В естественных условиях Photolabeling клеток в толстой кишке оценить мигрирующих потенциал гемопоэтических клеток новорожденных мышей

Резюме

Протокол, описанные здесь использует photolabeling подход у новорожденных мышей конкретно определить иммунные клетки, которые эмигрировать из толстой кишки экстра кишечных сайтов. Эта стратегия будет полезным для изучения взаимодействия хост микрофлора в начале жизни.

Аннотация

Кишечных бактериальных сообществ устанавливаются в начале жизни и влияние развития иммунных клеток и функции. Новорожденных микробиоты подвержен многочисленных внешних воздействий, включая использование антибиотиков и диету, которая влияет на восприимчивость к воспалительных и аутоиммунных заболеваний. Расстройств, таких как воспалительные заболевания кишечника (IBD) характеризуется массовым притоком иммунных клеток кишечника. Однако иммунные клетки, обусловлено микробиоты дополнительно могут эмигрировать из кишечника влиять иммунные реакции на экстра кишечных сайтов. Таким образом существует необходимость выявления и характеризуют клетки, которые могут нести микробной сообщений на дистальном сайты из кишечника. Здесь мы описываем метод метка ячейки в толстой кишки новорожденных мышей в естественных условиях , позволяет их идентификации в экстра кишечных сайтов после миграции.

Введение

У млекопитающих желудочно-кишечного тракта затаивает сотни видов бактерий, которые существуют в симбиотические отношения с узла¹. Иммунные клетки присутствуют в местной обстановке обеспечить мирное сосуществование с этими микробами и создать защитный барьер против возбудителя вторжений. Таким образом двунаправленного взаимодействия между иммунные клетки и микробиоты имеют решающее значение для создания синантропных сообщества, воспитывает хост иммунной системы и устанавливает порог для иммунной реактивности патогенов. Изменения в микробного состава, или дисбактериоз, могут нарушить иммунного гомеостаза и возмущают регулирования цепей, которые сдерживают кишечных воспалений, привело к иммунной системы заболеваний как диабет 1 типа и IBD^2,3 .

В период сразу после рождения — это уникальный развития окно, во время которого кишечного микробного общины начинают установить в то же время иммунной системы созревает⁴. Послеродовые микробиоты не является стабильным, с изменениями в составе сообщества, естественным и часто⁵. Иммунные клетки, которые взаимодействуют с микробиоты находятся в двух различных анатомических местах в кишечнике - lamina propria и кишечного эпителия⁶. Многочисленные виды иммунные клетки присутствуют в кишечнике, включая лимфоцитов (например, Т-клетки, клетки B и врожденной лимфоидных клеток), а также миелоидных клеток, (которые включают дендритные клетки, моноциты и макрофаги). Эти клетки, также известный как кроветворные клетки, выполняют множество функций, которые сохраняют кишечный барьер и поддержания гомеостаза.

Помимо своих регулирующих функций на кишечные участках иммунные клетки слизистой оболочки также могут нести микробной сообщений экстра кишечных сайты регулировать системного иммунитета^7,8,9. Это вызывает растущий интерес исследования и подчеркивает необходимость методов для выявления иммунных клеток, которые мигрируют из кишечных тканей для того чтобы зондировать их функции. Протокол, сообщили здесь использует модель коммерчески доступных мыши, в котором photoconvertible флуоресцентный белок используется метка ячейки. Фам^{подакцизным} мышей повсеместно выражают Зеленый флуоресцирующий белок Dendra2, которое необратимо переключен в красной флуоресценции после активации ультрафиолетового (УФ) света¹⁰. С помощью волоконно оптические канюля для доставки 405 нм свет в ободочную кишку новорожденных мышей, мы демонстрируем, что photoconverted гемопоэтических клеток, которые возникли в или транзитом через двоеточие можно найти в селезенке.

протокол

Все животные процедуры выполнялись с одобрения и в соответствии с институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в Massachusetts General Hospital.

Предупреждение: Этот протокол включает в себя использование класса 3b лазер (LG3). LG3 лазерный защитные очки должны всегда использоваться при эксплуатации этого лазера. Соответствующие руководящие принципы подготовки и безопасности необходимо соблюдать во избежание риска получения травм.

1. Проектирование и монтаж лазера

1. Подключите светоизлучающих диодов (СИД) (405 нм, 19.3 МВт, 1400 мА, волокна в сочетании) Светодиодный драйвер через 4-контактный кабель разъем M8, который приходит придает к LED. Тщательно затяните винт, чтобы закрепить соединение.
2. Перед присоединением Оптогенетика патч-кабель к LED, удерживая соединитель до открытия светодиод свет, чтобы обеспечить там являются никаких видимых препятствий. Удар на отверстие для устранения любых препятствий, в случае необходимости и вставьте Оптогенетика патч-кабель в отверстие.
3. Подключите волоконно оптические канюля для патч-кабель Оптогенетика, вставив канюли в любом конце соединительная муфта. Подсоедините другой конец соединительная муфта для патч-кабель.  Придайте давление, достаточное для безопасного соединения, но будьте осторожны, чтобы не согнуть или сломать оптического волокна в канюлю.
   Примечание: Хрупкие волокна оптические канюля покрыта защитный колпачок когда лазер не используется.
4. Установите драйвер светодиода непрерывная волна (CW) режим с непрерывной регулировочной на 0 и текущий предел равным 1,2 а.

2. Photoconversion клеток в толстой кишке

Примечание: Мужские и женские мышей были подвержены intracolonic 405 нм свет 1-2 дней после их рождения и были принесены в жертву до недельного возраста.

1. Закрепите темных местоположения с доступом к электрической розетке. Подключите к розетке светодиодный драйвер.
   Примечание: Эта процедура выполняется в минимальной белый свет как длительного воздействия мышей рассеянный свет может вызвать нежелательные photoconversion клеток. Красный свет используется в качестве альтернативы.
   Предупреждение: Следующий шаг предполагает использование анестезии животного. Администрация анестетиков происходит в капюшоне II класса или с помощью другой соответствующей очистки системы. Ингаляционная анестезия может вызвать головокружение, сонливость или даже потеря сознания.
2. Анестезировать мыши подвержением к 4-5% изофлюрановая в 100% O2 в поле индукции. Проверьте правильное глубины анестезии, твердо щипать задние лапы (нет ответа). Поддержание анестезии через носовой конус на приблизительно 2% изофлюрановая. Предотвращения воздействия обработчик изофлюрановая путем использования соответствующей капот или цистит очистки устройства.
3. Позиции наркотизированных мыши для intracolonic воздействия с помощью 1 руку загривок задней части мыши нежно с указательным и большим пальцем. Переверните мышь подвергать живота. Отвинтите захват, если мышь начинает терять свой розовый цвет или если его частота дыхания начинает замедляться. Закрепите хвост мыши между кольцом и пальчиками.
4. С другой стороны удалите защитный колпачок из канюли. При сохранении длинной оси канюля параллельно мыши срединной линии, аккуратно вставьте волоконно оптические канюля через анус в толстую кишку, так что все 5 мм оптического волокна внутри мыши.
   Примечание: Эта процедура выполняется медленно и с осторожностью, чтобы не перфорации кишечника стены. Минуту шевелить и скручивания канюлю СПИДа по улучшению в ободочную кишку.
5. Надеть защитные очки и увеличить лазерного текущее максимальное значение (до упора по часовой стрелке). Подтвердите наличие УФ-излучения, глядя на полупрозрачный брюшко мыши.
   Примечание: LG3 лазерной безопасности очки резко уменьшить видимость. У коллеги (ношение защитного оборудования) помощь в надевать очки и включения лазера.
6. Разоблачить двоеточие для лазерного света для в общей сложности 2 мин снять канюлю примерно 1 мм каждые 30 s для максимизации области Люминал, на свету. В конце 2 мин выключите лазер.
7. Медленно извлеките катетер из мыши. После восстановления от анестезии в пустой теплой клетке, вернуться домой клетку мыши.

3. изоляция кишечных лимфоцитов

1. Подготовка 1 Л Хэнк сбалансированный соли раствора/теленка сыворотки (HBSS/CS) буфера, 200 мл эпителиальных полосы буфера, 500 мл мыть СМИ и 200 мл Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)-бесплатная стирка СМИ.
   Примечание: Объемы реагентов рассчитаны на выборке из 9.
   1. Сделайте в HBSS/CS буфер (HBSS; 5% CS), добавляя 50 мл CS до 950 мл HBSS. Храните его на льду.
   2. Подготовить эпителиальных полосы буфера [HBSS; 5% CS; 1 мм Дитиотреитол (DTT); ЭДТА 5 мм и 15 мм 4-(2-Hydroxyethyl) пиперазина-1-ethanesulfonic кислота (HEPES) (рН 7,2-7.5)], добавив 10 мл CS, промаркированные DTT 1 М, 2 мл 0,5 М ЭДТА и 3 мл 1 М HEPES буфера до 185 мл в HBSS. Место эпителиальных полосы буфера в ванну воды 37 ° C.
   3. Сделайте мыть СМИ (HBSS; 1% CS 1 мм ЭДТА), добавив 5 мл CS и 1 мл 0,5 М ЭДТА 494 мл HBSS. Храните при комнатной температуре.
   4. Подготовьте ЭДТА бесплатная стирка СМИ (HBSS; 1% CS; 15 мм HEPES) путем добавления 2 мл CS и 3 мл 1 м HEPES 195 мл HBSS. Храните при комнатной температуре.
   5. Сделать СУИМ буфера [1 x-фосфатный буфер (PBS) (рН = 7.2); 2% CS] путем добавления 10 мл CS 490 мл ФСБ. Храните его на льду.
2. Приготовить блюдо ткани коллекции, поместив стрейнер 70 мкм клеток внутри культуры блюдо 60 x 10 мм. Добавить 10 мл HBSS/CS буфера (HBSS; 5% CS буфер в действии 3.1.1 и хранятся на льду) на блюдо и поместить его на льду.
3. Усыпить мыши через передозировка вдыхаемого изофлюрановая, используя соответствующую очистку анестетика (примерно 3 мин подверженности > 4% изофлюрановая воздуха в помещении или в 100% O₂). После очевидной прекращение дыхания и рефлекторных движения, проверить отсутствие глубокой боли, крепко сжимая задние лапы (с помощью щипцов рекомендуется). Обеспечить эвтаназии через обезглавливание, используя хирургические ножницы или новой бритвой.
   Примечание: Шейки матки вывих не рекомендуется для этот шаг из-за размера и возраста животного. Эти методы согласуются с руководящими принципами AVMA 2013 эвтаназии и одобрен MGH IACUC.
4. Урожай толстой кишки с использованием чистого щипцами и ножницы для открытия живота. Отражать кишечника в 1 сторону мыши живота подвергать толстой кишки. Удалите весь толстой кишки, первый transecting, он просто дистального (в сторону ануса) до слепой кишки. Затем при этом твердо захватывая толстой кишки с щипцами, используйте ножницы, чтобы вырезать через уретру к прямой кишке. Вырежьте Колон как вблизи ануса как можно скорее. Урожай селезенке после удаления толстой кишки (см. шаги 4.1-4.2 ниже).
   Примечание: в то время как протокол photoconversion только цели ~ 25% новорожденных толстой кишки (5 мм волокна оптические канюли), всей толстой кишки собирают для помощи в изоляции клеток.
5. Очистите двоеточие, используя пинцет подтолкнуть содержимое из толстой кишки и на сухой салфеткой. Однородный ткани с помощью лезвия мелко нарезать толстой кишки в пасту на обложке культуры блюдо и затем передать эту пасту на клетки ситечко в чашке Петри.
6. Добавить панель чистой 8 мм длиной магнитные перемешать в ситечко и поместите блюдо на пластине 9-позиция магнитной мешалкой. Установите скорость бар магнитные перемешать до 800 об/мин и инкубации клеток для 5 мин при комнатной температуре. Сбросить буфер и повторите мыть с помощью 10 мл HBSS/CS (HBSS; 5% CS буфер в действии 3.1.1 и хранятся на льду). Сбросить буфер в конце стирки.
7. Отделить эпителиальных клеток, добавив 10 мл подогретую эпителиальных полосы буфера (HBSS; 5% CS 1 мм DTT; 5 мм ЭДТА; буфер HEPES [pH 7,2-7.5] 15 мм, что было сделано в шаге 3.1.2 и хранятся в ванну воды 37 ° C) для ячейки сита и перемешать на 800 об/мин за 30 мин в 3 7 ° C инкубатор. В конце инкубации передачи буфера, обогащенный эпителиальных дробь к чистой 15 мл.
   Примечание: Эпителия и связанные клетки (клеток кишечного эпителия и кишечного эпителия лимфоцитов) выпускаются в буфер, в то время как клетки в неповрежденной lamina propria остаются на сито клеток во время этого шага¹¹.
   1. Центрифуга обогащенного кишечного эпителия фракции (IELs) на 700 g x 5 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл буфера СУИМ. Храните его на льду для использования на этапе 3.15.
8. Вымойте lamina propria фракция в пределах ячейки сито 2 x с HBSS/CS. Чтобы сделать это, добавьте 10 мл раствора HBSS/CS (HBSS; буфера CS 5%, что было сделано в шаге 3.1.1, который был сохранен на льду) клеток ситечко и размешать на 800 об/мин за 5 мин в инкубаторе 37 ° C. Сбросить буфер после каждой стирки.
9. Вымойте образца 2 x в средствах массовой информации мыть. Добавить 10 мл мыть СМИ (HBSS; 1% CS 1 мм ЭДТА буфера, что было сделано в шаге 3.1.3 и хранятся при комнатной температуре) в ячейку ситечко и размешать на 800 об/мин за 15 мин в инкубаторе 37 ° C. Сбросить буфер после каждой стирки.
   1. После использования вымойте СМИ, храните его на льду для использования на этапе 3.14.
10. Вымойте образца 2 x с HBSS/CS. Добавить 10 мл HBSS/CS буфера (HBSS; 5% CS буфер в действии 3.1.1, который был сохранен на льду) в ячейку ситечко и размешать на 800 об/мин за 5 мин в инкубаторе 37 ° C. Сбросить буфер после каждой стирки.
11. Инкубируйте ткани в ЭДТА бесплатная стирка буфера. Добавить 10 мл ЭДТА бесплатная стирка буфера (HBSS; 1% CS; 15 мм HEPES буфера, что было сделано в шаге 3.1.4 и хранятся при комнатной температуре) в ячейку ситечко и инкубировать пластину для 10 мин при комнатной температуре без перемешивания. Сбросить буфер в конце этого шага.
12. Вымойте образца 2 x с HBSS/CS и подготовить решение фермента. Добавить 10 мл HBSS/CS (HBSS; 5% CS буфер в действии 3.1.1, который был сохранен на льду) буфер для ячейки сита и размешать на 800 об/мин за 10 мин в инкубаторе 37 ° C. Сбросить буфер после каждой стирки.
    1. Приготовляют раствор фермента (ЭДТА бесплатный мыть буфер; 0,1 мг/мл DNase; коллагеназы 167 мг/мл) в течение второго периода мыть: добавить 9 мг из DNase I и 15 мг лиофилизированных коллагеназы по 90 мл ЭДТА-Free мыть буфера. Хранят раствор при комнатной температуре.
13. Дайджест lamina propria дроби, содержащихся в ячейку ситечко для получения lamina propria лимфоцитов (LPLs). Добавить 10 мл раствора фермента (ЭДТА бесплатно мыть буфер; 0,1 мг/мл DNase I; 167 мг/мл коллагеназы буфер в действии 3.12.1 и хранятся при комнатной температуре) к ячейке сетчатый фильтр и размешать на 800 об/мин 45 мин в инкубаторе 37 ° C.
    Примечание: LPLs выпускаются в раствор после ферментативного пищеварения.
    1. Собирать фермента раствор, содержащий ячейки и процеживают через стрейнер новых клеток в 50 мл Конические трубки.
14. Добавьте 20 мл холодного мыть СМИ (HBSS; 1% CS; 1 мм ЭДТА буфера в шаге 3.1.3 и хранимых на льду на шаге 3.9.1) отфильтрованные клеток, чтобы блокировать коллагеназы активность фермента решения. Центрифуга трубки на 700 g x 6 мин при комнатной температуре. Отменить супернатант и Ресуспензируйте гранулы, содержащие LPLs в 1 мл буфера СУИМ.
15. Объединить IEL (из шага 3.7.1) и LPL (от шага 3.14) фракций и линяют с флуоресцентных конъюгированных антител для анализа потока гранулярных (см. шаг 5).
    Примечание: IEL и LPL фракций могут отдельно витражи, если информация отсека.

4. изоляция лимфоцитов из селезенки

1. Подготовьте коллекцию трубки, добавив 500 мкл буфера СУИМ в пробки microcentrifuge. Храните его на льду.
2. После удаления толстой кишки (шаг 3.4), урожай весь селезенки и поместите его в коллекции трубки. Магазин ткани на льду.
3. С помощью электрического ткани гомогенизатор, гомогенизировать селезенки в microcentrifuge трубку в течение приблизительно 1 мин центрифуги образца на 300 x g [микро центрифуги] 5 мин при комнатной температуре и аспирата покинуть супернатант.
4. Выполните Лизис эритроцитов, resuspending образца в 500 мкл буфера lysis аммония хлорид калия (ACK) инициировать смерть клетки, осмотической лизис. Разрешить в примере инкубировать 1-2 мин при комнатной температуре и затем Ресуспензируйте в 725 мкл буфера СУИМ.
5. Центрифуга для образца на 300 x g [микро центрифуги] 5 мин при комнатной температуре и аспирата покинуть супернатант. Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл буфера СУИМ и процеживают через стрейнер клеток 40 мкм в новые пробки microcentrifuge. Передать новые пробки microcentrifuge весь образец и выведение его с флуоресцентных конъюгированных антител для анализа потока гранулярных (см. шаг 5).

5. Идентификация Дендра r⁺ клетки с помощью потока цитометрии

1. Центрифугуйте образцы IEL/LPL и селезенки на g [микро центрифуги] 300 x 5 мин при комнатной температуре и аспирата покинуть супернатант.
2. Ресуспензируйте гранулы в 100 мкл антитело пятная микс. Подготовьте антитело пятная смесь, добавив 1 мкл анти CD45 дневно конъюгированных антител 100 мкл буфера СУИМ на сэмпл.
   Примечание: Важно Титруйте антитела, которые используются для проточной цитометрии до эксперимента для определения оптимальной концентрации, где происходит привязка насыщения.
3. Проинкубируйте образцы для 35 мин на льду (в темном месте).
4. Ресуспензируйте образцы в 300 мкл буфера СУИМ и центрифуги их на g [микро центрифуги] 300 x 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте образцы в 325 мкл буфера СУИМ. Анализ образцов на проточный цитометр.

Результаты

Волоконно оптический кабель был использован для доставки 405 нм свет в двоеточия 2 - дневных Фам^{подакцизным} мышей. В предыдущих экспериментах 30 s воздействия преисполнено решимости дать максимальную photoconversion клеток толстой кишки с минимальными цитотоксичности (

Обсуждение

Определение и характеристика клеток, которые взаимодействуют с и находятся под влиянием микрофлору в толстой кишке имеют важное значение и должно способствовать пониманию как информация от слизистой микроокружения ретранслируется на остальную часть тела. Один из методов обучения гу...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser
Light Emitting Diode (LED)	THORLABS	M405FP1	CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1
LED driver	THORLABS	LEDD1B	Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616
Optogenetics patch cable	THORLABS	M87L01	1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454
Fiber optic cannula	Doric lenses	MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45	5 mm long cannula with an outer diameter of 500 µm and an inner diameter of 480 µm. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036
Power supply	THORLABS	KPS101	Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101
LG3 laser safety goggles	THORLABS	LG3	Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523
Red light	Electron Microscopy Sciences	74327-10	15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences
Intestinal cell isolation
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389	CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.  https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3
1X HBSS	Gibco	14025076	Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076
Calf Serum	Hyclone AZM	197696
EDTA	Invitrogen	15575020	0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020
DTT	Sigma	10197777001	CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US
HEPES	Gibco	15630080	1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080
Petri dish	Corning	353004	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F
70 micron cell strainer	Falcon	352350	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712
Micro magnetic stir bar	Fisherbrand	1451364	Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364
Magnetic stir plate	Corning Laboratory Stirrers	440826	https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE
Collagenase	Roche	5401020001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE
DNase I	Sigma	10104159001	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US
1X PBS	Gibco	20012-027	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027
Pipet aid	Thermo Scientific	14387165	https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165
10 mL serological pipet	Falcon	357530	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
25 mL serological pipet	Falcon	357515	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659
15 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339651	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
50 mL conical centrifuge tube	Thermo Scientific	339653	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650
Single cell suspension
Eppendorf tubes	Seal-Rite	1615-5500	Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx
Tissue homogenizer	Kimble	K7495400000	Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000
Homogenizer tips	Kimble	7495210590	Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01
40 micron cell strainer	Falcon	08-771-1	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711
Antibodies
BV786 anti-mouse CD45	BD	564225	Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225
Live/Dead	Invitrogen	L34962	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962
Other
Razor blades	VWR	55411-050	Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades