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Erratum Notice

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要約

4 次元 (4-d) ゼブラフィッシュで心の開発を視覚化するためのプロトコルを紹介します。4 D イメージング、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、開発の心を再構築する時間を 3 次元 (3 D) 画像を引き継ぎます。質的にも量的そのせん断応力が心臓の肉を推進室開発時に心内膜 Notch シグナルをアクティブに示します。

要約

血行動態の軍によって心臓の影響心臓開発、特に肉は、分岐増生心筋からのネットワークを形成する経験します。ノッチ シグナル伝達カスケードは心室欠損症左室非圧縮の心筋症や左心低形成症候群などに関与しているの欠陥の遺伝的プログラム.このプロトコルを使用して、それを決定できます駆動せん断応力肉と Notch シグナルは互いに関連しています。光シート蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ心臓の開発の可視化は可能だった。本稿では、それは血行力 Notch シグナルによる肉の開始を調節してしたがって、収縮機能に影響を与えるかどうかが評価されたに発生します。質的・量的にせん断応力解析、4 D (3-D + 時間) ゼブラフィッシュ心臓の形態形成時に得られた画像と 4 D 同期統合光シート蛍光顕微鏡は心室拍動を捕獲しました。血液粘度ではそれにより、せん断応力を減少する - morpholino gata1a(MO) のオリゴヌクレオチド マイクロ射出成形を介してダウン調整ノッチ シグナル伝達と減衰の肉が減った。Gata1a MO のNrg1 mRNA の共射出は、肉を復元するノッチ関連遺伝子を救出しました。Notch シグナルを駆動せん断応力影響肉を確認する心筋細胞の収縮はさらにtnnt2a経由で逮捕された -MO、それにより血行力を減らすために非 trabeculated を開発するノッチ標的遺伝子をダウン調整心筋。最後に、せん断応力応答ノッチ遺伝子の発現パターンの確証は、内皮細胞を拍動流に服従させることによって行なわれました。したがって、4 D ライト シート顕微鏡は非圧縮の心筋症に臨床的意義と Notch シグナルと肉を基になる血行力を発見しました。

概要

血行動態のせん断応力などの生体力学的力は心臓の形態形成に密接に関与しています。血行動態のせん断力に対し、心筋の隆起部分および溝は房室 (AV) 弁1にわたってせん断応力の方向と配置で波のような骨梁ネットワークで開発します。心臓肉収縮機能と心筋質量2を増加する必要があります。Notch シグナルの突然変異の結果人間および他の脊椎動物3先天性心疾患。たとえば、 gata1a4 、 tnnt2a5 morpholino オリゴヌクレオチド (MO) は、エリスロポエチン (EPO) mRNA6とイソプロテレノール (ISO)7増加赤血球、赤血球を減らすために示されています。セルと心拍数, その壁せん断応力 (WSS)。さらに、ErbB2 下流シグナリング、ノッチ、促進する心筋細胞の増殖と分化、Notch シグナル8,9を起動収縮力を生成します。そのせん断応力が Notch シグナル心室開発の駆動肉を支配するをお勧めします。現在、さらに先天性心臓欠陥 (CHD)10、11,12につながる遺伝的プログラミング イベントを理解しようと多くの研究がありますが、ほとんどの調査はどのように機械力形成の心に影響を与えます。

機械の力を調査するために発達期間中に観察、心内膜に作用を実装する必要があります。しかし生体内で伝統的な顕微鏡13の内属のためサンプルを破っての質の良い画像を取得するために挑戦です。物理的な区分および染色はサンプル内で時間をかけて開発を観察するために、したがって、13,14,15を発生する必要。共焦点顕微鏡画像サンプル14,16の 3次元構造に用い、これらのイメージング システムの取得まだ遅いスキャン速度によって制限されます。

光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、動的イベント長い作業距離13で生体内での可視化を可能にするユニークなイメージング手法です。この技法は、サンプル17を光学セクションのライト シート蛍光顕微鏡を使用します。サンプルに光の薄いシートのみの照明、写真漂白、写真毒性13,18削減あります。ビューと長作動距離の大きい分野は、大きなサンプル画像13,14,17ありのままそのままをことができます。低倍率で、永い間、イメージを作成する大きい区域は、作動距離厚いサンプル信号対雑音比を損なうことがなくイメージを作成することができます。多くのグループ、画像全体胚17に LSFM を使用して脳14,18筋肉と心19他の組織の中で多様なイメージを作成することができますのサンプルを示します。

前の研究は、ゼブラフィッシュ心臓の流入または流出のトラックを遮蔽して減らされた血行力学的せん断力を実証、情報はもっぱら定性的です。それによって異常な第 3 室、減少心臓ループと障害弁形成20。4 D の LSFM 画像は、心臓組織の開発血行動態のせん断力に影響を与える方法に新しい視点を与えます。これらの機械力が敏感なシグナリング分子をアクティブにし、骨の隆起部分の形成を誘導します。4 D イメージングの追加時間の側面、ためこれまで見過ごされていた新しい啓示につながる可能性がリアルタイムでの変化を追跡することであります。ゼブラフィッシュ イメージング科学者は、細胞間の相互作用だけ対全体の脊椎動物を観察できるための理想的なモデルであります。酸素もなしに行われる血管システムに応じてとは異なり哺乳類の開発の開発を可能にする全体の胚を介して拡散します。ゼブラフィッシュ心臓 4 chambered 中心、肺の器官を欠いているにもかかわらず、ゼブラフィッシュと人間21の間保存されている心臓の遺伝子の数が多いがあります。

本稿では、ゼブラフィッシュの心のさまざまな状況で発展途上の梁をイメージさせるライト シート蛍光顕微鏡を使用する方法をについて説明します。まず、 gata1a4 tnnt2a5の注射 MOs は低血液粘度と WSS に使用されました。心臓の形態を記録しただった。魚の別のグループ、 EPO mRNA6またはイソプロテレノール7を管理することにより、WSS を増やし、結果を観察しました。異なる脈動や振動流量と細胞の調査を実施しました。各グループをイメージング、わかった WSS をノッチによる心内膜で感じたこと開始肉をシグナリングします。

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プロトコル

次の方法は、うたと UCLA IACUC プロトコルに準拠して行った。これらの実験グループ トランスジェニックTg(cmlc2:gfp)、使用されたwea (弱いアトリウム) 、 clo (cloche)変異体: (a) 野生型 (WT) 制御、(b) gata1aミズーリ、および (c) tnnt2a MO 注射 (表 1)。

モデル名変更された遺伝子表現型参照
コントロール野生型どれもN/A
Tg(cmlc2:gfp)心筋ミオシン軽鎖緑色の蛍光が心筋に特異的に発現34
減少の壁面せん断応力弱いアトリウム (wea) 変異体アトリウム固有ミオシン heacy チェーンアトリウム」契約はできません、心室心筋壁の厚さ、狭い内腔、dialated アトリウムをコンパクト37
クロッシュ (clo) 変異体N/A小さい心室存在しない心臓 cushins unaturally 大アトリウム心内膜を完全に除去41
gata1aMO gata1a 赤血球の不足から貧血4
tnnt2aMOtnnt2a39
増加の壁面せん断応力 EPO mRNAどれも深刻な多血症、循環血液細胞の数の増加は粘度を増加6
Isoprotenerolどれも心拍数の増加7

