Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais

Resumo

O protocolo descrito aqui utiliza uma abordagem photolabeling em camundongos recém-nascidos para identificar especificamente as células do sistema imunológico que emigram do cólon para sites extra intestinais. Esta estratégia será útil para estudar interações do anfitrião-microbiome no início da vida.

Resumo

Comunidades de bactérias entéricas são estabelecidas no início da vida e influenciam a função e o desenvolvimento de células imunes. A microbiota neonatal é suscetível a inúmeras influências externas, incluindo o uso de antibióticos e dieta, que afeta a susceptibilidade a doenças auto-imunes e inflamatórias. Doenças como a doença intestinal inflamatória (IBD) caracterizam-se por um afluxo maciço de células do sistema imunológico para os intestinos. No entanto, células imunes, condicionadas pela microbiota podem adicionalmente emigrar fora os intestinos para influenciar as respostas imunes locais extra intestinal. Assim, há uma necessidade de identificar e caracterizar as células que podem transportar mensagens microbianas do intestino para sites distais. Aqui, descrevemos um método para células de rótulo no cólon de ratos recém-nascidos na vivo que permite a sua identificação nos sites extra intestinais após a migração.

Introdução

O trato gastrointestinal dos mamíferos abriga centenas de espécies de bactérias que podem existirem em uma relação simbiótica com o host¹. As células do sistema imunológico presentes no meio local impor uma coexistência pacífica com estes micróbios e estabelecer uma barreira de proteção contra invasões de patógeno. Assim, bi-direcional interações entre as células do sistema imunológico e a microbiota são fundamentais para estabelecer uma comunidade comensal que educa o sistema imunológico do hospedeiro e define o limiar de reatividade imune a patógenos. Mudanças no microbiana composição, ou disbiose, pode perturbam a homeostase imune e perturbam circuitos regulamentares que conter inflamações intestinais, levando a imune-mediada doenças como a Diabetes tipo 1 e IBD^2,3 .

O período imediatamente após o nascimento é uma única do desenvolvimento durante o qual as comunidades microbianas intestinais começam a estabelecer, ao mesmo tempo, o sistema imunológico amadurece⁴. A microbiota pós-Natal não é estável, com mudanças na composição da Comunidade ocorrendo naturalmente e frequentemente⁵. As células imunitárias que interagem com a microbiota residem em duas distintas anatômicas locais no intestino - a propria do lamina e o epitélio intestinal⁶. Vários tipos de células do sistema imunológico estão presentes no intestino, incluindo linfócitos (tais como as células T, células B e células linfoides inatas), bem como de células mieloides (que incluem os monócitos, macrófagos e células dendríticas). Estas células, também conhecido como células hematopoiéticas, executam uma variedade de funções que preservam a barreira intestinal e manter a homeostase.

Além de suas funções reguladoras locais intestinal, células do sistema imunológico da mucosa também podem efectuar microbianas mensagens aos sites extra intestinais para regular a imunidade sistêmica^7,8,9. Esta é uma área de crescente interesse de pesquisa e destaca a necessidade de métodos para identificar as células imunes que migram fora tecidos intestinais, a fim de sondar a sua função. O protocolo relatado aqui utiliza um modelo de mouse disponíveis comercialmente em que uma proteína fluorescente photoconvertible é explorada para células de rótulo. PhAM^extirpado ratos ubiquitously expressam uma proteína verde fluorescente Dendra2 que é irreversivelmente ligam para fluorescência vermelha após a ativação por ultravioleta (UV) luz¹⁰. Usando uma cânula de fibra óptica para fornecer luz de nm 405 no cólon de ratos recém-nascidos, demonstramos que photoconverted de células hematopoiéticas, que se originou em ou transitar através do cólon pode ser encontrado no baço.

Protocolo

Todos os procedimentos de animais foram realizados com a aprovação de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) no Hospital Geral de Massachusetts.

