En Vivo Photolabeling de las células en el Colon para evaluar potencial migratorio de las células hematopoyéticas en ratones neonatales

Resumen

El protocolo descrito aquí utiliza un enfoque photolabeling en ratones recién nacidos para identificar específicamente las células inmunes que emigran desde el colon a sitios extraintestinales. Esta estrategia será útil para estudiar las interacciones host microbioma en primeros años de vida.

Resumen

Comunidades bacterianas entéricas se establecen temprano en la vida e influyen en la función y desarrollo de las células inmunes. La microbiota neonatal es susceptible a numerosas influencias externas, incluyendo el uso de antibióticos y dieta, que afecta la susceptibilidad a enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Trastornos como enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) se caracterizan por una afluencia masiva de las células inmunes a los intestinos. Sin embargo, las células inmunológicas condicionadas por la microbiota además pueden emigrar fuera de los intestinos para influir en las respuestas inmunitarias en sitios extraintestinales. Por lo tanto, es necesario identificar y caracterizar las células que lleven mensajes microbianos de los intestinos a sitios distales. Aquí, describimos un método para células de etiqueta en el colon de ratones recién nacidos en vivo que permite su identificación en sitios extra intestinales después de la migración.

Introducción

El tracto gastrointestinal de mamífero alberga cientos de especies de bacterias que existen en una relación simbiótica con el huésped¹. Las células inmunes presentes en el medio local hacer una convivencia con estos microbios y establecen una barrera protectora contra invasiones de patógeno. Así, las interacciones bidireccionales entre las células inmunes y la microbiota son críticas para establecer una comunidad de comensal que educa el sistema inmunológico del host y establece el umbral de reactividad inmune a los patógenos. Cambios en la microbiana composición, o disbiosis, pueden perturban la homeostasis inmune y perturban circuitos regulatorios que frenen inflamaciones intestinales llevando a enfermedades inmune-mediadas tales como Diabetes tipo 1 y enfermedad inflamatoria intestinal^2,3 .

El período inmediatamente después del nacimiento una única ventana del desarrollo durante el cual las comunidades microbianas intestinales comienzan a establecer al mismo tiempo el sistema inmune madura⁴. La microbiota postnatal no es estable, con cambios en la composición de la comunidad que ocurren naturalmente y con frecuencia⁵. Las células inmunes que interaccionan con la microbiota residen en dos localizaciones anatómicas distintas en el intestino - la lámina propia y el epitelio intestinal⁶. Numerosos tipos de células inmunes están presentes en el intestino, incluyendo los linfocitos (como células T, células B y células linfoides innatas) así como de las células mieloides (que incluyen macrófagos, monocitos y células dendríticas). Estas células, también conocido como células hematopoyéticas, realizan multitud de funciones que preservar la barrera intestinal y mantener la homeostasis.

Además de sus funciones de reguladoras en intestinal, las células inmunes de la mucosa también pueden llevar mensajes microbianos a los sitios extra intestinales regular inmunidad sistémica^7,8,9. Esto es un área de creciente interés en la investigación y pone de relieve la necesidad de métodos identificar las células inmunes que migran fuera del tejido intestinal con el fin de sondear su función. El protocolo reportado aquí utiliza un modelo de ratón disponibles en el mercado donde una proteína fluorescente photoconvertible se explota a las células de etiqueta. Ubicuo, PhAM^suprimido ratones expresan una proteína verde fluorescente Dendra2 que esté irreversiblemente fluorescencia roja después de la activación por luz de ultravioleta (UV)¹⁰. Utilizando una cánula de fibra óptica para proporcionar luz de 405 nanómetro en el colon de ratones recién nacidos, demostramos que las células hematopoyéticas photoconverted, que originó adentro o tránsito por el colon pueden encontrarse en el bazo.

Protocolo

Animales todos los procedimientos fueron realizados con la aprobación de y de acuerdo con el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Hospital General de Massachusetts.

PRECAUCIÓN: Este protocolo implica el uso de un láser de clase 3b (LG3). LG3 gafas láser siempre deben utilizarse al utilizar este láser. Deben seguirse las directrices apropiadas de capacitación y seguridad para evitar el riesgo de lesiones.