表 1: ゼブラフィッシュの説明。定義およびゼブラフィッシュ実験で使用される説明。

1. セットアップを研究します。

  1. 肉の救出のためNrg1とEPO mRNA を準備します。
    1. 人間Nrg1 cDNA を取得し、ドナー プラスミッドから増幅します。
      注:人間Nrg1 cDNA は、スタンフォード大学のウィリアム ・ タルボットから寄贈されました。
      1. 必要な試薬および材料、PCR マスター ミックス (-20 ° C に格納)、プライマー (表 2参照) (-20 ° C に格納)、(常温保存) PCR プレート、および (常温保存) 20 μ L ピペットすなわちを取る。例製品の材料の表を参照してください。
        figure-protocol-2012
        表 2: Nrg1クローン人間用プライマー。
      2. 各プライマー 20 μ L ピペットを使用して帳票をマスター ミックスを準備します。トリプリケートの 1 セットのため、マスター ミックスの 37.5 μ L、3 μ L の DNA 無料水、プライマーの 4.5 μ L を使用します。詳細トリプリケートのためには、サンプルの数を掛けます。
      3. 10 μ L のサンプルごとの井戸あたり合計ので DNA 無料水プライマー ストリップで働く解決策人間Nrg1 cDNA (20 ng/μ g 濃度) を希釈します。
        注:[ステップ 1.1.1 各ソリューションが均等に分散を確認します。上下にピペッティングによる各ソリューションを混合することによってこれを行います。クロスコンタミネーションを防ぐためには、1 つだけサンプルの 1 つのピペット チップを使用します。
      4. PCR プレートに希望の井戸に 10 μ L マルチ チャンネル ピペットのNrg1 cDNA の約数。
      5. 井戸の cDNA に、マスター ミックスの 14.5 μ L を追加します。粘着性のカバーを井戸を封印し PCR マシンに PCR プレートに適用します。
      6. PCR マシンを起動し、酵素およびプライマーの使用によると適切な温度をサイクルに達することを確認します。
    2. Nrg1 cDNA をクローン プラスミド pCS2 に+すべてのプラスミッドの cDNA を結紮ように病原と EcoRI 過剰の酵素を使用して病原と EcoRI サイトで。
      1. プラスミド pCS2 ドナーとNrg1 cDNA をミックス+、市販のマスター ミックス ソリューションおよびプライマー (表 2)。
        注:全反応ボリュームは、マスター ミックス、プライマーの 3 μ L とNrg1 cDNA を用いた 20 ng/μ L ドナー プラスミッドの 1 μ L の 25 μ L の 50 μ L をする必要があります。
      2. PCR マシンでステップ 1.1.2.1 からミックスを置き、次の仕様を満たすようにパラメーターを設定: 98 ° C 10 s、55 ° C、5 または 15 s 72 ° C、5 s/kb に。
      3. 製造元の指示に従って精製キットを使用して PCR の製品を浄化します。50 μ L の溶出バッファーに製品を溶出します。
      4. ダイジェスト精製 PCR の製品と pCS2 の 5 μ g+病原と 200 μ L 反応量の 2 h の 37 ° C で個別に EcoRI。市販キットの結果消化を浄化し、それぞれ 20 μ L、100 μ L トリス-HCl (pH 8.5) の溶出します。
      5. Nrg1 cDNA の 4 μ L と消化の pCS2 の 2 μ L を縛る+ 25 μ L を 1 μ l の反応、16 ° C のリガーゼ触媒一晩でプラスミド。
        注:手順をここで一晩インキュベートを停止できます。
      6. (材料の表を参照) をクローニングのため適当なエシェリヒア属大腸菌細菌細胞の 50 μ L に 2 μ L ステップ 1.1.2.5 から結紮ソリューションおよび変換を使用します。
    3. Nrg1 cDNA クローンの PCR を用いた検診では変換が起こったことを確認します。クローンをランダムに選択し、特異的プライマー、ポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩 (dNTPs) のソリューションに追加します。
      注:コントロールされたベクトル (pCS2+) と (ヒト cDNA) を挿入せず。選択しない過剰な細菌の PCR を抑えることができますので、コロニーの大きすぎます。
      1. 変換と画面の pCS2 から 8 コロニーを拾う+-Nrg1 の表 2から、PCR のプライマーを使用してクローンを作成します。
      2. 文化、pCS2 を分離するNrg1 cdna クローン+-Nrg1 プラスミド DNA。PCS2エシェリヒア属大腸菌細菌の 100 μ l 接種+-37 ° C で (160 225 RPM) を揺することによって LB メディア文化の 100 mL に Nrg1 プラスミド
    4. Transfect 精製 pCS2+-Nrg1 プラスミドに HEK 293 細胞の製造元の指示に従って商業トランスフェクション試薬を用いた 6 ウェル プレート。
    5. トランスフェクション後、24 h 換散バッファーを使用して細胞を溶解し SDS ページのゲル、ゲル膜に転送、反Nrg1抗体22で染色します。西部のしみを使用してNrg1タンパク質発現を確認します。
      注:コントロールが空の pCS2+プラスミド。一晩ゲル膜の転送が発生した場合ここに休止できます。
    6. Nrg1 mRNAテーブルの材料に類似する商品を合成し、製造元の指示に従ってください。
      1. PCS2 の 5 μ L を取る+-東北大学からのプラスミッドをリニア化する 37 ° C で 2 時間 200 μ L 反応で分離された細菌文化ダイジェストから Nrg1 DNA。
      2. 市販キットが付いている線形プラスミッドの浄化、トリス-HCl (pH 8.5) の 20 μ L の溶出です。
      3. 製造元の指示に従って線形プラスミッドの 5 μ L を使用して 20 μ L 反応の商業 RNA 分離キットとの in vitro転写を行います。
      4. RNA 換散バッファーの 350 μ L にNrg1の転写体外を追加し、RNA 分離キットで浄化します。トリス-HCl (pH 8.5) の 60 μ L に RNA を溶出します。
      5. RNA 濃度を測定し、将来使用するため-80 ° C で保存します。
    7. 手順 1.1.6.1 - EPOの cDNA と mRNA 準備がクローン EcoRI で XhoI pCS2 + プラスミドに cDNA の代わりにサイトの上記 1.1.6.5。
  2. ゼブラフィッシュの Morpholino を注入します。
    1. 23 gata1a4 (3 '5'-CTGCAAGTGTAGTATTGAAGATGTC-)、 tnnt2a5 (3 '5'-CATGTTTGCTCTGATCTGACACGCA-) の ATG シーケンスに対してオンライン ツール (資材表) を利用した MO 注射をデザインします。
    2. 8 ng/nL の 4 ng/nL、最終濃度をそれぞれするヌクレアーゼ フリー水にgata1aとtnnt2a MO を個別に追加します。20 pg/nL の最終的な集中にEPO mRNA を繰り返します。最終巻は 1 mL であることを確認します。
    3. 注入 1 nL gata1a MO の 8 ng/nL の 1 減らす心室壁せん断応力 (WSS)24 tnnt2a 1 4 細胞期に独立したゼブラフィッシュ胚に MO の 4 ng/nL の nL。WSS を上げるには、注入 1 のEPO mRNA6 1-4 細胞期でゼブラフィッシュ胚への 20 pg/nL nL。
  3. 肉を抑制するゼブラフィッシュを化学的に扱う
    1. 20 mL のピペットを使用して希釈 E3 中 30 で 5 μ M の最終濃度 1 %dmso で 10 mg/mL AG1478 15 mL チューブに hpf。コントロールとして 1 %dmso だけにそれぞれの魚を扱います。
    2. 1 %dmso で N-[N-(3,5-Difluorophenactyl)-L-Alanyl]-S-Phenylglycine t - ブチル (部) を追加 (100 μ M) 40 ノッチ シグナル伝達を阻害するために 15 mL チューブの E3 媒体に同様の方法で hpf。コントロールとしてのみ 1 %dmso を扱います。

2. イメージング技術

  1. 同期アルゴリズムを用いた 4 D 心臓 LSFM イメージング
    1. 全体の魚の胚の 2 D 画像を破ってサイクル (図 1) 以下の手順を使用して複数の心臓に引き継ぐ。光板厚が約 5 μ m であることを確認します。ナイキスト サンプリング原則25によるとロスレスのデジタル サンプリングの 1 μ m に 500 x y フレーム 10 さん z スキャン セットの露出時間を取る。
      1. 寒天 1 g を 100 mL に追加し、すべてアガロースを溶解するまで加熱することによって 1% (w/v) agarose のゲルを作成します。20 μ L ピペットを使用して agarose の胚と小さなプラスチック製のチューブを読み込み、ステージ上に固定します。
      2. 画像閲覧用ソフトを開き、ライブサンプルのライブ ビューを表示する] をクリックします。サンプルは、フォーカスのつまみを使用して目的を調整します。同様に、サンプルのライブビューが胚の上部を示すようにステージを移動します。
      3. 5 の 500 倍の画像を取る顕微鏡のソフトウェア26を使用して 10 倍の倍率で s。
      4. 新しいレイヤー (z 軸方向 1 μ m) にモーターを使用して、ステージを移動し、画像処理の手順を繰り返します。
      5. 心臓全体が完全にイメージ化されるまで上記の 2 手順を繰り返します。
    2. 最初と最後の心臓サイクルのイメージを無視してデータ整合性を確認します。心周期ですが異なる期間で同じ時点で撮影した画像を照合することによって心臓のサイクルの周期を見つけます。期間を見つけるために開発された次の式を使用します。
      figure-protocol-7352(1)
      Dは期仮説を嵌合するためのコスト関数私mキャプチャ画像τ' 、イメージのキャプチャ、時刻zkイメージの z 方向インデックス、 xmは、ピクセル インデックスのベクトルとT'周期の仮説であります。
    3. 次の方程式を使用すると、同様の段階で 2 つの画像間の相対シフトを確認します。
      figure-protocol-7664(2)
      場所 Qk'、k相対シフト、 Rのコスト関数が可能な空間近隣、 Lはイメージのキャプチャの合計時間、 xは、ピクセルのインデックス、 zkとの z を示しますk'最初と 2 番目の z 軸方向のスライスは、 tは時間、およびsは相対シフト仮説。
    4. 相対シフトを最初の画像に関して絶対シフトに変換し、前述27として画像の次のセクションを配置する絶対の関係を検索する擬似逆のアプローチを使用して線形方程式を解きます。
    5. 最終的な 4 D の画像は、画像処理ソフトウェア (資材表) を使用して処理されました。
      1. 3 D に 2 D の画像をスタック
        1. 市販の画像処理ソフトウェアを開きます。
        2. データを開くをクリックします。
        3. 3-D にまとめられ、すべての画像を選択 > をクリックしてロード。
        4. 0.65 × 0.65 × 1 ボクセル サイズ追加 > [ok]をクリックします。
        5. 3次元画像を視覚化する卒論セッション ビュー ] ボックスをクリックします。
        6. 青slice_1.tiffボックスを右クリックして >表示を選択 > Volrenを選択します。
        7. 編集をクリックして >オプションを選択 >カラーマップを編集を選択します。
        8. 赤の輪郭のボックスを使用してカラーを調整する > OK をクリックします。
      2. 4 D から 3 D への変換
        1. クリックして"ファイル>時系列データを開きます。
        2. 単に行われました 3次元 tiff を選択 > をクリックしてロード。
        3. 前と同じボクセル サイズを入力します。
        4. 青slice_1.tiffボックスを右クリックして >「ディスプレイ」を選択 > Volrenを選択します。
        5. 編集をクリックして >オプションを選択 >カラーマップを編集を選択します。ボックスを使用して色を調整する > [ok]をクリックします。
        6. 時間シリーズのコントロールを右クリックして > [ムービー メーカー ] をクリックして > 映画を見るために [再生] ボタンを押します。
        7. 単眼を入力ファイル名、フレーム サイズ、フレーム レート、1 に等しい品質を追加 >] をクリック適用
        8. ビデオをエクスポートします。適切なソフトウェアでビデオを開きます。