Atenção: Este protocolo envolve o uso de um laser de classe 3b (LG3). Óculos de segurança do laser de LG3 sempre devem ser usados quando este laser em funcionamento. Orientações adequadas de treinamento e segurança devem ser seguidas para evitar o risco de lesões.

1. projeto e montagem de Laser

1. Se conectar o diodo emissor de luz (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fibra-acoplado) para o LED driver via o cabo conector M8 de 4 pinos que vem anexado para o LED. Com cuidado, aperte o parafuso para fixar a conexão.
2. Antes de fixar o cabo de remendo de optogenetics o LED, segure o conector não abertura do LED para a luz para assegurar-se lá são nenhuma obstrução visível. Sopre o furo para eliminar obstruções, se necessário e insira o cabo de remendo de optogenetics na abertura.
3. Conecte a cânula de fibra óptica do cabo de remendo de optogenetics por inserir a cânula em cada extremidade da manga do conector. Fixe a outra extremidade da manga do conector para o cabo de remendo.  Aplica pressão suficiente para garantir a conexão, mas tenha cuidado para não dobrar ou quebrar a fibra óptica da cânula.
   Nota: A cânula de frágil da fibra óptica é coberta com a tampa de protecção sempre que o laser não está em uso.
4. Definir o driver de LED para o modo de onda contínua (CW) com o botão de ajuste contínuo em 0 e o limite atual definido como 1.2 A.

2. Photoconversion de células do cólon

Nota: Ratos machos e fêmeas foram expostos à intracolonic 405 nm luz 1-2 dia (s) após o seu nascimento e sacrificaram-se antes de 1 semana de idade.

1. Assegurar um local escuro, com um acesso a uma tomada elétrica. O driver de LED ficha eléctrica.
   Nota: Este procedimento é realizado na luz branca mínima como uma longa exposição dos ratos a luz ambiente pode causar um indesejado photoconversion das células. Luz vermelha é usada como uma alternativa.
   Atenção: O passo seguinte envolve o uso de um anestésico de animal. A administração do anestésico tem lugar em um bairro de classe II ou usando outro sistema de eliminação adequado. A inalação de anestésico pode causar tonturas, sonolência ou até mesmo inconsciência.
2. Anestesia o mouse pela exposição aos 4-5% de isoflurano em 100% de O2 em uma caixa de indução. Verificar a profundidade apropriada da anestesia beliscando firmemente uma pata traseira (sem resposta). Manter a anestesia através de um cone de nariz em aproximadamente 2% de isoflurano. Evitar a exposição de manipulador de isoflurano pelo uso de um dispositivo de eliminação anestésico ou capuz adequado.
3. Posicione o mouse anestesiado para a exposição de intracolonic usando 1 mão à nuca, as costas do mouse suavemente com o dedo indicador e o polegar. Vire o mouse para expor o abdome. Solte o punho se o rato começa a perder sua cor-de-rosa ou se sua taxa de respiração começa a desacelerar. Prenda o rabo do mouse entre o anel e os dedos pequenos.
4. Com a outra mão, retire a capa protetora da cânula. Mantendo o longo eixo da cânula paralela à linha mediana do rato, Introduza cuidadosamente a cânula de fibra óptica através do ânus para o cólon para que todos os 5 mm da fibra óptica são dentro do mouse.
   Nota: Este procedimento é realizado lentamente e com cuidado para não perfurar a parede do cólon. Minuto se mexer e torção da cânula auxilia o avanço para o cólon.
5. Não os óculos de segurança e aumentar a laser atual para o valor máximo (todo o caminho no sentido horário). Confirme a presença da luz UV de olhar para o abdômen translúcido do mouse.
   Nota: Os óculos de segurança do laser LG3 dramaticamente diminuem a visibilidade. Tenho um colega (usando equipamentos de proteção) auxiliar na acoplando os óculos e ligar o laser.
6. Expor o cólon para a luz do laser para um total de 2 min. retirar a cânula de aproximadamente 1 mm a cada 30 s para maximizar a área luminal exposta à luz. No final de 2 min, desligue o laser.
7. Remova lentamente a cânula do mouse. Depois de se recuperar da anestesia em uma gaiola vazia quente, retorne o rato da gaiola em casa.

3. isolamento de linfócitos Intestinal

1. Preparar 1 L de tampão de soro (HBSS/CS) solução equilibrada sal/bezerro do Hank, 200 mL de tampão epitelial tira, 500 mL de mídia de lavagem e 200 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-lavagem de mídia livre.
   Nota: Os volumes de reagente são calculados para um tamanho de amostra de 9.
   1. Fazer o buffer HBSS/CS (HBSS; 5% CS) adicionando-se 50 mL de CS a 950 mL de HBSS. Armazená-lo no gelo.
   2. Preparar o buffer tira epiteliais [HBSS; 5% CS 1 mM ditiotreitol (DTT); 5 mM EDTA; ácido de piperazina-1-etanesulfónico 15mm 4-(2-Hydroxyethyl) (HEPES) (pH 7,2-7,5)], adicionando 10 mL de CS, 200 µ l de 1 M DTT, 2 mL de EDTA 0,5 M e 3 mL de tampão HEPES de 1m para 185 mL de HBSS. Coloca o tampão tira epiteliais em banho maria a 37 ° C.
   3. Fazer a mídia de lavagem (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA) adicionando-se 5 mL de CS e 1 mL de EDTA 0,5 M a 494 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.
   4. Prepare a mídia de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES), adicionando 2 mL de CS e 3 mL de 1 M HEPES a 195 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.
   5. Fazer uma reserva de FACS [1 x salina tamponada fosfato (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] adicionando 10 mL de CS a 490 mL de PBS. Armazená-lo no gelo.
2. Prepare o prato de coleção de tecidos, colocando um filtro de célula 70 µm dentro de um prato de cultura 60 x 10 mm. Adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo) para o prato e coloque-o no gelo.
3. Eutanásia o rato através de uma overdose de isoflurano inalado usando a eliminação adequada de anestésico (aproximadamente 3 min exposição a > 4% de isoflurano no ar ambiente ou em 100% O₂). Após a aparente cessação da respiração e reflex movimento, verificar a ausência de dor profunda por beliscar firmemente uma pata traseira (usar fórceps é recomendado). Certifique-se a eutanásia através de uma decapitação usando um par de tesouras cirúrgicas ou uma navalha nova.
   Nota: O deslocamento Cervical não é recomendado para esta etapa, devido ao tamanho e idade do animal. Esses métodos são coerentes com as orientações de AVMA 2013 sobre eutanásia e aprovaram pelo MGH IACUC.
4. Colheita do cólon usando pinça limpa e tesoura para abrir o abdômen. Refletem os intestinos para 1 lado do abdômen do rato para expor o cólon. Remover o cólon inteiro pela primeira cruza-lo apenas distal (na direção do ânus) para o ceco. Então, enquanto segurando firmemente o cólon com fórceps, utilize tesouras para cortar através da uretra até ao recto. Corte o cólon como perto do ânus quanto possível. Colheita do baço após a remoção do cólon (ver etapas 4.1-4.2 abaixo).
   Nota: Enquanto o protocolo de photoconversion apenas alvos ~ 25% do cólon do recém-nascido (5 mm da cânula fibra óptica), todo o cólon é colhido para ajudar no isolamento da célula.
5. Limpeza do cólon usando fórceps para empurrar o conteúdo fora do cólon e em uma toalha de papel seca. Homogeneizar o tecido usando lâminas de barbear, pique finamente o cólon em um colar na capa de um prato de cultura e depois transferir esta pasta para o filtro de célula na caixa de Petri.
6. Adicionar uma barra de agitação magnética tempo limpo 8 mm para o filtro e coloque o prato em um prato de agitador magnético 9 posições. Definir a velocidade de barra de agitação magnética para 800 rpm e incube as celulas por 5 min à temperatura ambiente. Descartar o buffer e repita a lavagem com 10 mL de HBSS/CS (o HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo). Descarte o buffer no final da lavagem.
7. Dissociar as células epiteliais, adicionando 10 mL de tampão de escaldadas tira epitelial (o HBSS; 5% CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM de tampão de HEPES [pH 7,2-7,5] que foi feita no passo 3.1.2 e armazenado em banho maria a 37 ° C) para o filtro de célula e mexa a 800 rpm por 30 min em um 3 Incubadora de 7 ° C. No final da incubação, transferi o buffer enriquecido na fração epitelial para um tubo limpo 15 mL.
   Nota: O epitélio e o associado células (células epiteliais intestinais e os linfócitos epiteliais intestinais) são liberadas para o buffer, enquanto as células no intacto do propria do lamina permanecem no filtro célula durante esta etapa¹¹.
   1. Centrifugue a fração epitelial intestinal (LAL) enriquecida a 700 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de FACS. Armazená-lo no gelo para uso na etapa 3.15.
8. Lave a fração propria do lamina dentro do filtro célula 2 x com HBSS/CS. Para fazer isso, adicionar 10 mL de solução HBSS/CS (HBSS; reserva de CS de 5% que foi feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
9. Lavar a amostra 2 x em meios de lavagem. Adicionar 10 mL de mídia de lavagem (HBSS; 1% CS; reserva de EDTA 1 mM que foi feita no passo 3.1.3 e armazenada à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 15 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
   1. Depois de usar a mídia de lavagem, armazená-lo no gelo para o uso na etapa 3.14.
10. Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS. adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; 5% CS buffer feitas na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
11. Incube o tecido em EDTA livre de tampão de lavagem. Adicionar 10 mL de tampão de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS; tampão HEPES de 15 mM que foi feito no passo 3.1.4 e armazenado à temperatura ambiente) para o filtro de célula e incubar a placa por 10 min à temperatura ambiente sem agitação. Descarte o buffer no final desta etapa.
12. Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS e preparar a solução de enzima. Adicionar 10 mL de HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) do buffer para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 10 minutos em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.
    1. Preparar a solução de enzima (EDTA livre lava tampão; 0,1 mg/mL DNase I; colagenase 167 mg/mL) durante o segundo período de lavagem: adicione 9 mg de DNase eu e 15 mg de liofilizado colagenase a 90 mL de EDTA livre wash buffer. Armazene a solução à temperatura ambiente.
13. Digeri a fração propria do lamina contida no filtro célula obter propria do lamina linfócitos (LPLs). Adicionar 10 mL da solução de enzima (o EDTA livre o tampão de lavagem; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL de tampão de colagenase feitas na etapa 3.12.1 e armazenados à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 45 min em uma incubadora de 37 ° C.
    Nota: LPLs são liberados para a solução após a digestão enzimática.
    1. Recolher a solução de enzima que contém as células e filtrar através de um novo filtro de célula para um tubo cónico de 50 mL.
14. Adicione 20 mL de lavagem frio mídia (o HBSS; 1% CS; 1mM EDTA amortecedor feita na etapa 3.1.3 e armazenado no gelo na etapa 3.9.1) para as células filtradas para bloquear a atividade de colagenase na solução enzimática. Centrifugar o tubo a 700 x g, durante 6 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo LPLs em 1 mL de tampão de FACS.
15. Combine o IEL (da etapa 3.7.1) e as frações LPL (da etapa 3.14) e manchá-las com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5).
    Nota: IEL e LPL frações podem ser manchadas separadamente se desejar informações de compartimento.

4. isolamento de linfócitos do baço

1. Prepare o tubo de coleta adicionando 500 µ l de tampão de FACS em um tubo de microcentrifugadora. Armazená-lo no gelo.
2. Após a remoção do cólon (passo 3.4), colher o baço inteiro e coloque-o no tubo de coleta. Armazene o tecido no gelo.
3. Usando um homogeneizador de elétrica, homogeneizar o baço em um tubo de microcentrifugadora de aproximadamente 1 min. centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.
4. Realizar a lise dos glóbulos vermelhos por resuspending a amostra em 500 µ l de tampão de lise de amónio-cloreto-potássio (ACK) para iniciar a morte celular por lise osmótica. Permitir que a amostra incubar 1-2 min à temperatura ambiente e então ele Resuspenda em 725 µ l de tampão de FACS.
5. Centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 500 µ l de tampão de FACS e filtrar através de um filtro de célula de 40 µm para um novo tubo de microcentrifugadora. Transferir toda a amostra para um tubo de microcentrifugadora novo e manchá-la com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5).

5. identificação de Dendra-r⁺ citometria de fluxo utilizando células

1. Centrifugar as amostras IEL/LPL e baço a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.
2. Resuspenda as pelotas em 100 µ l de anticorpo que mancha a mistura. Prepare o anticorpo que mancha a mistura adicionando 1 µ l de conjugado fluorescente anti-CD45 anticorpo a 100 µ l de tampão de FACS por amostra.
   Nota: É importante dosear os anticorpos usados para a citometria de fluxo antes do experimento para determinar a concentração ideal onde ocorre a saturação de vinculação.
3. Incube as amostras para 35 min no gelo (em um local escuro).
4. Resuspenda as amostras em 300 µ l de tampão de FACS e centrifugá-los a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 325 µ l de tampão de FACS. Analise as amostras em um citômetro de fluxo.

Resultados

Um cabo de fibra óptica foi usado para lançar 405 luz nm para os dois-pontos de 2 - velho dias PhAM^extirpado ratos. Em experimentos anteriores, determinou-se uma exposição de 30 s para dar uma photoconversion máxima de células do cólon com mínima citotoxicidade (Figura 1A). Portanto, sequencial 30 exposições de s de diferentes segmentos do cólon foram realizadas conforme descrito no protocolo. Após a exposição do lase...

Discussão

A identificação e caracterização de células que interagem com e são influenciados pela microbiota do cólon são importantes e devem facilitar a compreensão de como a informação do microambiente da mucosa é retransmitida para o resto do corpo. Um método para estudar a migração celular relacionados ao intestino requer o isolamento de células associada a barriga, seguido por uma transferência adotiva em camundongos destinatários para determinar os padrões de tecido-homing e funcionar¹²

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser
Light Emitting Diode (LED)	THORLABS	M405FP1	CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1
LED driver	THORLABS	LEDD1B	Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Optogenetics patch cable	THORLABS	M87L01	1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Fiber optic cannula	Doric lenses	MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45	5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
Power supply	THORLABS	KPS101	Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
LG3 laser safety goggles	THORLABS	LG3	Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
Red light	Electron Microscopy Sciences	74327-10	15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences
Intestinal cell isolation
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.  https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSS	Gibco	14025076	Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076
Calf Serum	Hyclone AZM	197696
EDTA	Invitrogen	15575020	0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
DTT	Sigma	10197777001	CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US
HEPES	Gibco	15630080	1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
Petri dish	Corning	353004	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
70 micron cell strainer	Falcon	352350	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Micro magnetic stir bar	Fisherbrand	1451364	Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
Magnetic stir plate	Corning Laboratory Stirrers	440826	https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
Collagenase	Roche	5401020001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase I	Sigma	10104159001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US
1X PBS	Gibco	20012-027	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
Pipet aid	Thermo Scientific	14387165	https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
10 mL serological pipet	Falcon	357530	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
25 mL serological pipet	Falcon	357515	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
15 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339651	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
50 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339653	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Single cell suspension
Eppendorf tubes	Seal-Rite	1615-5500	Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
Tissue homogenizer	Kimble	K7495400000	Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Homogenizer tips	Kimble	7495210590	Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
40 micron cell strainer	Falcon	08-771-1	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Antibodies
BV786 anti-mouse CD45	BD	564225	Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Live/Dead	Invitrogen	L34962	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Other
Razor blades	VWR	55411-050	Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades