くも膜下出血のマウスモデルにおける脳血管攣縮の定量化法の体積

要約

この記事の目標は、マイクロ コンピューター断層撮影で脳血管攣縮を定量化する使用ことができますすべての船セグメントのボリュームの決定後、マウスの脳血管の木の 3 次元再構成を可能にする方法を提示するにはくも膜下出血のマウスモデル。

要約

クモ膜下出血 (SAH) 出血性脳卒中のサブタイプであります。出血の余波で発生する脳血管攣縮患者のアウトカムを決定する重要なファクターで、研究のエンドポイントとしてよくしました。しかし、SAH の小動物研究、脳血管攣縮の定量化は大きな課題です。ここでは、脳血管攣縮を定量化する客観的評価尺度として使用することができますすべての船セグメントのボリュームの定量化をことができますex vivo法を示した。最初のステップで放射線不透過性のキャスティング エージェントを使って血管内脳血管系の鋳造を行います。その後、マイクロ コンピューター断層撮影による断面画像データが取得されます。最後の手順では、中心線と血管セグメントのボリュームを計算するアルゴリズムが続く仮想血管の木の 3次元再構築をします。メソッドは、自分の仮想復元と解剖学的試料の直径ベースの比較で示されている脳血管障害木の高精度な仮想再構成で起因しました。単独で血管と比較して、血管ボリュームは、SAH と sham 群のシリーズで示されている冠攣縮性と非冠攣縮性の船の相違点を強調表示します。

概要

Aneurysmatic くも膜下出血 (SAH)、出血性脳卒中のサブタイプは、neurointensive ケア単位で一般的な病気です。出血イベント自体によって引き起こされる脳の損傷を含む、初期の脳損傷 (海老) のほか患者のアウトカムを決定するもう一つの重要な要因は臨床によって定義された遅延虚 (DCI) 劣化障害脳血流や脳梗塞の血管内治療や外科的処置^1,2,3に関連付けられていません。DCI に貢献する重要なメカニズムが、一方で; 大規模な脳血管攣です。一方、皮質拡散くぼみに関連する虚血と microthrombosis、微小血管の血管攣縮と微小循環不全 (Madonald 2014¹文献) 役割を果たします。したがって、大規模な脳血管攣縮の診断は臨床実習が重要、多くの臨床的および実験的研究で重要なエンドポイントが表示されます。

SAH マウスモデルで脳血管攣縮の機能が直接ではないという事実にもかかわらず SAH の患者、マウスの人物に譲渡すること関連血管攣縮されている意義を最後の年に成長しています。出血、血管内フィラメント穿孔^4,5,6,7、8、⁹大槽内血管の断裂または CSF^{10 に血の注入に起因するこれらのモデルで ,11,12}。大動物モデル SAH の伝統的血管攣縮¹³を勉強するように設計されたと対照をなしてマウスモデル トランスジェニック マウスを多数の菌株があります偉大な利点があります。これはそれらを血管攣縮と DCI に結びつく分子メカニズムを研究するための優れたツールとなります。ただし、マウスにおける脳血管攣縮の決定は難しいです。これと対照をなして大動物モデルの血管攣縮は臨床のイメージング技術を使用して検査すること生体内でマウスにおける脳血管攣縮を分析するイメージングはまだ利用できないためにです。したがって、脳血管攣縮は、いずれかの組織学的セクション^10,11を使用してまたは顕微鏡的に後脳血管^7,9,12鋳造決定されます。しかし、これらの技術はその容器の直径を定義されている地点でのみ検討が欠点を持っています。

以前研究⁷に基づいて、この原稿は SAH マウスモデルにおける目的と脳血管攣縮の再現性の解析手法を示す.メソッドは血流と脳血管、 ex vivoマイクロ CT スキャン、船の木のデジタル復興の鋳造に基づいて、後続ボリューム全体の脳血管の評価。

プロトコル

動物実験は動物レスポンシブル ・ ケア委員会 (Landesuntersuchungsamt ラインラント = プファルツ) によって承認され、ドイツの動物保護の行為 (TierSchG) を実施します。すべての該当する国際、国家、そして制度ガイドライン ケアとの動物の使用のために続いていた。

本研究では、男性 C57BL6 マウス (年齢 10-12 週) が使用されました。簡単に言えば、くも膜下出血だったとイソフルレン麻酔下で脳血管内フィラメント穿孔によって誘導されます。左外頚動脈は外科的に準備されました。その後、フィラメントは外頚動脈に挿入され頭蓋内頸動脈 T、くも膜下出血を誘発する、穿孔内頸動脈を介して高度な。頭蓋内圧の上昇が血管内治療成功の指標として撮影された 穿孔。マウスにおける出血の血管内フィラメント穿孔モデルの詳細なプロトコルとなっています^8,14他人によって公開されました。

1. 血流と血管内の鋳造

1. 本研究では血流は SAH の誘導後 72 時間に行った。5 μ g/g 本体重量 (bw) ミダゾラム、30 ng/g bw フェンタニル 0.5 μ g/g bw medetomidin 腹腔内注入して麻酔を誘導します。十分な麻酔レベルに達すると、痛み刺激に対する反応の有無により確認された後にのみ続行します。
2. 胸郭を開く、穿刺 21 G カニューレと左心室、右心房を開き、¹⁵他の場所で記述として下行大動脈をクランプします。
3. 次の解決策を使用して transcardiac の灌流を実行: (i) ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 MgCl₂と 1 G/L グルコースと (ii) 4% パラホルムアルデヒド溶液 ph 7.4 CaCl₂を含みます。
   1. (I) 2 分間ソリューションと灌流を起動し、(ii) 4 分のためのソリューションを継続します。
   2. 37 ° C、可変灌流率と圧力制御のポンプを使用してあったマウス¹⁶で血管攣縮を分析する最適な灌流圧 70 mmHg の定圧灌流温度でソリューションを吹き込みます。ソリューション (ii) (i) のソリューションからの切り替え時の圧力損失を避けてください。
4. ソリューション (i) と (ii) による血液灌流後の放射線不透過性のキャスティング エージェントと室温で 20 分間灌流を継続 (材料表参照) 0.2 ml/min の一定のレートで。
5. 一晩 4 ° C で放射線不透過性鋳造材の硬化を可能にします。前述の¹⁷として頭蓋骨から脳を取り除く 4 %pfa ソリューションにサンプルを転送およびマイクロ CT スキャンまで 4 ° C でサンプルを保存します。

2. マイクロ コンピューター断層撮影

1. プラスチック製のチューブの中心に鈍的解剖学的鉗子で脳を配置します。画像の取得中に、オブジェクトが動かないようにサンプルより若干大きい直径のチューブを選択します。ガーゼを使用して、チューブを閉じます。
2. オブジェクトを水平軸を回転させて x 線小屋のコンピューター移動制御 (CNC) の測位システムのマイクロ ステップ モーターにプラスチック製のチューブを取り付けます。
3. ビューのフィールド x 線ラジオグラフィーの下にサンプルを配置します。最大の倍率を達成するために x 線源にできるだけ近くにオブジェクトを配置し、可能な限り検出器までの距離を最大化します。
4. 次のスキャン パラメーターでステップの撮影画像取得プロトコルを使用: 1 に露光時間を設定各投影信号対雑音比 (SNR) を最適化し、管電圧 80 の kV (現在 38 μ A)、1,000 の予測結果 360 ° 回転。
5. RAW データの再構築再構築ソフトウェアを使用して 1024 x 1024 x 1024 画素行列・ シェップ ローガン フィルターを適用するフィルター処理逆投影アルゴリズムを使って (材料の表を参照してください)。詳細な分析結果の DICOM データを 3次元可視化ソフトウェア インポートします。 (材料の表を参照してください)。

3 頭蓋内血管の木および血管ボリュームの決定 3次元再構築

注:可視化ソフトウェアの機能に関する背景情報については、ヘルプ機能を使用して見つけることが。

1. Dicom データをインポート機能を使って可視化ソフトウェアにインポートできます。
2. 関数Volrenで船木を視覚化します。太い脳動脈がシャープな輪郭で描かれているので可視化のしきい値を選択します。実験シリーズに属するすべてのデータのセットに同じ可視化しきい値を使用することが重要です。
3. 事実上関数VolumeEditをカーソルで血管を囲むことによって基底脳動脈 (ウィリス動脈輪) を解剖します。その後、事実上分析する血管を解剖します。したがって、正確に主要な動脈からのすべての小さな枝を分離するために血管の木の 3 次元モデルを回転します。分析する血管を除くすべての血管を削除するのにはさらなる分析のために不可欠です。
4. 生成する可視化のしきい値に設定されているしきい値をAutoskeleton関数を適用するセンター-ライン - SpatialGraphをベースします。
5. 次に、関数を作成するSpatialGraphToLineSetを適用、行セット。手動でカーソルを 1 つの区分を選択し、「分割」をクリックすると、その単一の区分に設定行を分割します。この手順は、単一の区分のボリュームを計算するために重要です。
6. 空間グラフをもう一度作成するのにLineSetToSpatialGraph関数を使用します。
7. 長さ、ボリューム、および各小区分の直径を決定するのにSpatialGraphStatistics関数を使用します。色分けされた可視化のために関数を使用して血管径のコースを表すSpatialGraphView.「太さ」は、血管径と相関する着色セグメントを設定します。実験シリーズに属するすべてのデータセットの同じ色のマップを選択することが重要です。
8. それ以上の分析に含まれるどの区分を決定する区分の長さを追加します。本研究では内頸動脈は、内頸動脈 T の近位の 1 mm と中大脳動脈頸動脈 t. の遠位の 2.5 mm から成る容器セグメントを評価しました。定義された血管の血管ボリュームを決定するために、ボリュームを加えます。

結果

3 次元の頭蓋内血管ツリーの仮想再建

三次元再構成の頭蓋内血管の木には、非常に正確な血管解剖 (図 1) が用意されています。精度を評価するために行った血管顕微鏡的決定と 2 の解剖学的定義されたポイントで 3 次元仮想復元から直径ベース比較 (1: 左中大脳動脈 (MCA) を 1 mm の遠位、頸動脈 T;2: 右 MCA 1 mm T 頸動脈遠位)。血管の顕微鏡測定は、高解像度カメラ (無限 X-21, Deltapix) DeltaPix 洞察力ソフトウェア バージョン 2.0.1 とマイクロメータ スケールに調整されて使用しています。この評価のため 10 脳サンプル (5 出血、5 偽) を行った。これらは 7 間 5 偽手術 (術後日 1 と 2、それぞれ死亡した SAH グループの 2 動物) うち、SAH が誘導された 12 のマウスのシリーズからだった。(顕微鏡測定対仮想再建、頭蓋内血管解剖の正確なバーチャル再生を示す顕微鏡と事実上、径間に有意差はありませんでした。平均 ± 標準誤差: 左 MCA 150 ± 9 μ m対左 MCA 150 ± 8 μ m;MCA 153 ± 8 μ m対154 ± 9 μ m を右、図 2を参照)。

SAH とマウスにおける脳血管攣縮の定量化

(I) 2 解剖学的定義されたポイント (左と右 MCA) で直径 1 mm 内頸動脈 (ICA) と (ii) 船舶が、左側に 2.5 mm MCA で構成される、定義済みの代表的な 3.5 mm の血管のボリュームがあった脳血管攣縮を定量化するには、SAH および sham 動物から脳のサンプルで決定 (n = 5)。容器容積はシャムと比較して出血でかなり低かった (36 ± 4 nL対71 ± 9 p < 0.05 nL)。血管が低かったシャムと比較して出血 (左 MCA: 140 ± 11 μ m対160 ± 10 μ m, p = 0.11; 右 MCA: 130 ± 13 μ m対158 ± 16 μ m, p < 0.05;図 3を参照)、アナリストの重大さのレベルに達しただけ右 MCA のです。

図 1。頭蓋内血管ツリーの仮想再建。(A) 脳の代表的なサンプルを示しています。(B)は、対応する事実上再建血管のツリーを示しています。(C)は色分け左 MCA の直径の可視化です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2.血管系のデジタル復元精度。平均直径は、病理組織学的に決定されたものと比較して 3 D 再構成脳サンプルから測定されます。データは、平均の平均 ± 標準誤差として表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3.くも膜下出血後の血管径と血管ボリューム。SAH の 3 D 再構築した血管から(A) MCA 比較径測定と偽がマウス。SAH で(B)船舶ボリュームと偽がマウス。データは、平均の平均 ± 標準誤差として表示されます。p < 0.05。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

SAH マウスモデルは、SAH の基礎研究の重要なツールです。脳血管攣縮はくも膜^9,11後 DCI につながるメカニズムを調査研究のエンドポイントとしてよく使用されます。しかし、マウスの脳血管攣縮の定量化や出血の他の小さい動物モデルは挑戦にあります。血管内血流と鋳造^7,9,12後定義された解剖学的ポイントで血管径の決定前のヴィヴォ、まわりの定量に血管攣縮を定量化する一般的には、組織学的に定義された船の^{10、11 を}セクションします。ただし、これらのメソッドは、いくつかの欠点を持つ: 脳血管攣縮は定義された解剖学的ポイントにのみ評価隣接する船のセグメントの血管攣縮は評価されない可能性があります。組織の成果物は、エラーの別の原因を紹介します。さらに、血管径が測定した正確な位置は調査官によって決まるので、評価がかなり主観的でことができます。

目標は、容器全体の脳血管セグメント断面イメージング データ⁷から量を計算することによって脳血管攣縮を定量化する方法を確立するためでした。ここに示す体積法の最も重要な利点は、セグメントを調べることができますそのすべての船です。これは血管径は測定点の定義の必要があります。全体の容器のセグメントの評価のそれ以上の利点はそれがおそらくより近位または遠位血管の攣縮が免れることが定義されたポイントで血管径の決定よりも脳血管攣縮を定量化するより客観的パラメーターを提示評価。カラー コードを使用して血管のデジタル表現では、脳血管攣縮の程度の直感的な推定をことができます。さらに、体積の評価は、代表の結果に示すように、血管の評価と比較して冠攣縮性の船の大きな違いにつながります。ここで紹介した方法で達成仮想の復興血管の解剖学が正確に反映されます。した血管の直径測定顕微鏡とデジタル再構成からと同様に、以前の研究⁷の観測結果を再現した、代表的なシリーズの評価が表示されます。ただし、その利点にもかかわらずさらに研究が必要でここで紹介した方法は脳血管攣縮の分析の従来の方法よりも優れているかどうか評価します。

ここで紹介した方法の制限は、それは鋳造された脳試料の顕微解析または組織学的解析 (マイクロ CT スキャン時間脳サンプルでは、データ処理の脳サンプルあたり 45 分あたり 90 分) と比較してより多くの時間を与えることです。さらに、マイクロ CT スキャナーの可用性は、そのアプリケーションを制限があります。ここで検討した動物の数はこの原稿で説明されたプロトコルの実現可能性を実証するのに十分だったただし、治療研究では、プロトコルを使用する必要があります、動物の数字を計算するだろうは容器・ ボリュームと直径の期待される効果に基づいています。これと SAH モデルマウスを用いた他の研究のもう一つの制限は、決定前のヴィヴォ、血管攣縮があるとです。これにより縦断研究不可能 SAH 誘導と異なる時点で脳血管攣縮の前に基準値を検討します。調査はそれを示したマウス生体内の磁気共鳴断層撮影法¹⁸、腹部血管造影¹⁹、またはデジタル減算を使用しての大規模な頭蓋内血管の解剖学を描写することはマウス出血モデルにおける生体内で脳血管攣縮を分析するための造影²⁰、これらのメソッドは、我々 の知識にはまだ使用されていません。注記のうち、ここに示す脳血管攣縮の後続の体積評価と脳の血管系のデジタル復興は前のヴィヴォマイクロ CT データの利用制限ではありません。マウスにおける高分解能血管クロス断面脳イメージングする必要があります、将来的に利用可能になる、体内の血管攣縮の容積測定分析を行うに使えるかもしれない。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidin	Pfizer, Karlsruhe, Germany	n.a.
Midazolam	Ratiopharm, Ulm, Germany	n.a.
Fentanyl	Curamed, Karlsruhe, Germany	n.a.
Venofix 21G	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	n.a.	21G cannula
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	D8662
4% paraformaldehyde solution	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	100496
Microfil MV-122	Flowtech Inc., Carver, MA, USA	n.a.	Radiopaque
Micro-CT system Y.Fox	Yxlon, Garbsen, Germany	n.a.
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1	TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany	n.a.	Reconstruction software
Amira software version 5.4.2	FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA	n.a.	Visualization software
PHD ultra syringe pump	Harvard Apparatus	70-3	Pressure controlled pump
anatomical forceps (blunt)	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	160323_v
Infinity X-21	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.	high resolution camera
DeltaPix Insight software version 2.0.1	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.
C57BL6 mice	Charles River, Cologne, Germany