3. qRT PCR 解析

  1. ゼブラフィッシュ心臓ノッチ リガンド、受容体を定量化する RNA の隔離とターゲット遺伝子の表現
    1. Tricaine ・ メチラート28,29の過剰摂取にそれらを服従させることによって、ゼブラフィッシュを犠牲に。30上記プロトコルを使用すると、ゼブラフィッシュ心は摘出し、RNA の隔離のために準備されました。
    2. 総 RNA を分離し、製造元の指示に従って cDNA 合成キットを使用して cDNA を合成します。
    3. PCR プライマーを設計ノッチ ligands Jag1、 Jag2、 Dll4、 Notch1b、受容体、シグナル伝達関連遺伝子Nrg1 ErbB2。我々 が使用されるプライマーの表 3 を参照してください。
    4. PCR プレートにステップ 3.1.3 からプライマー、3.1.2 のステップから分離された mRNA および商業マスター ミックスを追加します。適切な温度、使用される酵素によると時間で qRT PCR を実行します。ゼブラフィッシュ α アクチンに結果を正規化します。
      注:これは、各リガンド、受容体と遺伝子の発現レベルを計算します。

4.培養ひと大動脈内皮細胞 (HAEC) 実験

  1. 動的せん断応力モデル
    1. HAEC 培地と培養 HAEC 細胞。一度完全に合流、層流と 23 × 10-5 N 24 h の 1 Hz のレートでの拍動流に細胞を公開します。
      1. ウォーム アップ EC メディア/DMEM 10% 水で FBS バス 20 分。
      2. 液体窒素タンクから HAEC セルを取得し、風呂の水溶けるまでにバイアルを配置します。
      3. 1,000 μ L ピペットを使用して、解凍のセルを削除して、メディアの 3-5 mL と 15 mL チューブに入れてください。3 分間 53 x g で細胞液を遠心します。
      4. ソリューションを離れて吸い出しなさい、10 mL の容量の十分なメディアを追加します。滅菌 T75 フラスコに携帯ソリューションを追加、フラスコのキャップ、プレートの底に均等に細胞を配布します。
      5. イニシャル、日付、セル型通路番号とフラスコをマークします。細胞が 80% 合流までは、37 ° c、5% CO2フラスコを孵化させなさい。2-3 日毎に、メディアを変更してください。
      6. 商業ポンプを使用して、フラスコ、チューブを付けるし、ステップ 4.1.131,32,33上記のパラメーターを設定します。
    2. HAEC 培地で 30 分の 5 μ M の最終濃度 50 mL に GI254023X を追加します。
    3. 予混合 GI254023X Notch シグナルを抑制する ADAM10 阻害剤同じ流または 4.1.1 のように拍動流の実験を行います。
    4. ノッチ (Jag1、 Jag2、 Dll4) とノッチ標的遺伝子の定量化 (毛深いと分割 [Hes] のエンハンサー) qRT PCR を用いた HAEC サンプル (層流、流 + GI254023X、拍動流の 4 つのグループ拍動流 + GI254023X)32をは前述。

