulse el botón Play para ver la película.
        7. Agregar un nombre de archivo, tamaño, velocidad de fotogramas, calidad igual a 1, tipo monoscópicas > haga clic en aplicar
        8. Exportar el vídeo. Abrir el video en un software apropiado.

3. Análisis de qRT-PCR

  1. Pez cebra aislamiento de RNA para cuantificar los ligandos de la muesca, receptores, del corazón y destino expresiones de genes
    1. Sacrificar el pez cebra sometiéndolos a una sobredosis de Metanosulfonato metilato28,29. Utilizando un protocolo descrito previamente de30, el corazón del pez cebra se suprimida y preparado para el aislamiento de RNA.
    2. Aislar el RNA total y sintetizar el cDNA usando el cDNA síntesis kit siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Diseño de los cebadores PCR de los ligandos de la muesca Jag1, Jag2, Dll4, receptor Notch1by señalización relacionados con genes Nrg1 y ErbB2. Consulte la tabla 3 para los iniciadores que utilizamos.
    4. Añadir los cebadores de paso 3.1.3, el mRNA aislado de paso 3.1.2 y un comercial mastermix a la placa de la polimerización en cadena. Ejecute la qRT-PCR en las temperaturas adecuadas y los tiempos según las enzimas utilizadas. Normalizar los resultados a la α-actina de pez cebra.
      Nota: Se calcula para calcular los niveles de expresión de cada uno de los ligandos, receptores y genes.

4. in vitro de la célula endotelial aórtica humana (HAEC) experimentos

  1. Modelo dinámico de tensión de esquileo
    1. Células en cultivo HAEC con HAEC medios de cultivo. Una vez completamente confluente, exponer las células a flujo laminar y flujo pulsátil de 23 x 10-5 N a razón de 1 Hz durante 24 h.
      1. Calentamiento de EC media/DMEM 10% FBS en un agua de baño durante 20 minutos.
      2. Recuperar las células HAEC de tanque de nitrógeno líquido y coloque el frasco en baño María hasta que se derritan.
      3. Usando una pipeta μL 1.000, eliminar las células descongeladas y poner en un tubo de 15 mL con 3-5 mL de medio. Centrifugue la solución celular 53 x g durante 3 minutos.
      4. Aspirar la solución de y agregar suficiente medios para un volumen total de 10 mL. Añadir la solución de células a un frasco estéril de T75, tapa el matraz y distribuir las células uniformemente en la parte inferior de la placa.
      5. Marcar el frasco con las iniciales, fecha, tipo de células y número de paso. Incube el frasco a 37 ° C, 5% CO2, hasta que las células son 80% confluente. No olvide cambiar el medio cada 2-3 días.
      6. Usando una bomba comercial, acople el tubo al matraz y establecer los parámetros mencionados en el paso 4.1.131,32,33.
    2. Añadir a GI254023X a 50 mL de medio de HAEC a una concentración final de 5 μM por 30 min.
    3. Con el GI254023X premezclado ADAM10 inhibidor que suprime la muesca señalización, realizar el mismo flujo laminar o flujo pulsátil experimentos como en 4.1.1.
    4. Cuantificar los ligandos de la muesca (Jag1, Jag2 y Dll4) y genes de la blanco de muesca (peludo y potenciador de split [Hes]) mediante qRT-PCR para cuatro grupos de muestras HAEC (flujo laminar, flujo laminar + GI254023X, flujo pulsátil, flujo pulsátil + GI254023X) se ha descrito anteriormente32.

5. rescate y sobreexpresión de la señalización de Notch

  1. Inyectar 1 nL del mRNA Nrg1 preparado a una concentración de 5 pg/nL (del paso 1.1.6) en la etapa de 1 a 4 células con la gata1a MO para sobreexpresar muesca target genes24.
  2. Inyectar 1 nL del mRNA Nrg1 en wea mutante en forma similar24.
  3. Doble de la concentración de mRNA Nrg1 (10 pg/nL) e inyectar24 1 nL en pez cebra para observar la morfología ventricular.
  4. Inyectar 1 nL de los 20 pg/nL de EPO mRNA6 en los embriones de pez cebra en la etapa de 1 a 4 células para aumentar la hematopoyesis para WSS ventricular previamente mostrado24.
  5. Inyectar 1 nL de Isoproterenol de 50 μM7, que aumenta el índice de contractilidad, al medio del E3 para 24 h mientras el pez cebra se cultivan como anteriormente se indica24.
  6. Realizar la proyección de imagen de LSFM 4-D para cada grupo. Siga las instrucciones en pasos 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. cuantificación del acortamiento fraccional y el volumen de cambio con el tiempo

  1. Realizar la proyección de imagen de LSFM 4-D para cada grupo de 50, 75 y 100 hpf. Siga las instrucciones en pasos 2.1.1-2.1.5.2.8. Dividir cada imagen por lo que cada uno tiene 600 nodos para la replicación de la propuesta de la pared cardiaca.
  2. Medir el cambio en el diámetro del ventrículo durante la diástole y la sístole con la siguiente fórmula:
    figure-protocol-20873(3)
    Carga de imágenes 3-d ventriculares en cada 0.1 s con software de visualización y medir el volumen.
  3. Parcela el cambio de volumen con el tiempo para cada grupo experimental 75 hpf y 100 hpf.

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Resultados

LSFM fue utilizado en este manuscrito para adquirir 2-D y 3-d imágenes de alta resolución. Como se ve en la figura 1A y 1B, el lente de la iluminación indica la ficha técnica de iluminación en la muestra. Debido a la delgadez de la ficha técnica de iluminación, se ilumina solamente un solo plano. El objetivo de la detección es colocada perpendicular a la lente de la iluminación y se centra en el plano iluminado (...

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Discusión

En este protocolo, hemos demostrado que la proyección de imagen 4-D puede utilizarse para rastrear el desarrollo de una red trabecular en respuesta a cambios en las fuerzas biomecánicas. En particular, la tensión de corte experimentado por las células endoteliales inicia la muesca señalización cascada, que a su vez promueve la trabeculación. En este manuscrito, hemos demostrado que (1) gata1a MO inyección disminuyó la hematopoyesis y por lo tanto redujo la tensión de esquileo de la pared, (2) tnnt2...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a William Talbot de la Universidad de Stanford para proporcionar al ser humano Nrg1 cDNA y Deborah Yelon de UCSD para proporcionar la WEA mutantes. Los autores también desean agradecer a Cynthia Chen por ayudar con la adquisición de la imagen. Este estudio fue apoyado por subvenciones de NIH HL118650 (a T.K. Hsiai), HL083015 (a T.K. Hsiai), HD069305 (a Carolina del norte Chi y T.K. Hsiai.), HL111437 (a T.K. Hsiai y Chi de Carolina del norte), HL129727 (a T.K. Hsiai), T32HL007895 (a R.R. Sevag Packard), HL 134613 (a V. Messerschmidt) y Universidad de Texas sistema estrellas financiación (J. Lee).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Clontech Hifi PCR pre-mix Takara 639298PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNAGift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USAN/AUsed for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855201PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+GE HealthPlasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit  Clontech740609.25DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase Clontech2011APCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cellsClontech636763E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagentLife Technologies11668027Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kitInvitrogenAM1340Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8GeneToolsN/ASoftware for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNACreative BiogeneCDFH006026Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich T4182ErbB inhibitor
1.3.1
E3 mediumTo grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich D5942γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose Sigma-Aldrich A9539Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS cameraHamamatsu PhotonicsC11440-42UUsed to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira SoftwareFEI SoftwareN/AVisualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate Sigma-Aldrich 886-86-2Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708890Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifugeEppendorf05-400-005Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich 260264-93-5ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochlorideSigma-Aldrich I5627Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLABMathworksN/ACardiac mechanics analysis

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

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