Un método volumétrico para la cuantificación de vasoespasmo Cerebral en un modelo murino de hemorragia subaracnoidea

Resumen

El objetivo de este artículo es presentar un método que permite una reconstrucción 3 dimensional del árbol cerebrovascular en ratones después micro tomografía computada y determinación de volúmenes de segmentos de todo buque que pueden utilizarse para cuantificar el vasoespasmo cerebral en modelos murinos de hemorragia subaracnoidea.

Resumen

Hemorragia subaracnoidea (HSA) es un subtipo de accidente cerebrovascular hemorrágico. Vasoespasmo cerebral que ocurre después de la hemorragia es un factor importante en determinar el resultado del paciente y por lo tanto se toma con frecuencia como un punto final del estudio. Sin embargo, en estudios con animales pequeños en HSA, cuantificación de vasoespasmo cerebral es un gran desafío. Aquí, se presenta un método ex vivo que permite la cuantificación de volúmenes de segmentos recipiente entero, que pueden utilizarse como una medida objetiva para cuantificar el vasoespasmo cerebral. En un primer paso, casting de endovascular de la vasculatura cerebral se realiza utilizando a un agente de casting radiopaco. Entonces, se adquieren datos de proyección de imagen de corte transversal por micro tomografía computada. El paso final implica la reconstrucción 3 dimensional del árbol vascular virtual, seguido por un algoritmo para el cálculo de volúmenes y líneas centrales de los segmentos del vaso seleccionado. El método resultó en una reconstrucción virtual altamente exacta del árbol cerebrovascular muestra una comparación basada en el diámetro de las muestras anatómicas con sus reconstrucciones virtuales. En comparación con diámetros de recipiente solamente, los volúmenes del recipiente resaltan las diferencias entre vasos no vasospástica y vasospástica que se muestra en una serie de SAH y ratones sham operado.

Introducción

Aneurismático hemorragia subaracoidea (SAH), un subtipo de accidente cerebrovascular hemorrágico, es una enfermedad común en unidades de cuidado neurointensivo. Además de lesión de cerebro temprana (EBI), que comprende el daño cerebral causado por el acontecimiento de sangrado, otro factor importante que determina resultado del paciente es isquemia cerebral retardada (DCI), definida por clínica deterioro a través de personas con problemas cerebrales perfusión o infarto cerebral no asociada a procedimientos intervencionistas o quirúrgicas^1,2,3. Mecanismos importantes que contribuyen a la DCI son vasospasms de grandes vasos cerebrales en la una mano; por otro lado, la disfunción microcirculatoria con Vasoespasmo de microvasos y microthrombosis e isquemia relacionados con depresiones que se separa corticales desempeñan un papel (revisado en 2014 Madonald¹). Por lo tanto, el diagnóstico de vasoespasmo de los vasos cerebrales es crucial en la práctica clínica y muestra un extremo importante en muchos estudios clínicos y experimentales.

A pesar del hecho de que las características de vasoespasmo en modelos murinos de HSA no son directamente transferibles a los modelos humanos del pacientes, murinos de SAH vasoespasmo relacionado han sido de creciente importancia en los últimos años. En estos modelos SAH es inducida por endovascular filamento perforación^4,5,6,7,8, corte transversal de los vasos cisternal⁹, o inyección de sangre en el LCR^{10 ,11,12}. En contraste con grandes modelos animales de SAH que tradicionalmente fueron diseñados para el estudio del vasoespasmo¹³, modelos murinos tienen la gran ventaja de que existen numerosas cepas de ratones transgénicos. Esto los hace una excelente herramienta para el estudio de mecanismos moleculares que conducen a vasoespasmo y DCI. Sin embargo, la determinación de vasoespasmo cerebral en ratones es un reto. Esto es porque a diferencia de los modelos animales grandes en que vasoespasmo puede ser examinado usando técnicas de imagen clínicas, en vivo la proyección de imagen para analizar el vasospasm cerebral en ratones aún no está disponible. Por lo tanto, vasoespasmo comúnmente se determina utilizando ya sea de^10,de secciones histológicas¹¹ o microscópico después del bastidor de los vasos cerebrales^7,9,12. Sin embargo, estas técnicas tienen la desventaja de ese buque diámetros se examinan en puntos definidos solamente.

Basado en un estudio anterior de⁷, este manuscrito presenta un método para el análisis objetivo y reproducible de vasoespasmo en un modelo murino de SAH. El método se basa en perfusión y vaciado de los vasos cerebrales, ex vivo micro-tomografía, reconstrucción digital del árbol de la nave y posterior evaluación de los volúmenes de los recipientes cerebrales todos.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de cuidado responsable de los animales (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) y llevado a cabo con arreglo a la ley de Bienestar Animal (TierSchG). Siguieron todas las directrices internacionales, nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales.

En este estudio, se utilizaron ratones C57BL6 machos (edad 10-12 semanas). En Resumen, la hemorragia subaracoidea fue inducida por perforación del filamento de endovascular bajo anestesia con isoflurano. La arteria carótida externa izquierda preparó quirúrgicamente. Luego, un filamento fue insertado en la arteria carótida externa y avanzado intracranially a través de la arteria carótida interna que fue perforada en la carótida T, inducción de una hemorragia subaracnoidea. Un aumento de la presión intracraneal fue tomado como un indicador de endovascular acertado perforación. Un protocolo detallado de un modelo de perforación del filamento de endovascular del SAH en ratones ha sido publicado por otros^8,14.

1. perfusión y Endovascular del bastidor

1. En este estudio, la perfusión fue realizada 72 horas después de la inducción de SAH. Inducir la anestesia mediante la inyección intraperitoneal de 5 μg/g cuerpo peso (PN) midazolam, fentanilo de bw de 30 ng/g y 0,5 μg/g bw medetomidin. Continuar sólo después de que un nivel suficiente de anestesia alcanzado, que se confirma por la ausencia de reacciones a los estímulos de dolor.
2. Abrir el tórax, punción del ventrículo izquierdo con una cánula de 21G, abrir la aurícula derecha y sujete la aorta descendente y como se describe en otra parte¹⁵.
3. Realizar una perfusión transcardíaco utilizando las soluciones siguientes: fosfato tampón salino (i) Dulbecco que contiene MgCl₂ y CaCl₂ a pH 7.4 con 1 g/L glucosa y (ii) solución de paraformaldehído al 4%.
   1. Iniciar la perfusión con solución (i) durante 2 minutos y continuar con la solución (ii) durante 4 minutos.
   2. Infundir soluciones a una temperatura de 37 ° C y utilizar una bomba con velocidad variable de la perfusión para perfusión con una presión constante de 70 mmHg, que se encontró que la presión de perfusión óptima analizar vasoespasmo en ratones¹⁶. Evitar una pérdida de presión cuando se pasa de la solución (i) a la solución (Ii).
4. Después de la perfusión con soluciones (i) y (ii), continuar con perfusión durante 20 minutos a temperatura ambiente con agente radiopaco bastidor (véase Tabla de materiales) a una tasa constante de 0,2 ml/min.
5. Permite para el curado del material radiopaco casting a 4 ° C durante la noche. Luego retire el cerebro del cráneo como se describió anteriormente¹⁷, transferir la muestra a solución PFA 4% y almacenar la muestra a 4 ° C hasta micro tomografía.

2. micro tomografía computada

1. Lugar del cerebro en el centro de un tubo de plástico con unas pinzas anatómicas embotado. Elija un tubo con un diámetro ligeramente mayor que la muestra para asegurar que el objeto no se mueva durante la adquisición de la imagen. Use gasa para cerrar el tubo.
2. Conecte el tubo de plástico del motor del micro-escalonamiento en el sistema de control navegada por computadora (CNC) posicionamiento en la cabina de rayos x, en el que se gira el objeto alrededor de su eje horizontal.
3. Alinee la muestra en el campo de visión bajo radiografía de rayos x. Para conseguir la máxima magnificación, coloque el objeto lo más cerca posible de la fuente de rayos x y maximizar la distancia que el detector lo más lejos posible.
4. Utilizar un protocolo de adquisición de imagen de paso-y-disparar con los siguientes parámetros de análisis: el valor tiempo de exposición de 1 s para cada proyección optimizar la relación señal a ruido (SNR), tubo de tensión 80 kV (actual 38 mA), rotación de 360° en 1.000 proyecciones.
5. Para la reconstrucción de datos de primas utiliza un algoritmo de retroproyección filtrada aplicando el filtro Shepp-Logan con una matriz de 1024 x 1024 x 1024 vóxeles utilizando el software de reconstrucción (véase Tabla de materiales). Para su posterior análisis, importar los datos DICOM en software de visualización 3D (véase Tabla de materiales).

3. 3-dimensional reconstrucción del árbol Vascular intracraneal y determinación de volúmenes de buque

Nota: Información sobre las funciones del software de visualización puede encontrarse usando la función ayuda.

1. Importar datos Dicom software de visualización utilizando la función de importación.
2. Visualizar el árbol de la nave con la función Volren. Elegir el umbral de visualización para que las grandes arterias cerebrales están representadas en los contornos afilados. Es importante utilizar el mismo umbral de visualización para todos los conjuntos de datos pertenecientes a la serie experimental.
3. Prácticamente disecar las arterias cerebrales basales (círculo de Willis) con la función VolumeEdit rodeando los vasos con el cursor. Entonces prácticamente disecar el segmento vascular a analizar. Por lo tanto, girar el modelo 3-dimensional del árbol vascular para separar precisamente todas las pequeñas ramas de la arteria principal. Es esencial para el análisis posterior eliminar todos los recipientes excepto el segmento vascular a analizar.
4. Aplicar la función Autoskeleton con umbral en umbral de visualización, que genera un Centro-línea -base de SpatialGraph.
5. A continuación, aplicar la función SpatialGraphToLineSet para crear una línea conjunto. Dividir la línea en sus subsegmentos solo manualmente seleccionando los subsegmentos solo con el cursor y hacer clic en "split". Este paso es crucial para calcular los volúmenes de los subsegmentos sola.
6. Utilice la función LineSetToSpatialGraph para crear un gráfico espacial otra vez.
7. Utilice la función SpatialGraphStatistics para determinar la longitud, volumen y diámetro de cada subsegmento. Para la visualización colores que representa el curso del diámetro del recipiente, use la función SpatialGraphView. Fijar el segmento para colorear "grueso", que se relaciona con el diámetro del vaso. Es importante elegir el mismo color para los conjuntos de datos pertenecientes a la serie experimental.
8. Añadir las longitudes de los subsegmentos para determinar qué subsegmentos deben incluirse en el análisis posterior. En el presente estudio se evaluó un segmento vascular que consta de 1 mm de la arteria carótida interna proximal de la carótida T y 2,5 mm de la arteria cerebral media distal de la carótida T. A continuación añadir los volúmenes para determinar el volumen del recipiente del segmento vascular definido.

Resultados

Reconstrucción virtual del árbol vascular intracraneal 3-dimensional

Los árboles vasculares intracraneales 3-dimensional reconstruidos proporcionan una alta precisión anatomía vascular (figura 1). Para evaluar la precisión, realizamos una comparación basada en diámetro entre diámetros de recipiente determinados microscópicamente y de las reconstrucciones virtuales 3 dimensiones en 2 puntos anatómicamente definidos (1: a la izquierda de la arteria cerebral media (MCA) 1 mm distal de la carótida T; 2: derecho MCA distal de la carótida T 1 mm). Para la determinación microscópica de diámetros de recipiente, se utilizó una cámara de alta resolución (Infinity X-21, Deltapix) con la DeltaPix penetración versión 2.0.1 del software calibrada a una escala del micrómetro. Para esta evaluación, se analizaron 10 muestras de cerebro (HSA 5, 5 farsa). Se trataba de una serie de 12 ratones, en 7 de los cuales un SAH fue inducida, mientras que 5 experimentó cirugía ficticia (2 animales del grupo SAH murió en los días postoperatorios 1 y 2, respectivamente). No hubo diferencias significativas entre los diámetros determinados microscópicamente y prácticamente, lo que indica una exacta reconstrucción virtual de la anatomía vascular intracraneal (determinación microscópica vs reconstrucción virtual, promedio ± error estándar: izquierda 150 MCA ± 9 μm vs izquierda MCA 150 ± 8 μm; derecho MCA 153 ± 8 μm vs154 ± 9 μm, ver figura 2).

Cuantificación de vasoespasmo cerebral en ratones con HSA

Para cuantificar el vasoespasmo cerebral, fueron (i) el volumen de un segmento vascular predefinidos representante de 3,5 mm, que consta de arteria carótida interna (ACI) de 1 mm y 2,5 mm MCA a la izquierda y (ii) el buque diámetros en 2 puntos anatómicamente definidos (izquierda y derecha MCA) determinados en muestras de cerebro de la SAH y animales funcionan sham (n = 5). El volumen del recipiente fue significativamente menor en HSA en comparación con el tratamiento simulado (36 4 nL vs 71 ± 9 nL, p < 0.05). Diámetros de recipiente fueron inferiores en HSA en comparación con el tratamiento simulado (izquierda MCA: 140 μm ± 11 vs 160 ± 10 μm, p = 0,11; derecho MCA: 130 μm ± 16 vs 158 ± 13 μm, p < 0.05; ver figura 3), mientras que el nivel de significancia fue alcanzado solamente por analys es el derecho MCA.

Figura 1. Reconstrucción virtual del árbol vascular intracraneal. (A) se muestra un ejemplo representativo del cerebro; (B) muestra las correspondientes prácticamente reconstrucción el árbol vascular. (C) color-coded de visualización del diámetro de la izquierda MCA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Exactitud de la reconstrucción digital de la vasculatura. Diámetros promedios medición de muestras de cerebro reconstruidos 3D en comparación con los determinados microscópico. Datos se muestran como media ± error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 . Volumen de recipiente y el diámetro del vaso después de la HSA. (A) comparación de MCA diámetros midieron de vasculatura 3D reconstruido en HSA y simulado de ratones. (B) volumen de recipiente en HSA y simulado de ratones. Datos se muestran como media ± error estándar de la media. p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Modelos murinos de HSA son una importante herramienta para la investigación básica de la HSA. Vasoespasmo cerebral se utiliza con frecuencia como un punto final en los estudios experimentales, investigación de los mecanismos que conducen a DCI después de HSA^9,11. Sin embargo, la cuantificación de vasoespasmo cerebral en ratones u otros modelos animales pequeños de SAH es un desafío. Comúnmente, se cuantifica el vasoespasmo por ex vivo determinación de diámetros de recipiente en puntos anatómicos definidos después de perfusión endovascular y bastidor^7,9,12 o por determinación de la circunferencia de los vasos definidos en histológico las secciones de^10,11. Sin embargo, estos métodos tienen algunas desventajas: vasoespasmo es evaluado solamente en puntos anatómicos definidos; Vasoespasmo de los vecinos de segmentos de vasos puede salir evaluación. Artefactos histológicos presentan otra fuente de errores. Además, la evaluación puede ser algo subjetiva, porque la posición exacta donde se mide el diámetro del vaso es determinada por el investigador.

El objetivo era, por tanto, establecer un método que cuantifica el vasospasm cerebral calculando el volumen del recipiente de segmentos de vasos cerebrales todo transversal proyección de imagen de datos⁷. La ventaja más importante del método volumétrico presentado aquí es todo los segmentos pueden ser examinados. Esto evita la necesidad de definición de un punto donde se mide el diámetro del vaso. Otra ventaja de la evaluación de segmentos enteros de los vasos es que probablemente presenta un parámetro más objetivo para cuantificar el vasoespasmo que determinación de diámetros de recipiente en puntos definidos donde escapen de vasoespasmo de los vasos más proximal o distal evaluación. Representación digital de los diámetros del recipiente utilizando un código de color permite una estimación intuitiva del grado de vasoespasmo. Además, la evaluación volumétrica conduce a diferencias más grandes entre los buques vasospástica en comparación con la evaluación de los diámetros del recipiente como se muestra en los resultados representativos. La reconstrucción virtual que se consigue con el método presentado aquí refleja con precisión la anatomía vascular. Esto se demuestra por la evaluación de la serie representativa, en que recipiente diámetros medición microscópicamente y de las reconstrucciones digitales fueron similares, reproducir las observaciones de un anterior estudio⁷. Sin embargo, a pesar de sus ventajas, se necesitan más estudios para evaluar si el método presentado aquí es superior a los métodos convencionales de análisis de vasoespasmo.

Una limitación del método aquí presentado es que permite más tiempo en comparación con el análisis microscópico de muestras de cerebro fundido o análisis histológico (micro CT exploración tiempo 90 minutos por muestra de cerebro, procesamiento de datos 45 minutos por muestra de cerebro). Además, la disponibilidad de micro escáner CT puede limitar su aplicación. El número de animales examinados aquí fue suficiente para demostrar la viabilidad del protocolo descrito en este manuscrito. Sin embargo, si el protocolo debe usarse en estudios de tratamiento, animales números tendrían que ser calculado basan en los efectos previstos en los diámetros y volúmenes del recipiente. Otra limitación de este y otros estudios utilizando modelos murinos de HSA es que ese vasoespasmo es determinado ex vivo. Esto hace imposible los estudios longitudinales que investigar valores basales antes de la inducción de HSA y vasoespasmo en diferentes puntos temporales. Aunque los estudios han demostrado lo es posible representar la anatomía de los vasos intracraneales de ratones en vivo usando resonancia magnética tomografía¹⁸, angiografía de la tomografía computada¹⁹o digital de la substracción angiografía²⁰, estos métodos, a nuestro conocimiento, todavía no se han utilizado para analizar el vasospasm cerebral en murinos SAH modelos en vivo. De nota, la reconstrucción digital de la vasculatura cerebral con posterior evaluación volumétrica de vasospasm cerebral presentada aquí no se limita al uso de datos de micro CT ex vivo . Si la proyección de imagen de cerebro seccional transversal vascular de alta resolución en ratones debe ser en el futuro, podría utilizarse para realizar un análisis volumétrico de vasoespasmo en vivo.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidin	Pfizer, Karlsruhe, Germany	n.a.
Midazolam	Ratiopharm, Ulm, Germany	n.a.
Fentanyl	Curamed, Karlsruhe, Germany	n.a.
Venofix 21G	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	n.a.	21G cannula
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	D8662
4% paraformaldehyde solution	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	100496
Microfil MV-122	Flowtech Inc., Carver, MA, USA	n.a.	Radiopaque
Micro-CT system Y.Fox	Yxlon, Garbsen, Germany	n.a.
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1	TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany	n.a.	Reconstruction software
Amira software version 5.4.2	FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA	n.a.	Visualization software
PHD ultra syringe pump	Harvard Apparatus	70-3	Pressure controlled pump
anatomical forceps (blunt)	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	160323_v
Infinity X-21	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.	high resolution camera
DeltaPix Insight software version 2.0.1	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.
C57BL6 mice	Charles River, Cologne, Germany