5. 救助と Notch シグナルの過剰発現

  1. 1 を注入gata1aノザン ノッチ ターゲット遺伝子24するために MO で 1-4 細胞期で (ステップ 1.1.6) から 5 pg/nL の濃度で準備Nrg1 mRNA の nL。
  2. 1 を注入と同様方法24 wea変異にNrg1 mRNA の nL。
  3. ダブル Nrg1 mRNA の濃度 (10 pg/nL)24 1 を注入と心室の形態を観察するゼブラフィッシュに nL。
  4. 注入 1 以前に24を示す心室 WSS を増やす造血を強化するために 1-4 細胞期でゼブラフィッシュ胚にEPO mRNA6 20 pg/nL の nL。
  5. 1 を注入中ゼブラフィッシュ 24 h E3 媒体に収縮の率が増加、50 μ M イソプロテレノール7の nL を示した24として培養しています。
  6. 各グループの 4 D LSFM イメージングを実行します。手順 2.1.1-2.1.5.2.8 の指示に従ってください。

6 時間の分数を短縮し、ボリューム変更の定量化

  1. 50、75、100、各グループの 4 D LSFM イメージングを実行 hpf。2.1.1-2.1.5.2.8 の手順に従ってください。それぞれがある心臓の壁運動のレプリケーションの 600 のノードは、各イメージを分割します。
  2. 拡張期と収縮する次の数式を使用しての間に心室の直径の変化を測定します。
    figure-protocol-12400(3)
    間隔で心室画像を読み込み可視化ソフトウェアと測定ボリューム s。
  3. 75 で実験グループごとに時間をかけて体積変化をプロット hpf と 100 hpf。

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結果

LSFM は、高解像度の 2 D と 3 D の画像を取得するためにこの原稿で使用されました。図 1 aおよび1 bに見られるように照明レンズはサンプルで光シートを指示します。光シートの薄さ、ため 1 つの平面だけが点灯します。検出レンズ照明レンズに垂直に配置されたは、照らされた面 (図 1 b) に焦点を当てた。照明?...

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ディスカッション

このプロトコルでは、我々 は 4 D イメージングを生体力学的力の変化に対応した骨梁ネットワークの発展を追跡する使用ことができることを示しています。特に、血管内皮細胞による経験豊富な剪断応力は、ノッチ シグナル伝達カスケードは、順番に肉を促進するを開始します。本稿では、我々 は、(1) gata1a MO 注入減少造血、したがってそれは壁面せん断応力を減少、抑制 (2) tnnt2a...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は人間を提供するためスタンフォード大学からウィリアム ・ タルボットに感謝の意を表したいと思いますNrg1cDNA とを提供するための UCSD からデボラ ・ Yelon、wea変異体。著者も感謝したいシンシア陳画像の取得で助けるため。この研究は (t. k. Hsiai) に NIH の HL118650 の補助金によって支えられました (t. k. Hsiai) に HL083015、HD069305 (ノースカロライナ州チーと t. k. Hsiai.) に、(t. k. Hsiai、ノースカロライナ州 Chi) に HL111437 (t. k. Hsiai) に HL129727、(r. r. Sevag パッカード) に T32HL007895 (V. メッサーシュ ミット) に HL 134613 と(J. リー) へ星をテキサス州の資金の大学.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Clontech Hifi PCR pre-mix Takara 639298PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNAGift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USAN/AUsed for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855201PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+GE HealthPlasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit  Clontech740609.25DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase Clontech2011APCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cellsClontech636763E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagentLife Technologies11668027Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kitInvitrogenAM1340Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini KitBio-Rad7326820Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8GeneToolsN/ASoftware for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNACreative BiogeneCDFH006026Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478Sigma-Aldrich T4182ErbB inhibitor
1.3.1
E3 mediumTo grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPTSigma-Aldrich D5942γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose Sigma-Aldrich A9539Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS cameraHamamatsu PhotonicsC11440-42UUsed to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira SoftwareFEI SoftwareN/AVisualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate Sigma-Aldrich 886-86-2Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad1708890Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifugeEppendorf05-400-005Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023XSigma-Aldrich 260264-93-5ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochlorideSigma-Aldrich I5627Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLABMathworksN/ACardiac mechanics analysis

参考文献

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.

The author list was updated from:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

to:

Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1

The author affiliation for Rongsong Li was updated from:

Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA

to:

College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University

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