1. diseño y montaje de láser

1. Conecte el diodo electroluminoso (LED) (405 nm, 19.3 mW, 1400 mA, fibra) para el controlador de LED vía el cable de conector M8 de 4 pines que viene conectado al LED. Con cuidado apriete el tornillo para fijar la conexión.
2. Antes de conectar el cable de parche optogenetics al LED, sujete el conector de no apertura del LED a la luz para asegurarse de que están obstrucciones visibles. Golpe en el hoyo para eliminar obstrucciones e inserte el cable de parche optogenetics en la abertura.
3. Conectar la cánula de fibra óptica a cable del remiendo optogenetics insertando la cánula en cada extremo de la funda del conector. Conecte el otro extremo de la funda del conector para el cable de interconexión.  Aplicar suficiente presión para asegurar la conexión pero tenga cuidado de no doblar o romper la fibra óptica en la cánula.
   Nota: La cánula de frágil de la fibra óptica está cubierta con el capuchón protector cada vez que el láser no está en uso.
4. Configurar el controlador de LED al modo de onda continua (CW) con la perilla de ajuste continuo en 0 y el límite actual establecido a 1,2 A.

2. Photoconversion de las células en el Colon

Nota: Ratones machos y hembras fueron expuestas a la intracolonic 405 nm luz 1-2 días después de su nacimiento y se sacrificaban antes de 1 semana de edad.

1. Fije un lugar obscuro con un acceso a una toma de corriente. Conecte el conductor del LED en la salida.
   Nota: Este procedimiento se realiza en la mínima luz blanca ya que una larga exposición de los ratones a la luz ambiental puede causar un photoconversion no deseado de las células. La luz roja se utiliza como una alternativa.
   PRECAUCIÓN: El siguiente paso implica el uso de un anestésico animal. La administración de la anestesia lleva a cabo en una campana de clase II o mediante otro sistema de depuración adecuado. La inhalación de la anestesia puede causar mareos, somnolencia o incluso pérdida del conocimiento.
2. Anestesiar el ratón por la exposición a 4-5% de isoflurano en 100% O2 en una caja de inducción. Verificar la adecuada profundidad de la anestesia firmemente pellizcando una pata trasera (sin respuesta). Mantener anestesia mediante un cono de nariz en aproximadamente 2% de isoflurano. Evitar la exposición de controlador al isoflurano por uso de una adecuada campana o dispositivo de depuración anestésico.
3. Coloque el ratón anestesiado para la exposición de intracolonic con 1 mano al pescuezo la parte posterior del ratón suavemente con el dedo índice y el pulgar. Poner el mouse al exponer el abdomen. Afloje la empuñadura si el ratón comienza a perder su color rosa o si su tasa de respiración comienza a disminuir. Asegure la cola del ratón entre el anillo y los pequeños dedos.
4. Con la otra mano, retire la tapa protectora de la cánula. Manteniendo el eje longitudinal de la cánula paralela a la línea media del ratón, inserte suavemente la cánula de fibra óptica a través del ano en el colon para que todos los 5 mm de la fibra óptica están dentro del ratón.
   Nota: Este procedimiento se realiza lentamente y con cuidado de no perforar la pared colónica. Minutos moviendo y girando de la cánula del SIDA el adelanto en el colon.
5. Ponga las gafas de seguridad y aumentar el láser actual hasta el valor máximo (completamente hacia la derecha). Mirando el abdomen traslúcido del ratón para confirmar la presencia de luz ultravioleta.
   Nota: Las gafas de seguridad de láser LG3 disminuyen considerablemente la visibilidad. Con un colega (usar equipo protector) ayudar a ponerse las gafas y encender el láser.
6. Exponer los dos puntos a la luz del láser para un total de 2 minutos retirar la cánula de aproximadamente 1 mm cada 30 s para maximizar el área luminal expuesto a la luz. Al final de 2 minutos, apague el láser.
7. Lentamente retire la cánula del ratón. Después de recuperarse de la anestesia en una jaula caliente vacía, devolver el ratón a la estructura de la casa.

