Vivo Photolabeling hücrelerinin yenidoğan farelerde hematopoetik hücrelerin göç potansiyeli değerlendirmek için iki nokta üst üste

Özet

Burada açıklanan protokol photolabeling yaklaşım yeni doğan farelerde özellikle kolon ekstra bağırsak sitelere göç bağışıklık hücreleri tanımlamak için kullanır. Bu stratejinin ana bilgisayar-microbiome erken hayat etkileşimlerde eğitim yararlı olacaktır.

Özet

Enterik bakteri toplulukları erken yaşta kurulur ve bağışıklık hücre gelişimi ve işlevini etkiler. Yenidoğan microbiota antibiyotik kullanımı ve diyet, otoimmün ve inflamatuvar hastalıklara yatkınlık etkileri de dahil olmak üzere çok sayıda dış etkilere maruz kalabilir. Bozuklukları inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) gibi bağırsak için bağışıklık hücreleri büyük akını ile karakterizedir. Ancak, bağışıklık hücreleri tarafından microbiota şartına ayrıca bağışıklık yanıtı ekstra bağırsak sitelerdeki etkilemek için bağırsaklar dışarı göç. Böylece, tanımlamak ve bağırsak mikrobiyal iletilerden distal sitelere taşıyabilir hücreleri ayırdetmek için gerek yoktur. Burada, ekstra bağırsak sitelerde kimlik geçişten sonra sağlar yeni doğan fareler vivo içinde kolon etiket hücrelere bir yöntem açıklanmaktadır.

Giriş

Memeli gastrointestinal sistem ana makine¹ile simbiyotik bir ilişki bulunmaktadır bakteri türleri yüzlerce liman. Yerel ortamda mevcut bağışıklık hücreleri ile bu mikropların barışçıl kullanımını zorlayın ve patojen akınları karşı koruyucu bir bariyer oluşturmak. Böylece, bağışıklık hücreleri ve microbiota arasındaki çift yönlü etkileşimler ana bağışıklık sistemi eğitir ve patojenler için bağışıklık reaktivite eşiğini ayarlar komensal bir topluluk kurmak için kritik öneme sahiptir. Mikrobiyal kompozisyon veya dysbiosis, can değişimler bağışıklık homeostazı rahatsız ve huzursuz bağırsak iltihapları^2,3 tip 1 diyabet ve IBD gibi hastalıklar immün aracılı önde gelen dizginlemek düzenleyici devreler .

Sonra hemen Doğum sırasında aynı zamanda bağışıklık sistemini kurmak bağırsak mikrobiyal topluluklar başlar benzersiz bir gelişimsel pencere dönemi⁴olgunlaşır. Postnatal microbiota istikrarlı, vardiyalar halinde doğal olarak meydana gelen topluluk kompozisyon ve sık sık⁵ile değil. İki farklı anatomik konumda bağırsak - lamina propria ve bağırsak epitel⁶microbiota ile etkileşim bağışıklık hücreleri bulunur. Çeşitli tiplerde bağışıklık hücreleri lenfositler (T hücreleri, B hücreleri ve doğuştan gelen lenfoid hücre gibi) (hangi katmak dendritik hücreler, monosit ve makrofajlar) myeloid hücrelerin yanı sıra dahil bağırsak, mevcut. Bu hücreler, olarak da bilinen hematopoetik hücreler, çok sayıda bağırsak bariyer korumak ve homeostazı korumak işlevler gerçekleştirin.

Bağırsak siteleri kendi düzenleyici işlevlerine ek olarak, mukoza bağışıklık hücreleri sistemik dokunulmazlık^7,8,9düzenleyen mikrobiyal iletileri ekstra bağırsak sitelere de taşıyabilir. Bu araştırma ilgi alanıdır ve onların işlevini prob için bağırsak dokusu dışında geçirmek bağışıklık hücreleri tanımlamak yöntemleri ihtiyacını vurgular. Rapor burada protokol photoconvertible floresan protein etiket hücrelere istismar edilir bir ticari olarak mevcut fare modeli kullanır. PhAM^eksize fareler ubiquitously ultraviyole (UV) ışık¹⁰tarafından geri dönüşümsüz etkinleştirme üzerine kırmızı floresans için açık yeşil bir floresan Dendra2 protein hızlı. Yeni doğan farelerin kolon 405 nm ışık sağlamak için fiber optik kanül kullanarak, kaynaklı veya kolon aktarıldığı photoconverted hematopoetik hücreler, dalak bulunabilir göstermektedir.

Protokol

Tüm hayvan yordamları ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Massachusetts General Hospital onayı ile gerçekleştirilmiştir.

Dikkat: Bu protokol bir sınıf 3b lazer (LG3) kullanımını gerektirir. LG3 lazer koruyucu gözlük her zaman bu lazer çalışırken kullanılması gerekir. Yaralanma riskini önlemek için uygun eğitim ve güvenlik yönergelere uyulmalıdır.

1. tasarım ve lazer montajı

1. Işık yayan diyot (LED) bağlanmak (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fiber birleştiğinde) LED sürücü üzerinden için LED için gelir 4 pinli M8 bağlantı kablosu bağlı. Dikkatli bir şekilde bağlantı tutturmak için sıkıştırın.
2. Optogenetics bağlantı kablosu için LED eklemeden önce bağlayıcı tutun LED kadar açılış orada emin olmak için ışık görünür hiçbir engel vardır. Eğer gerekli herhangi bir engelleri ortadan kaldırmak ve optogenetics bağlantı kablosu ataşını delik üfle.
3. Fiber optik kanül kanül bağlayıcı kol bir ucunu ekleyerek optogenetics bağlantı kablosu bağlayın. Bağlayıcı kol diğer ucunu bağlantı kablosu takın.  Güvenli bağlantı ama değil viraj veya fiber optik kanül kırmak için dikkatli olmak için yeterli basınç uygulayın.
   Not: her ne zaman lazer kullanmak değildir kırılgan fiber optik kanül koruyucu başlığı ile kaplıdır.
4. LED sürücü 0 ile 1.2 A. ayarlanmış geçerli sınırı sürekli ayar düğmesi ile sürekli dalga (CW) moduna ayarla

2. Photoconversion iki nokta üst üste hücrelerinin

Not: Erkek ve dişi fareler intracolonic 405 nm ışık için 1-2 gün sonra kendi Doğum maruz kaldılar ve yaş 1 hafta önce kurban edildi.

1. Karanlık bir yerde bir elektrik prizine bir erişim ile güvenli. LED sürücü sokunuz.
   Not: ortam ışığı farelerin uzun bir pozlama istenmeyen bir photoconversion hücrelerinin neden olabilir gibi bu yordamı en az beyaz ışık içinde gerçekleştirilir. Kırmızı ışık alternatif olarak kullanılır.
   Dikkat: Aşağıdaki adımı bir hayvan anestezik kullanımını gerektirir. Anestezi Yönetimi Sınıf II başlıklı veya başka bir uygun atma sistemi kullanılarak gerçekleşir. İnhalasyon anestezi baş dönmesi, uyuşukluk veya hatta bilinç kaybı neden olabilir.
2. 4-%5 isoflurane % 100 O2 bir indüksiyon kutusunda maruz fare anestezi. Uygun anestezi derinliği sıkıca arka pençe (cevap yok) pinching tarafından doğrulayın. Anestezi burun konisi, yaklaşık % 2 isoflurane üzerinden korumak. İşleyici isoflurane bir uygun başlık veya anestezik atma aygıt kullanımı ile etkilenmemek.
3. İntracolonic maruz imzalat fare scruff fare arkası için 1 el yavaşça işaret parmağı ve başparmak ile kullanarak yerleştirin. Karın ortaya çıkarmak için fareyi çevirin. Fare pembe rengini kaybetmeye başlar yoksa onun solunum hızı yavaş başlar kavrama gevşetin. Fare kuyruğu halka ve küçük parmaklar arasındaki güvenli.
4. Diğer elini de koruyucu başlığı kanül kaldırın. Süre paraca desteklemek fare orta hat için paralel kanül uzun ekseninin hafifçe yerleştirin fiber optik kanül anüs yoluyla kolon böylece tüm 5 mm Fiber optik fare içinde.
   Not: Bu yordam yavaş yavaş ve kolon duvar sorgulamaktı değil özenle yapılır. Kıpır kıpır ve kanül büküm dakika içine kolon ilerleme yardımcı olur.
5. Koruyucu gözlük don ve maksimum değerine (sonuna kadar saat yönünde) geçerli lazer artırmak. UV ışık varlığı fare karın yarı saydam bakarak onaylayın.
   Not: LG3 lazer koruyucu gözlük görünürlüğünü önemli ölçüde azaltır. Var bir meslektaşım (giyiyor koruyucu donanım) gözlük donning ve yardımcı üzerine lazer dönüm.
6. 2 dk. geri kanül yaklaşık 1 mm toplam lazer ışığı kolona her 30 maruz ışığa maruz luminal alanı en üst düzeye çıkarmak için s. Lazer 2 dk sonunda devre dışı.
7. Yavaş yavaş kanül fare kaldırın. Anestezi boş bir sıcak kafeste üzerinden geri aldıktan sonra fare ev kafese geri.

3. yalıtım bağırsak lenfositler

1. Hank'in dengeli tuz çözüm/buzağı serum (HBSS/CS) arabelleği 1 L, epitel şerit arabellek 200 mL, 500 mL yıkama medya ve ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 200 mL hazırlamak-ücretsiz yıkama medya.
   Not: Reaktif birimleri 9 Örneklem büyüklüğü için hesaplanır.
   1. HBSS/CS tampon (HBSS; %5 CS) HBSS için 950 mL 50 mL CS ekleyerek getirin. Onu buza saklayın.
   2. [HBSS; %5 CS; 1 mM dithiothreitol (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES) (pH 7.2-7,5)] epitel şerit arabellek için 185 mL CS, 1 M DTT, 0,5 M EDTA 2 mL ve 1 M HEPES tampon 3 mL 200 µL 10 mL ekleyerek hazırlamak HBSS. 37 ° C su banyosu epitel şerit arabellekte bir yer.
   3. (HBSS; % 1 CS; 1 mM EDTA) yıkama medya CS 5 mL ve 1 mL 0.5 M EDTA HBSS 494 mL için ekleyerek getirin. Oda sıcaklığında saklayın.
   4. EDTA içermeyen yıkama medya (HBSS; % 1 CS; 15 mM HEPES) 195 mL HBSS 2 mL CS ve 3 mL 1 m HEPES ekleyerek hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
   5. Bir FACS tampon yapmak [1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x (pH 7.2 =); % 2 CS] CS 10 mL PBS için 490 mL ekleyerek. Onu buza saklayın.
2. Doku toplama yemek bir 70 µm hücre süzgeç bir 60 x 10 mm Kültür çanak koyarak hazırlamak. Yemek için HBSS/CS tampon (HBSS; 3.1.1. adımda yapılan ve buz üzerinde depolanan % 5 CS arabellek) 10 mL ekleyin ve buz üzerinde yerleştirin.
3. Fare ile inhale isoflurane uygun anestezi atma işlemini kullanarak aşırı dozda ötenazi (yaklaşık 3 dk Riziko > % 4 isoflurane Oda hava veya %100 O₂). Sonra belirgin nefes kesilmesi ve refleks hareketi, derin ağrı yokluğu sıkıca bir arka pençe pinching tarafından doğrulayın (forseps kullanarak önerilir). Ötenazi ile cerrahi makas ya da yeni bir usturanın kullanarak bir işten çıkarma emin olun.
   Not: Servikal yerinden çıkması boyutu ve hayvan yaş nedeniyle bu adım için tavsiye edilmez. Bu yöntemler üzerinde ötenazi 2013 travma yönergeleri ile tutarlı olduğundan ve MGH IACUC tarafından onaylandı.
4. Karın açmak için temiz forseps ve makas kullanarak kolon hasat. Bağırsak kolon ortaya çıkarmak için fare karın 1 tarafına yansıtır. İlk o (doğru anüs) sadece distal transecting tarafından tüm kolon kaldırmak çekum için. Sonra iki nokta üst üste forseps ile sıkıca açgözlü iken, makas üretra Rectuma kesmek için kullanın. Anüs mümkün olduğunca yakın olarak kolon kesme. Dalak Kolonu çıkardıktan sonra hasat (bkz: 4.1-4.2 aşağıdaki adımlar).
   Not: photoconversion iletişim kuralı yalnızca ~ % 25 yenidoğan'ın kolon (fiber optik kanül 5 mm) hedefleyen iken, tüm kolon hücre yalıtım modunda yardım için hasat edilir.
5. İki nokta üst üste iki nokta üst üste ve kuru kağıt havlu üzerine içeriğini itmek için forseps kullanarak temizleyin. Doku ince bir kültür yemek kapağında bir hamur içine iki nokta üst üste doğrayın ve bu hamur hücre süzgeç Petri kabına aktarmak için jilet kullanarak lunaparkçı.
6. Temiz 8 mm uzun manyetik heyecan çubuğu için süzgeç ekleme ve çanak 9-pozisyon manyetik karıştırıcı tabağa yerleştirin. Manyetik heyecan bar hızını ayarlamak için 800 devir/dakika ve oda sıcaklığında 5 min için hücreleri kuluçkaya. Arabellek atın ve 10 mL HBSS/CS (HBSS; 3.1.1. adımda yapılan ve buz üzerinde depolanan % 5 CS arabellek) kullanarak yıkama yineleyin. Arabellek yıkama sonunda atmak.
7. Epitel hücreleri prewarmed epitel şerit arabellek (HBSS % 5 CS 1 mM DTT; 5 mM EDTA; 3.1.2 adımda yapılan ve 37 ° C su banyosu içinde depolanmış 15 mM HEPES [pH 7.2-7,5] arabellek) 10 mL ekleyerek hücre süzgeç ayırmak ve 30 dk içinde 3 için 800 rpm'de karıştırın 7 ° C inkübatör. İnkübasyon sonunda, epitel kesir bir temiz 15 mL tüp için zenginleştirilmiş arabellek aktarın.
   Not: sağlam lamina propria hücrelerde hücre süzgeç sırasında bu adım¹¹kalırken epitel ve ilişkili hücreleri (bağırsak epitel hücreleri ve bağırsak epitel lenfositler) arabelleği serbest.
   1. Zenginleştirilmiş Bağırsak epitel kesir (IELs) vasıl 700 x g için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve hücre Pelet FACS arabellek 1 mL resuspend. Kullanılmak üzere adım 3,15 buzda saklayın.
8. 2 hücre süzgeç içinde lamina propria kesir yıkama x HBSS/CS ile. Bunu yapmak için 10 mL HBSS/CS çözeltisi (HBSS; buz üzerinde depolanan adım 3.1.1 yapıldı % 5 CS arabellek) hücre süzgeç ekleyin ve 37 ° C kuluçka 5 min için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.
9. Örnek 2 yıkama yıkama medya x. Yıkama medya (HBSS; % 1 CS; adım 3.1.3 ve oda sıcaklığında depolanmış 1 mM EDTA arabellek) 10 mL hücre süzgeç ekleyin ve 15 dakika 37 ° C kuluçka 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.
   1. Yıkama medya kullandıktan sonra adım 3.14 kullanımda buzda saklayın.
10. Örnek 2 yıkama x HBSS ile/CS. 10 mL HBSS/CS tampon (HBSS; buz üzerinde depolanan 3.1.1. adımda yapılan % 5 CS arabellek) hücre süzgeç ekleyin ve 37 ° C kuluçka 5 min için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.
11. EDTA içermeyen yıkama arabellek dokusunda kuluçkaya. 10 mL EDTA içermeyen yıkama arabellek (HBSS; % 1 CS; 3.1.4. adımda yapılan ve oda sıcaklığında depolanmış 15 mM HEPES tampon) hücre süzgeç ekleyin ve karıştırma olmadan oda sıcaklığında 10 dakika plaka kuluçkaya. Bu adımın sonundaki arabellek atmak.
12. Örnek 2 yıkama x HBSS/CS ile ve enzim çözüm hazırlamak. HBSS/CS (HBSS; % 5 CS arabellek buz üzerinde depolanan adım 3.1.1 yapılan) 10 mL ekleyin arabellek hücre süzgeç ve 10 dk 37 ° C kuluçka için 800 rpm'de karıştırın. Arabellek her yıkama sonra atın.
    1. Enzim çözüm hazırlamak (EDTA içermeyen yıkama arabellek; 0.1 mg/mL DNaz ben; 167 mg/mL collagenase) ikinci yıkama süresi boyunca: 9 mg eklemek DNaz ben ve 15 mg liyofilize collagenase 90 mL EDTA ücretsiz için arabellek yıkayın. Çözüm, oda sıcaklığında saklayın.
13. Lamina propria lenfositler (LPLs) elde etmek için hücre süzgeç bulunan lamina propria kesir sindirmek. Enzim çözüm 10 mL ekleyin (EDTA ücretsiz yıkama arabellek; 0.1 mg/mL DNaz ben; 3.12.1 adımda yapılan ve oda sıcaklığında depolanan 167 mg/mL collagenase arabellek) hücre süzgeç için ve 45 dk 37 ° C kuluçka için 800 rpm'de karıştırın.
    Not: LPLs sonra enzimatik sindirim çözüm içine salınır.
    1. Hücreleri içeren enzim çözüm toplamak ve 50 mL konik tüp içine yeni bir hücre süzgeç aracılığıyla filtre.
14. 20 mL soğuk yıkama medya (HBSS; % 1 CS; 1 mM EDTA made ın adım 3.1.3 ve saklı 3.9.1. adımda buzda arabellek) enzim çözüm collagenase faaliyetleri engellemek için filtre uygulanmış hücreleri ekleyin. Tüp vasıl 700 x g oda sıcaklığında 6 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak ve LPLs 1 mL FACS arabellek içeren pelet resuspend.
15. IEL (Kimden adım 3.7.1) ve lipoprotein LİPAZ (Kimden adım 3.14) kesirler birleştirir ve onları floresan Birleşik antikorlar akış sitometrik çözümlemesi ile leke (bkz. Adım 5).
    Not: bölme bilgi isterseniz IEL ve lipoprotein LİPAZ kesirler ayrı ayrı lekeli.

4. yalıtım lenfositleri dalak üzerinden

1. Toplama tüp microcentrifuge tüp içine 500 µL FACS arabelleği ekleyerek hazırlayın. Onu buza saklayın.
2. İki nokta üst üste (adım 3.4) kaldırma sonra bütün dalak hasat ve toplama tüpü yerleştirin. Doku buz üstünde depolar.
3. Bir elektrik doku homogenizer kullanarak, dalak yaklaşık 1 dk. santrifüj microcentrifuge tüp içinde 300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de örnek lunaparkçı.
4. Kırmızı kan hücre lizis 500 µL amonyum klorür potasyum (ACK) lizis arabelleği hücre ölümü tarafından ozmotik lizis başlatmak için örnek resuspending tarafından gerçekleştirin. Örnek 1-2 dk oda sıcaklığında kuluçkaya ve sonra FACS arabellek 725 µL içinde resuspend izin.
5. 300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi. Pelet FACS arabellek 500 µL içinde resuspend ve yeni microcentrifuge tüp içine 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre. Tüm örnek için yeni bir microcentrifuge tüp aktarmak ve floresan Birleşik antikorlar akış sitometrik çözümlemesi ile leke (bkz. Adım 5).

5. Dendra-r⁺ hücreleri kullanarak akış sitometresi tanımlaması

1. 300 x g [mikro santrifüj] oda sıcaklığında ve aspiratı süpernatant kapalı 5 min için de IEL/LPL ve dalak örnekler santrifüj kapasitesi.
2. Granül mix boyama antikor 100 µL içinde resuspend. Mix 1 µL fluorescently Birleşik anti-CD45 antikor FACS arabelleği örnek başına 100 µL ekleyerek boyama antikor hazırlayın.
   Not: Deneme önce akış sitometresi için en uygun konsantrasyonu belirlemek için Doygunluk bağlama oluştuğu kullanılan antikor titre önemlidir.
3. Örnekleri (karanlık bir konumda) buz üzerinde 35 dk için kuluçkaya.
4. Örnekleri FACS arabellek 300 µL içinde resuspend ve onları vasıl 300 x g [mikro santrifüj] için oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve örnekleri FACS arabellek 325 µL içinde resuspend. Akış Sitometresi örneği analiz.

Sonuçlar

Bir fiber optik kablo 405 nm ışık iki nokta üst üste^eksize 2 - gün eski PhAM farelerin teslim etmek için kullanıldı. Önceki deneyler, 30 s maruz kalma en az sitotoksisite (Şekil 1A) ile iki nokta üst üste hücre maksimal photoconversion vermek tespit edilmiştir. Bu nedenle, sıralı 30 s Etkilenmeler kolon farklı kesimlerinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi yapılmıştır. Lazer pozlama, fareler hemen eut...

Tartışmalar

Kimlik ve çalışabileceği ve bağırsaktaki microbiota etkilenmiştir hücrelerin karakterizasyonu önemlidir ve mukozal microenvironment bilgilerinden vücudun geri kalanına nasıl geçirilir anlayış kolaylaştıracaktır. Gut ile ilgili hücre geçiş çalışmak için bir yöntem yalıtımı gut ilişkili hücre tarafından evlat edinen bir transfer alıcı fareler onların doku-posta desenlerini belirlemek ve^12,13işlev takip gerektirir. Aktarılan beli...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser
Light Emitting Diode (LED)	THORLABS	M405FP1	CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1
LED driver	THORLABS	LEDD1B	Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Optogenetics patch cable	THORLABS	M87L01	1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Fiber optic cannula	Doric lenses	MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45	5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
Power supply	THORLABS	KPS101	Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
LG3 laser safety goggles	THORLABS	LG3	Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
Red light	Electron Microscopy Sciences	74327-10	15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences
Intestinal cell isolation
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.  https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSS	Gibco	14025076	Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076
Calf Serum	Hyclone AZM	197696
EDTA	Invitrogen	15575020	0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
DTT	Sigma	10197777001	CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US
HEPES	Gibco	15630080	1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
Petri dish	Corning	353004	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
70 micron cell strainer	Falcon	352350	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Micro magnetic stir bar	Fisherbrand	1451364	Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
Magnetic stir plate	Corning Laboratory Stirrers	440826	https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
Collagenase	Roche	5401020001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase I	Sigma	10104159001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US
1X PBS	Gibco	20012-027	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
Pipet aid	Thermo Scientific	14387165	https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
10 mL serological pipet	Falcon	357530	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
25 mL serological pipet	Falcon	357515	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
15 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339651	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
50 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339653	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Single cell suspension
Eppendorf tubes	Seal-Rite	1615-5500	Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
Tissue homogenizer	Kimble	K7495400000	Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Homogenizer tips	Kimble	7495210590	Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
40 micron cell strainer	Falcon	08-771-1	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Antibodies
BV786 anti-mouse CD45	BD	564225	Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Live/Dead	Invitrogen	L34962	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Other
Razor blades	VWR	55411-050	Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades