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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar desenvolvendo corações no zebrafish em 4 dimensões (4D). Imagem 4-D, através de microscopia de fluorescência de luz-folha (LSFM), tem 3-Dimensional (3D) de imagens ao longo do tempo, para reconstruir corações em desenvolvimento. Nós mostramos qualitativa e quantitativamente que a tensão de cisalhamento ativa endocárdico entalhe sinalização durante o desenvolvimento da câmara, que promove trabeculação cardíaca.

Resumo

As forças hemodinâmicas experimentadas pelo coração influência cardíaca desenvolvimento, especialmente trabeculação, que forma uma rede de Humanisme ramificação do miocárdio. Programa genético defeitos no entalhe sinalização cascata estão envolvidos em defeitos ventriculares como cardiomiopatia de Non-compactação Ventricular Esquerda ou hipoplasia do síndrome do coração esquerdo. Usando este protocolo, que seja determinado que tensão de cisalhamento conduzido trabeculação e sinalização Notch estão relacionados um ao outro. Visualização do desenvolvimento do zebrafish coração usando microscopia de fluorescência de luz-folha, foi possível. Neste manuscrito, apurou-se forças hemodinâmicas modulam a iniciação da trabeculação via de sinalização Notch e, assim, influenciam a função contrátil ocorre. Qualitativa e quantitativa shear stress análise, 4-D (3-D + tempo) imagens foram adquiridas durante a morfogênese cardíaca zebrafish e microscopia de fluorescência de luz-folha integrado com sincronização 4D capturou o movimento ventricular. Viscosidade do sangue foi reduzida através de gata1a- Morpholinos oligonucleotides (MO) microinjeção para diminuir a tensão de cisalhamento, desse modo, para baixo-regulação entalhe atenuantes trabeculação e sinalização. Co injeção de mRNA Nrg1 com gata1a MO resgatados genes relacionados com entalhe para restaurar trabeculação. Para confirmar a tensão de cisalhamento conduzido de sinalização Notch influencia trabeculação, contração de casos mais foi preso através de tnnt2a-MO para reduzir forças hemodinâmicas, desse modo, para baixo-regulação genes-alvo entalhe para desenvolver um não-trabeculada miocárdio. Finalmente, corroboração dos padrões de expressão de genes responsivos-tensão de cisalhamento de entalhe foi conduzida sujeitando células endoteliais de fluxo pulsátil. Assim, a microscopia de luz-folha 4-D descoberto hemodinâmicas forças subjacentes de sinalização Notch e trabeculação com relevância clínica para cardiomiopatia não-compactação.

Introdução

Forças biomecânicas, tais como tensão de cisalhamento hemodinâmica, estão intimamente envolvidas na morfogênese cardíaca. Em resposta a forças de cisalhamento hemodinâmica, sulcos e cristas miocárdica desenvolvem-se em uma rede trabecular ondulatória em alinhamento com a direção da tensão de cisalhamento através da válvula atrioventricular (AV)1. Trabeculação cardíaca é necessária aumentar a função contrátil e massa do miocárdio2. Mutações no entalhe de vias de sinalização resultam em defeitos cardíacos congênitos em seres humanos e outros vertebrados,3. Por exemplo, gata1a4 e tnnt2a5 Morpholinos oligonucleotides (MO) foram mostrados para reduzir a eritropoiese, enquanto eritropoietina (EPO) de mRNA6 e Isoproterenol (ISO)7 aumentam o sangue vermelho células e frequência cardíaca, respectivamente e, portanto, parede tensão de cisalhamento (WSS). Além disso, ErbB2 sinalização, a jusante do entalhe, promove a proliferação de casos e diferenciação para gerar força contrátil, que por sua vez ativa o entalhe sinalização8,9. Sugere-se que a tensão de cisalhamento governa entalhe sinalização trabeculação orientada para o desenvolvimento ventricular. Atualmente, existem muitos estudos que tentam entender melhor os eventos de programação genéticos levando a cardiopatias congênitas defeitos (CHD)10,11,12, mas muito pouco está investigando como forças mecânicas influenciam o formação do coração.

A fim de investigar as forças mecânicas agindo sobre o endocárdio, estreita observação durante o período de desenvolvimento precisa ser implementada. No entanto, é desafiador para obter imagens de boa qualidade na vivo batendo amostras devido a inerência de microscopia tradicional13. Fim de observar o desenvolvimento ao longo do tempo dentro de uma amostra, físico de corte e coloração, portanto, precisam ocorrer de14,13,15. Apesar da microscopia confocal é amplamente utilizada para a imagem da estrutura 3-d de amostras14,16, aquisição dos sistemas de imagem, estes ainda é limitada pela velocidades de varredura lentas.

Microscopia de fluorescência de luz-folha (LSFM) é uma técnica de imagem exclusiva que permite a visualização do in vivo eventos dinâmicos com longa distância trabalho13. Esta técnica usa uma microscopia fluorescente luz-folha de opticamente seção uma amostra de17. Devido a iluminação de apenas uma folha fina de luz na amostra, há uma redução na foto-branqueamento e foto toxicidade13,18. O grande campo de visão e de longa distância de trabalho permite grandes amostras de permanecer intacta, como eles são imagem13,14,17. A ampliação baixa permite uma área maior ser fotografada, enquanto a longa distância de trabalho permite amostras mais grossas ser fotografada sem comprometer a relação sinal-ruído. Muitos grupos têm utilizado LSFM a imagem inteira embriões17, cérebro14,18, músculos e corações19 entre outros tecidos, mostrando os diversos tipos de amostras que podem ser fotografadas.

Embora pesquisas anteriores demonstraram força de cisalhamento hemodinâmica reduzida por oclusão as faixas de entrada ou de saída do coração zebrafish, a informação é exclusivamente qualitativa. Isso resulta em um anormal Terceira Secção loop cardíaca diminuída e prejudicada válvula formação20. As imagens LSFM 4-D dar uma nova perspectiva para a maneira que a hemodinâmica distorcer as forças afetam o desenvolvimento do tecido cardíaco. Estas forças mecânicas podem ativar moléculas sinalizadoras de força-sensível e induzir a formação de cumes trabecular. Devido ao aspecto de tempo adicionado de imagem de 4-D, um é capaz de controlar as alterações no desenvolvimento em tempo real, o que poderia levar a novas revelações que tinham passado despercebidas anteriormente. O peixe-zebra é um modelo ideal de imagem porque os cientistas observam-se um animal vertebrado inteiro contra apenas as interações célula-célula. Oxigênio pode também difundir através do embrião inteiro, que permite o desenvolvimento ocorra sem dependendo do sistema vascular, ao contrário, no desenvolvimento dos mamíferos. Mesmo que o coração de zebrafish carece de órgãos pulmonares, que exigem um coração de quatro cavidades, há um grande número de genes cardíacos que são conservadas entre zebrafish e humanos21.

Este manuscrito, descrevemos como usar microscopia de fluorescência de luz-folha imagem as trabéculas em desenvolvimento no zebrafish corações sob várias circunstâncias. Primeiro, injeção de gata1a4 ou tnnt2a5 MOs foram usados para inferior a viscosidade do sangue e, portanto, do WSS. A morfologia do coração foi então gravada. Em um grupo separado de peixe, estamos aumentado o WSS através da administração de EPO mRNA6 ou isoproterenol7 e observados os resultados. Também foi realizado um estudo de célula com taxas de fluxo pulsátil ou oscilatório diferentes. Após cada grupo de imagem, encontramos que a WSS detetada pelo endocárdio através do entalhe trabeculação inicia a sinalização.

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Protocolo

Os métodos a seguir foram realizados em conformidade com os protocolos de UTA e UCLA IACUC. Estes grupos experimentais foram usados com transgénicos, Tg(cmlc2:gfp), os mutantes wea (átrio fraco) ou clo (cloche) : (a) tipo-selvagem (WT) controle, (b) gata1a MO e (c) tnnt2a MO injeções (tabela 1).

ModeloNomeGenes modificadosFenótipoReferência
ControleTipo selvagemNenhumN/A
TG(cmlc2:GFP)Cadeia leve de miosina cardíacaFlourescence verde especificamente expressado no miocárdio34
Parede de diminuição da tensão de cisalhamentoMutante do átrio fraco (wea)Cadeia de heacy específicas do átrio miosinaÁtrio não pode contrair, compactas, ventrículo, átrio de seleção inteiramente, espessura parede miocárdica, lúmen estreito37
Mutante de Cloche (clo)N/ARemoção completa do endocárdio, unaturally grande átrio com pequeno ventrículo, cushins cardíaca inexistente41
gata1a MO gata1a Anemia por falta de células vermelhas do sangue4
tnnt2a MOtnnt2a39
Tensão de cisalhamento da parede maior MRNA EPONenhumGrave policitemia, aumento do número de células do sangue, em circulação aumentou a viscosidade6
IsoprotenerolNenhumAumento da frequência cardíaco7

Tabela 1: Descrições de Zebrafish. Definições e descrições de Zebrafish utilizados em experiências.

1. estudo de instalação

  1. Prepare Nrg1 e EPO mRNA para trabeculação resgate.
    1. Obter o cDNA humano Nrg1 e amplificar de um plasmídeo de doador.
      Nota: O cDNA humano Nrg1 era dotado de William Talbot, da Universidade de Stanford.
      1. Tire os reagentes necessários e materiais, nomeadamente PCR mastermix (armazenado em-20 ° C), as primeiras demão (ver tabela 2) (armazenadas em-20 ° C), um prato PCR (armazenada em temperatura ambiente) e uma pipeta de 20 μL (armazenada em temperatura ambiente). Consulte tabela de materiais para os produtos de exemplo.
        figure-protocol-2970
        Tabela 2: Primers para Nrg1 a clonagem humana.
      2. Prepare o mastermix para cada primeira demão definida em triplicado usando a pipeta de 20 μL. 1 conjunto de triplica, use 37,5 μL do mastermix, 3 μL de água livre de DNA, 4,5 μL de primer. Por mais que triplica, basta multiplica pelo número de amostras.
      3. Dilua a solução de trabalho humano Nrg1 cDNA (20 μg/ng concentração) na faixa de cartilha com água livre de DNA para que haja total por alvéolo por amostra de 10 μL.
        Nota: Certifique-se de que cada solução sob passo 1.1.1 é uniformemente distribuída. Fazer isso através da mistura de cada solução pipetando para cima e para baixo. Para evitar contaminação cruzada, use uma ponta de pipeta para apenas uma amostra.
      4. Alíquota do cDNA Nrg1 com pipeta multicanal 10 μL desejado aos poços da placa de PCR.
      5. Adicione 14.5 μL do mastermix para o cDNA em poços. Aplica uma capa pegajosa para a placa PCR para selar os poços e coloque na máquina de PCR.
      6. Iniciar a máquina PCR e certifique-se de que o ciclo atinge temperaturas adequadas, de acordo com os primers utilizados e enzimas.
    2. Clonagem do cDNA Nrg1 em pCS2 o plasmídeo+ no BamHI e EcoRI sites usando enzimas excesso BamHI e EcoRI para garantir que o cDNA é ligado em todos os plasmídeos.
      1. Misture o cDNA Nrg1 com o doador do plasmídeo pCS2+, mestre comercialmente disponível mistura solução e primers (tabela 2).
        Nota: O volume total de reação deve ser 50 μL com 25 μL de mistura de mestre, 3 μL de primers e 1 μL do plasmídeo de doador 20 ng / µ l com Nrg1 cDNA.
      2. Coloque a mistura da etapa 1.1.2.1 na máquina de PCR e definir os parâmetros para atender as seguintes especificações: 98 ° C por 10 s, 55 ° C, durante 5 ou 15 s e 72 ° C para 5KB/s.
      3. Purifica o produto do PCR usando um kit de purificação, seguindo as instruções do fabricante. Eluir o produto em 50 μL de tampão de eluição.
      4. Digerir o produto do PCR purificado e 5 μg de pCS2+ com BamHI e EcoRI separadamente a 37 ° C, durante 2 h em um volume de reação de 200 μL. Purificar a digestão resultante com um kit comercial e eluir em 20 μL e 100 μL de Tris-HCl (pH 8,5), respectivamente.
      5. Ligate 4 μL de cDNA Nrg1 e 2 μL do digerido pCS2+ plasmídeo em 25 μL reação com 1 μL de um catalisador de ligase a 16 ° C durante a noite.
        Nota: O procedimento pode ser parado aqui para incubação durante a noite.
      6. Use 2 μL da solução de ligadura da etapa 1.1.2.5 e transformar em 50 μL de células de bactérias Escherichia coli apropriadas para clonagem (ver Tabela de materiais).
    3. Confirme que a transformação ocorreu por triagem que NRG1 cDNA clones usando PCR. Escolha de clones de forma aleatória e adicionar a uma solução de trifosfatos dNTP (dNTPs), polimerase e primers específicos.
      Nota: Os controles foram o vector (pCS2+) com e sem a inserção (cDNA humano). Não muito grande de uma colónia porque bactérias excessivas podem inibir o PCR.
      1. Escolher 8 colônias da transformação e tela pCS2+-Nrg1 clones usando as primeiras demão do PCR da tabela 2.
      2. Cultura um clone com cDNA Nrg1 para isolar o pCS2+-Nrg1 plasmídeo. Inocular com 100 μL de bactéria e. coli com pCS2+-Nrg1 plasmídeo em 100 mL de LB mídia e cultura agitando (160-225 RPM) a 37 ° C.
    4. Transfect purificado pCS2+-Nrg1 plasmídeo em HEK-293 células em uma placa de 6 usando um reagente de transfeccao comercial seguindo as instruções do fabricante.
    5. 24 h após a transfeccao, lisar as células com um tampão de Lise e executado através de um gel de SDS-PAGE, transferir para uma membrana de gel e então mancha com anti-Nrg1 anticorpo22. Verifique se a expressão de proteínas Nrg1 usando um Western Blot.
      Nota: O controle é um vazio pCS2+ plasmídeo. Pode ser pausado aqui se gel membrana transferência ocorre durante a noite.
    6. Sintetizar o mRNA Nrg1 usando um produto comercial similar na Tabela de materiais e siga as instruções do fabricante.
      1. Leve 5 μL do pCS2+-Nrg1 DNA da cultura de bactérias isoladas e digerir com NotI em uma reação de 200 μL de 2 h a 37 ° C para linearizar o plasmídeo.
      2. Purificar o plasmídeo linear com um kit comercial e eluir em 20 μL de Tris-HCl (pH 8,5).
      3. Conduta em vitro transcrição com um kit comercial de isolamento de RNA em uma reação de 20 μL usando 5 μL do plasmídeo linear, seguindo as instruções do fabricante.
      4. Adicione que o em vitro transcritas Nrg1 para 350 μL de tampão de lise de RNA e depois purificar com um kit de isolamento de RNA. Eluir o RNA em 60 μL de Tris-HCl (pH 8,5).
      5. Medir a concentração de RNA e armazenar a-80 ° C para uso futuro.
    7. Siga os passos 1.1.6.1 - 1.1.6.5 acima para o EPO do cDNA e preparação de mRNA mas clone do cDNA no plasmídeo pCS2 + EcoRI e XhoI sites em vez disso.
  2. Injetar Morpholinos zebrafish
    1. Projeto23 as injeções de MO, utilizando uma ferramenta online (Tabela de materiais) contra a sequência ATG de gata1a4 (5 '-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-3 ') e tnnt2a5 (5 '-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-3 ').
    2. Adicione o gata1a e tnnt2a MO separadamente à água nuclease-livre para fazer as concentrações finais de 8 ng/nL e 4 ng/nL, respectivamente. Repita com EPO mRNA com uma concentração final de 20 pg/nL. Certifique-se de que o volume final é de 1 mL.
    3. Injectar 1 nL da 8 ng/nL de gata1a MO e 1 nL da 4 ng/nL de tnnt2a MO em embriões de zebrafish separado no 1 para o estágio de 4 células para reduzir a tensão de cisalhamento (WSS) de parede ventricular24. Para aumentar o WSS, injetar 1 nL de 20 pg/nL de EPO mRNA6 nos zebrafish embriões na fase de 1 a 4-células.
  3. Tratar quimicamente zebrafish para inibir trabeculação
    1. Utilizando uma pipeta de 20 mL, diluir a 10 mg/mL AG1478 em 1% DMSO E3 médio e uma concentração final de 5 μM 30 hpf em um tubo de 15 mL. Como um controle, trate cada peixe com 1% DMSO somente.
    2. Adicionar o éster de N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t-butílico (DAPT) em 1% DMSO (100 μM) a E3 médio em um tubo de 15 mL para inibir a sinalização de entalhe em 40 hpf em uma forma similar. Como um controle, trate com apenas 1% de DMSO.

2. técnicas de imagem

  1. 4-D LSFM cardíaca Imaging com algoritmo de sincronização
    1. 2-D imagens do embrião peixe inteiro assuma múltiplas cardíaco batendo ciclos usando as etapas abaixo (Figura 1). Certifique-se de que a luz-folha de espessura é aproximadamente 5 μm. Leve 1 μm para amostragem digital sem perdas de acordo com a amostragem de Nyquist princípio25500 frames x-y com um tempo de exposição de 10 ms. conjunto a varredura-z.
      1. Crie um gel de agarose 1% (p/v), adicionar 1 g de agarose a 100 mL e aquecê-lo até que todos os agarose é dissolvido. Carregar um pequeno tubo de plástico com o embrião e agarose utilizando uma pipeta de 20 μL e fixá-lo no palco.
      2. Abra a imagem de software de visualização e clique em Live para ver a exibição ao vivo da amostra. Ajuste o objetivo usando o botão de modo que a amostra está em foco. Da mesma forma, mova o palco para a exibição ao vivo da amostra mostra a parte superior do embrião.
      3. Tirar fotos 500 vezes para 5 s na ampliação de 10x usando software26 do microscópio.
      4. Palco usando o motor para uma nova camada (1 μm no eixo z) e repita o procedimento da imagem latente.
      5. Repita 2 passos acima até que todo o coração é totalmente fotografado.
    2. Garantir a integridade dos dados por desrespeitar as imagens do primeiro e último ciclo cardíaco. Encontre o período do ciclo cardíaco combinando imagens que foram tiradas no mesmo tempo ponto no ciclo cardíaco, mas em períodos diferentes. Use a seguinte equação foi desenvolvida para encontrar o período:
      figure-protocol-11785(1)
      onde D é a função de custo utilizada para a montagem de uma hipótese de período, eum a imagem capturada, τ» o tempo que a imagem foi capturada, zk o índice z-direção da imagem, xm é o vetor do índice de pixel, e T' é a hipótese de periódica.
    3. Use a seguinte equação para encontrar o deslocamento relativo entre duas fotos em estágios semelhantes:
      figure-protocol-12307(2)
      onde Qk', k denota uma função de custo para o deslocamento relativo, R é a vizinhança espacial possível, L é o tempo total de capturar a imagem, x é o pixel índice, zk e zk' são as fatias de primeira e segunda direção-z, t é o tempo e s é a hipótese de deslocamento relativo.
    4. Converter a mudança relativa a mudança absoluta no que diz respeito a primeira imagem e resolver a equação linear usando a abordagem pseudo inversa, para encontrar a relação absoluta para alinhar a próxima seção de imagens, como descrito anteriormente,27.
    5. As imagens finais de 4-D foram processadas usando o software de processamento de imagem (Tabela de materiais).
      1. Empilhamento de imagens 2D em 3D
        1. Abra uma software de processamento de imagem comercial.
        2. Clique em dados abertos.
        3. Selecione todas as imagens para ser empilhada em 3-d > clique em Load.
        4. Adicione o tamanho de voxel de 0,65 x 0,65 x 1 > clique Okey.
        5. Clique na caixa de Visualização Multi-Planar para visualizar a imagem em 3D.
        6. Botão direito do mouse a caixa azul slice_1.tiff > selecione Exibir > Selecionar Volren.
        7. Clique em Editar > Selecionar Opções > selecione Editar Colormap.
        8. Ajustar a cor, usando as caixas delineadas em vermelho > clique Okey.
      2. Conversão de 3-d 4-d
        1. Clique em "arquivo > abrir dados de série temporal.
        2. Selecione o tiffs 3D que só foram feito > clique em Load.
        3. Insira o mesmo tamanho de voxel como antes.
        4. Direita-estale a caixa azul slice_1.tiff > selecione "Exibir" > selecione Volren.
        5. Clique em Editar > Selecionar Opções > selecione Editar Colormap. Ajustar a cor, usando as caixas > clique Okey.
        6. Controle de série de tempo de clique direito > clique em Movie maker > pressione o botão Play para assistir ao filme.
        7. Adicionar um nome de arquivo, tamanho do quadro, taxa de quadros, qualidade igual a 1, digite Monoscopic > clique em aplicar
        8. Exporte o vídeo. Abra o vídeo em um software apropriado.

3. análise qRT-PCR

  1. Zebrafish isolamento de RNA para quantificar ligantes Notch, receptores, de coração e expressões dos genes-alvo
    1. Sacrifica o zebrafish submetendo-os a uma overdose de tricaina metilato28,29. Usando um protocolo descrito anteriormente30, os zebrafish corações foram extirpados e preparados para isolamento de RNA.
    2. Isolar o RNA total e sintetizar o cDNA usando o kit de síntese do cDNA seguindo as instruções do fabricante.
    3. Desenha os primers PCR para os ligantes Notch Jag1, Jag2, Dll4, receptor Notch1be sinalização relacionados genes Nrg1 e ErbB2. Consulte a tabela 3 para os primers que usamos.
    4. Adicione os primers da etapa 3.1.3, o mRNA isolado da etapa 3.1.2 e mastermix um comercial para a chapa de PCR. Execute o qRT-PCR nos tempos de acordo com as enzimas usadas e temperaturas adequadas. Normalize os resultados de zebrafish α-actina.
      Nota: Isto irá calcular os níveis de expressão para cada um dos ligantes, receptores e genes.

4. in vitro as experiências humanas de célula endotelial da aorta (HAEC)

  1. Modelo tensão de cisalhamento dinâmico
    1. Células de cultura HAEC com HAEC meios de cultura. Uma vez totalmente confluente, expor as células de fluxo laminar e fluxo pulsátil de 23 x 10-5 N à taxa de 1 Hz para 24h.
      1. Aquecer a CE mídia/DMEM 10% FBS em uma água de banho por 20 min.
      2. Recuperar células HAEC do tanque de nitrogênio líquido e coloque o frasco em banho-maria até derreter.
      3. Usando uma pipeta μL 1.000, remover as células descongeladas e colocá-los em um tubo de 15 mL com 3-5 mL de mídia. Centrifugue a solução de célula a 53 x g, durante 3 min.
      4. Aspirar a solução fora e adicionar suficiente mídia para um volume total de 10 mL. Adicionar a solução de célula para um balão de T75 estéril, tampa do frasco e distribuir as células uniformemente na parte inferior da placa.
      5. Marca o balão com as iniciais, data, tipo de célula e número de passagem. Incube o frasco a 37 ° C, 5% de CO2, até que as células são 80% de Confluencia. Lembre-se de mudar os meios de comunicação a cada 2-3 dias.
      6. Usando uma bomba comercial, anexar a tubulação para o balão e definir os parâmetros acima mencionados na etapa 4.1.131,32,33.
    2. Adicione GI254023X para 50 mL de meio HAEC em uma concentração final de 5 μM por 30 min.
    3. Com a pré-mistura GI254023X, um inibidor de ADAM10 que suprime o entalhe, sinalização, realizar o mesmo fluxo laminar ou experimentos de fluxo pulsátil como em 4.1.1.
    4. Quantificar ligantes Notch (Jag1, Jag2 e Dll4) e genes-alvo Notch (peludo e potenciador de split [Hes]) usando qRT-PCR para quatro grupos de amostras HAEC (fluxo laminar, fluxo laminar + GI254023X, fluxo pulsátil, fluxo pulsátil + GI254023X) descrita anteriormente,32.

5. resgate e sobre-expressão de sinalização Notch

  1. Injectar 1 nL do mRNA Nrg1 preparada na concentração de 5 pg/nL (da etapa 1.1.6) na fase 1 - a 4-célula com o gata1a MO fim overexpress entalhe de genes alvo24.
  2. Injectar 1 nL do mRNA Nrg1 em wea mutantes em um semelhante caminho24.
  3. Dobro da concentração de mRNA Nrg1 (10 pg/nL) e injetar24 1 nL em zebrafish para observar a morfologia ventricular.
  4. Injectar 1 nL da 20 pg/nL de EPO mRNA6 para os embriões de zebrafish na fase 1 - a 4-célula para aumentar a hematopoiese para aumentar ventricular do WSS, como anteriormente mostrado24.
  5. Injectar 1 nL dos 50 μM Isoproterenol7, que aumenta a taxa de contratilidade, para o meio de E3 para 24h enquanto zebrafish são cultivadas como mostrada anteriormente24.
  6. Execute a imagem latente de LSFM 4-D para cada grupo. Siga as instruções em passos 2.1.1-2.1.5.2.8.

6. quantificação de encurtamento fracionário e volume mudança ao longo do tempo

  1. Executar a imagem latente de LSFM 4-D para cada grupo de 50, 75 e 100 hpf. Siga as instruções em passos 2.1.1-2.1.5.2.8. Divida cada imagem para que cada um tem 600 nós para replicação do movimento da parede cardíaca.
  2. Medir a mudança de diâmetro do ventrículo durante a diástole e sístole usando a seguinte fórmula:
    figure-protocol-20007(3)
    Carregar imagens ventriculares em 3D a cada 0.1 s com software de visualização e medir o volume.
  3. Plotar a alteração de volume ao longo do tempo para cada grupo experimental em 75 hpf e 100 hpf.

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Resultados

LSFM foi usado neste manuscrito para adquirir imagens 2D e 3D de alta resolução. Como visto na figura 1A e 1B, a lente de iluminação direciona a folha de luz na amostra. Por causa da magreza da folha de luz, apenas um único avião é iluminado. A lente é posicionada perpendicular para a lente da iluminação e é focado no avião iluminado (figura 1B). A folha de luz da lente de iluminação, em seguida, ex...

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Discussão

Neste protocolo, mostramos que a imagem 4-D pode ser usada para controlar o desenvolvimento de uma rede trabecular em resposta às mudanças nas forças biomecânicas. Em particular, a tensão de cisalhamento experientes por células endoteliais inicia o entalhe em cascata, que por sua vez, promove trabeculação de sinalização. Neste manuscrito, mostramos que injeção de gata1a MO (1) diminuição da hematopoiese e, portanto, reduziu a tensão de cisalhamento da parede, injeção de tnnt2a MO (2) in...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de expressar a gratidão a William Talbot, da Universidade de Stanford para a prestação do ser humano Nrg1 cDNA e Deborah Yelon de UCSD para fornecer o WEA mutantes. Os autores também gostaria de agradecer a ajuda com a aquisição de imagens de Cynthia Chen. Este estudo foi suportado por bolsas NIH HL118650 (para Hsiai tk), HL083015 (para Hsiai de T.K.), HD069305 (para N.C. Chi e T.K. Hsiai...), HL111437 (para Hsiai de T.K. e Chi N.F.), HL129727 (para Hsiai de T.K.), T32HL007895 (para R.R Sevag Packard), HL 134613 (para V. Messerschmidt) e Universidade de Texas sistema estrelas financiamento (de J. Lee).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Clontech Hifi PCR pre-mix Takara 639298PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNAGift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USAN/AUsed for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855201PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+GE HealthPlasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit  Clontech740609.25DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase Clontech2011APCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cellsClontech636763E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagentLife Technologies11668027Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kitInvitrogenAM1340Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8GeneToolsN/ASoftware for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNACreative BiogeneCDFH006026Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich T4182ErbB inhibitor
1.3.1
E3 mediumTo grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich D5942γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose Sigma-Aldrich A9539Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS cameraHamamatsu PhotonicsC11440-42UUsed to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira SoftwareFEI SoftwareN/AVisualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate Sigma-Aldrich 886-86-2Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708890Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifugeEppendorf05-400-005Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich 260264-93-5ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochlorideSigma-Aldrich I5627Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLABMathworksN/ACardiac mechanics analysis

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

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