3. aislamiento de los linfocitos intestinales

1. Preparar 1 L de tampón de la madeja sal equilibrada solución/becerro suero (HBSS/CS), 200 mL de tampón de la franja epitelial, 500 mL de medio de lavado y 200 mL de ácido etilendiaminotetracético (EDTA)-libre de los medios de lavado.
   Nota: Los volúmenes de reactivo se calculan un tamaño de muestra de 9.
   1. Hacer el tampón HBSS/CS (HBSS; 5% CS) mediante la adición de 50 mL de CS a 950 mL de HBSS. Guárdelo en hielo.
   2. Preparar la memoria intermedia de la franja epitelial [HBSS; 5% CS 1 mM Ditiotreitol (DTT), EDTA 5 mM; mM 15 4-(2-Hydroxyethyl) piperazina-1-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (HEPES) (pH 7.2-7.5)] añadiendo 10 mL de CS, 200 μL de TDT, 2 mL de EDTA de 0,5 M y 3 mL de tampón de HEPES de 1 M 1 M y 185 mL de HBSS. Colocar el buffer de la franja epitelial en un baño de agua de 37 ° C.
   3. Hacer los medios de lavado (HBSS; % 1 CS y 1 mM EDTA) añadiendo 5 mL de CS y 1 mL de EDTA de 0.5 M a 494 mL de HBSS. Almacenar a temperatura ambiente.
   4. Preparar los medios de lavado libre de EDTA (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES) añadiendo 2 mL de CS y 3 mL de 1 M HEPES y 195 mL de HBSS. Almacenar a temperatura ambiente.
   5. Hacer un tampón FACS [1 x de tampón fosfato salino (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] añadiendo 10 mL de CS y 490 mL de PBS. Guárdelo en hielo.
2. Preparar el plato de la colección de tejido mediante la colocación de un filtro de célula 70 μm dentro de una placa de cultivo de 60 x 10 mm. Añadir 10 mL de tampón HBSS/CS (HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 y almacenados en hielo) al plato y coloque en el hielo.
3. Eutanasia el ratón a través de una sobredosis de isoflurano inhalado mediante compactación adecuada de anestésico (una exposición de min aproximadamente 3 a > 4% de isoflurano en el aire o en el 100% O₂). Después de la aparente cesación de la respiración y reflejo movimiento, verificar la ausencia de dolor profundo firmemente pellizcando una pata trasera (se recomienda usar pinzas). Asegúrese de que la eutanasia a través de una decapitación con un par de tijeras quirúrgicas o una nueva maquinilla de afeitar recta.
   Nota: La dislocación Cervical no se recomienda para este paso debido al tamaño y edad del animal. Estos métodos son consistentes con las pautas de AVMA de 2013 sobre la eutanasia y aprobaron por el IACUC MGH.
4. La cosecha del colon con pinzas limpias y tijeras para abrir el abdomen. Reflejan los intestinos a 1 lado del abdomen del ratón para exponer los dos puntos. Quitar el colon entero por primera transecting lo apenas distal (hacia el ano) para el ciego. Luego, mientras agarra con firmeza el colon con pinzas, use tijeras para cortar a través de la uretra al recto. Corte del colon como cerca del ano como sea posible. Cosecha el bazo después de quitar los dos puntos (véase los pasos 4.1-4.2 más abajo).
   Nota: Mientras que el protocolo de photoconversion sólo objetivos de ~ 25% de puntos del recién nacido (5 mm de la cánula de fibra óptica), se cosecha todo el colon para ayudar en el aislamiento de células.
5. Limpiar el colon mediante el uso de fórceps para empujar el contenido de los dos puntos y en una toalla de papel seca. Homogeneizar el tejido mediante el uso de hojas de afeitar para picar el colon en una goma en la cubierta de una placa de cultivo y luego transferir la pasta a la coladera del celular en la caja Petri.
6. Agregar una barra de agitación magnética durante mucho tiempo de limpieza 8 mm a la coladera y coloque el plato en un plato agitador magnético de 9 posiciones. Ajustar la velocidad de la barra de agitación magnética a 800 rpm e incube las células durante 5 minutos a temperatura ambiente. Deseche el búfer y repetir el lavado con 10 mL de HBSS/CS (la HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 y almacenados en hielo). Deseche el búfer al final del lavado.
7. Disociar las células epiteliales mediante la adición de 10 mL de tampón de la franja epitelial precalentado (la HBSS; 5% CS 1mM TDT, 5mM EDTA; buffer HEPES [pH 7.2-7.5] de 15mM que se hizo en el paso 3.1.2 y almacenado en un baño de agua de 37 ° C) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 30 min en un 3 7 ° C la incubadora. Al final de la incubación, transferir el búfer enriquecido en la fracción epitelial a un tubo limpio de 15 mL.
   Nota: El epitelio y las células asociadas (intestinales células epiteliales y los linfocitos epiteliales intestinales) son liberadas en el buffer, mientras que las células en el intacto propria de la lámina quedan en el colador de la célula durante este paso¹¹.
   1. Centrifugar la fracción epitelial intestinal enriquecida (IELs) 700 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón FACS. Almacenar en el hielo para su uso en el paso 3.15.
8. Lave la fracción de lámina propia dentro de la coladera de la célula 2 x con HBSS/CS. Para ello, añadir 10 mL de solución de HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% que se hizo en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 5 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.
9. Lavar la muestra 2 x en medios de lavado. Añadir 10 mL de medio de lavado (HBSS; 1% CS y tampón de EDTA 1 mM que se hizo en el paso 3.1.3 y almacenado a temperatura ambiente) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 15 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.
   1. Después de usar los medios de lavado, tienda en el hielo para el uso en paso 3.14.
10. Lavar la muestra 2 x con HBSS CS añadir 10 mL de tampón HBSS/CS (HBSS; 5% CS almacenador intermediario en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm por 5 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.
11. Incubar el tejido en tampón de lavado libre de EDTA. Añadir 10 mL de tampón de lavado libre de EDTA (HBSS; 1% CS y 15 mM de tampón HEPES con que fue hecha en el paso 3.1.4 y almacenado a temperatura ambiente) a la coladera de la célula e incubar la placa por 10 min a temperatura ambiente sin revolver. Deseche el búfer al final de este paso.
12. Lavar la muestra 2 x con HBSS/CS y prepare la solución de enzima. Añadir 10 mL de HBSS/CS (HBSS; 5% buffer de CS en paso 3.1.1 que ha sido almacenado en hielo) de búfer a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 10 min en una incubadora de 37 ° C. Deseche el búfer después de cada lavado.
    1. Preparar la solución de enzima (EDTA libre lavado Tampón; 0,1 mg/mL DNasa I; colagenasa 167 mg/mL) durante el segundo período de lavado: Añadir 9 mg de DNasa I y 15 mg de liofilizado colagenasa a 90 mL de EDTA tapón de lavaje. Almacenar la solución a temperatura ambiente.
13. Digerir la fracción de lámina propia contenida en el filtro de la célula para obtener linfocitos de lámina propia (LPLs). Añadir 10 mL de la solución de enzima (el EDTA libre tampón de lavado; 0,1 mg/mL DNasa I; 167 mg/mL de tampón de colagenasa en paso 3.12.1 y almacenados a temperatura ambiente) a la coladera de la célula y remover a 800 rpm durante 45 minutos en una incubadora de 37 ° C.
    Nota: LPLs se liberan en la solución después de la digestión enzimática.
    1. Recoger la solución de enzima que contiene las células y filtrar con un filtro nuevo de celular en un tubo cónico de 50 mL.
14. Añadir 20 mL de medio de lavado fría (la HBSS; CS 1%, EDTA 1mM tampón hecho en paso 3.1.3 y almacenados en hielo en el paso 3.9.1) a las células de filtrado para bloquear la actividad de la colagenasa en la solución de enzima. Centrifugar el tubo a 700 x g durante 6 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene LPLs en 1 mL de tampón FACS.
15. Combinar la IEL (del paso 3.7.1) y las fracciones de la LPL (del paso 3.14) y tinción con anticuerpos conjugados con fluorescente para el análisis de citometría de flujo (ver paso 5).
    Nota: IEL y LPL fracciones pueden ser manchados por separado si se desea información del compartimiento.

4. aislamiento de linfocitos de bazo

1. Preparar el tubo de la colección agregando 500 μl de tampón FACS en un tubo de microcentrífuga. Almacenar en el hielo.
2. Después de quitar los dos puntos (paso 3.4), cosecha del bazo entero y colocarlo en el tubo de la colección. Guarde el tejido en el hielo.
3. Utilizando un homogenizador de tejido eléctrico, homogeneizar el bazo en un tubo de microcentrífuga durante aproximadamente 1 minuto centrifugar la muestra a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante.
4. Realizar la lisis de glóbulos rojos por Resuspender la muestra de 500 μl de tampón de lisis (ACK) de amonio cloruro de potasio para iniciar la muerte celular por lisis osmótica. Permita que la muestra Incubar 1-2 min a temperatura ambiente y luego lo resuspender en 725 μl de tampón FACS.
5. Centrifugar la muestra a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 500 μl de tampón FACS y filtrar a través de un tamiz de 40 μm células en un tubo nuevo de microcentrífuga. Transferir toda la muestra a un tubo nuevo de microcentrífuga y tinción con anticuerpos conjugados con fluorescente para el análisis de citometría de flujo (ver paso 5).

5. identificación de Dendra-r⁺ citometría de flujo utilizando las células

1. Centrifugar las muestras a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente y aspirado apagado el sobrenadante IEL/LPL y del bazo.
2. Resuspender el pellet en 100 μl de mezcla de la coloración del anticuerpo. Preparar el anticuerpo coloración mezcla añadiendo 1 μl de anticuerpo anti-CD45 conjugado fluorescente a 100 μl de tampón FACS por muestra.
   Nota: Es importante valorar los anticuerpos utilizados para la citometría de flujo antes del experimento para determinar la concentración óptima donde se produce la saturación de enlace.
3. Incubar las muestras durante 35 min en hielo (en un lugar obscuro).
4. Resuspender las muestras en 300 μL de tampón FACS y centrifugar a 300 x g [centrífuga micro] durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender las muestras en 325 μl de tampón FACS. Analizar las muestras en un citómetro de flujo.

Resultados

Un cable de fibra óptica fue utilizado para entregar luz de 405 nanómetro en los dos puntos de los 2 días de edad PhAM^suprimido ratones. En experimentos anteriores, una exposición de s 30 determinó dar una photoconversion máxima de células de colon con la citotoxicidad mínima (figura 1A). Por lo tanto, alternativamente 30 exposiciones de s de los diferentes segmentos del colon se llevaron a cabo como se describe en el proto...

Discusión

La identificación y caracterización de células que interactúan con y son influenciados por la microbiota del colon son importantes y deben facilitar la comprensión de cómo información del microambiente de la mucosa se transmitió al resto del cuerpo. Un método para estudiar la migración de células de intestino requiere el aislamiento de las células asociadas con tripa, seguida de una transferencia adoptiva en ratones receptores para determinar sus patrones de tejido-autoguiado hacia el blanco y función

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser
Light Emitting Diode (LED)	THORLABS	M405FP1	CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1
LED driver	THORLABS	LEDD1B	Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Optogenetics patch cable	THORLABS	M87L01	1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Fiber optic cannula	Doric lenses	MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45	5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
Power supply	THORLABS	KPS101	Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
LG3 laser safety goggles	THORLABS	LG3	Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
Red light	Electron Microscopy Sciences	74327-10	15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences
Intestinal cell isolation
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.  https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSS	Gibco	14025076	Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076
Calf Serum	Hyclone AZM	197696
EDTA	Invitrogen	15575020	0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
DTT	Sigma	10197777001	CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US
HEPES	Gibco	15630080	1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
Petri dish	Corning	353004	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
70 micron cell strainer	Falcon	352350	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Micro magnetic stir bar	Fisherbrand	1451364	Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
Magnetic stir plate	Corning Laboratory Stirrers	440826	https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
Collagenase	Roche	5401020001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase I	Sigma	10104159001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US
1X PBS	Gibco	20012-027	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
Pipet aid	Thermo Scientific	14387165	https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
10 mL serological pipet	Falcon	357530	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
25 mL serological pipet	Falcon	357515	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
15 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339651	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
50 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339653	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Single cell suspension
Eppendorf tubes	Seal-Rite	1615-5500	Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
Tissue homogenizer	Kimble	K7495400000	Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Homogenizer tips	Kimble	7495210590	Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
40 micron cell strainer	Falcon	08-771-1	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Antibodies
BV786 anti-mouse CD45	BD	564225	Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Live/Dead	Invitrogen	L34962	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Other
Razor blades	VWR	55411-050	Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades