거미 막 밑 출혈의 Murine 모델에 대뇌 Vasospasm의 정량화에 대 한 체적 메서드

요약

이 기사의 목적은 마이크로 계산 된 단층 촬영 및 전체 선박 세그먼트에 대뇌 vasospasm을 계량 하는 데 사용할 수 있는 볼륨의 결정 후 마우스에서 뇌혈관 나무의 3 차원 재구성을 허용 하는 방법을 제시 하는 것입니다. 거미 막 밑 출혈의 murine 모델입니다.

초록

거미 막 밑 출혈 (SAH) 출혈 성 뇌졸중의 하위 형식입니다. 출혈의 여파에서 발생 하는 대뇌 vasospasm 환자 결과 결정 하는 중요 한 요소 이며 따라서 자주 연구 끝점으로 찍은. 그러나, SAH에 작은 동물 연구, 대뇌 vasospasm의 정량화는 주요 도전 이다. 여기, ex vivo 메서드는 대뇌 vasospasm을 계량 하는 객관적인 측정으로 사용 될 수 있는 전체 선박 세그먼트의 볼륨의 정량화를 허용 하 여. 첫 번째 단계에서 대뇌 맥 관 구조의 혈관 내 수술 캐스팅 방사선 불 투과성 캐스팅 에이전트를 사용 하 여 수행 됩니다. 다음, 횡단면 영상 데이터는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영에 의해 획득 됩니다. 마지막 단계는 센터 라인과 선택한 선 세그먼트의 볼륨을 계산 하는 알고리즘에 의해 다음 가상 혈관 트리의 3 차원 재구성을 포함 한다. 메서드 결과 뇌혈관 성 나무 직경에 기초를 둔 그들의 가상 복원 해 부 샘플 비교 하 여 표시의 정확한 가상 재건. 혼자 배 직경에 비해, 선박 볼륨 SAH, 가짜 운영 마우스의 시리즈에 표시 된 vasospastic 및 vasospastic 비 혈관 사이의 차이점을 강조 표시 합니다.

서문

Aneurysmatic 거미 막 밑 출혈 (SAH), 출혈 성 뇌졸중의 하위 유형이 neurointensive 치료 단위에 일반적인 질병 이다. 초기 뇌 손상 (비), 구성 자체는 출혈 이벤트로 인 한 뇌 손상, 게다가 환자 결과 결정 하는 또 다른 중요 한 요소는 지연된 대뇌 국 소 빈 혈 (DCI), 임상에 의해 정의 된 통해 악화 대뇌 장애 관류 또는 대뇌 경색 중재 또는 외과 절차^1,2,3와 관련 되지 않은. DCI에 기여 하는 중요 한 메커니즘은 큰 대뇌 혈관의 vasospasms 한편으로; 다른 한편으로, microvessels 및 microthrombosis, 및 외피 퍼지는 불경기와 관련 된 허 혈 vasospasm와 microcirculatory 부전 역할 (Madonald 2014¹에서 검토). 따라서, vasospasm 큰 대뇌 혈관의 진단 임상 연습에서 중요 하 고 많은 실험과 임상 연구에서 중요 한 끝점을 표시 합니다.

Vasospasm murine SAH 모델에서의 기능을 직접 하지 않습니다 사실에도 불구 하 고 인간의 환자, murine 모델 SAH의 양도 관련된 vasospasm이 되었습니다 지난 몇 년 동안에서 성장 하는 의미의. 이러한 모델에 SAH는 혈관 내 수술 필 라 멘 트 천공^4,5,6,7,8, cisternal 선박⁹, transection 또는 CSF^{10에 혈액의 주입에 의해 유도 된 ,,1112}. 큰 동물 모델 SAH의 전통적으로 vasospasm¹³를 연구 하도록 설계 되었습니다, 달리 murine 모델 수많은 유전자 변형 쥐 종자 사용할 수 있는 큰 장점이 있다. 이로써 그들 분자 메커니즘 vasospasm 및 DCI를 공부 하기 위한 훌륭한 도구. 그러나, 쥐의 대뇌 vasospasm의 도전 이다. 이 때문에 큰 동물 모델에서 vasospasm 시험 될 수 있다 임상 이미징 기술을 사용 하 여, 달리 vivo에서 이미징 쥐에서 대뇌 vasospasm을 분석 하는 아직 사용할 수 없습니다. 따라서, vasospasm은 어느 조직학 섹션^10,11 을 사용 하 여 또는 미세 후 대뇌 혈관^7,,912의 주조에 일반적으로 결정 됩니다. 그러나, 이러한 기술은 직경만 정의 된 지점에서 검사는 그 선박 단점은 있다.

⁷이전 연구 바탕으로,이 원고는 murine SAH 모델에 목표 및 재현성 분석 vasospasm 위해 메서드를 제공 합니다. 방법은 관류 및 대뇌 혈관, ex vivo 마이크로-CT 검사, 선박 트리의 디지털 개조의 주조에 따라 그리고 후속 전체 대뇌 혈관의 볼륨의 평가.

프로토콜

동물 실험 (Landesuntersuchungsamt 라인란드-Pfalz) 책임 있는 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었고 독일 동물 복지 행위 (TierSchG)에 따라 실시. 관심과 동물의 사용에 대 한 모든 해당 국제, 국가, 및 기관 지침 따라 했다.

이 연구에서는 남성 C57BL6 마우스 (10-12 주 나이) 사용 되었다. 간단히, 거미 막 밑 출혈은 마 취와 isoflurane 혈관 내 수술 필 라 멘 트 구멍 뚫 기에 의해 유발 됩니다. 왼쪽된 외부 경 동맥 수술 준비 되었다. 다음, 한 필 라 멘 트 외부 경 동맥에 삽입 되었고 경 T, 거미 막 밑 출혈을 유도에 천공 된 내부 경 동맥을 통해 intracranially 고급. Intracranial 압력에서 상승 성공적인 혈관 내 수술의 지표로 서 찍은 구멍 뚫 기. 쥐에 혈관 내 수술 필 라 멘 트 구멍 뚫 기 모델이 SAH의 상세한 프로토콜 되었습니다^8,14다른 사람에 의해 출판.

1. 관류 및 혈관 내 수술 캐스팅

1. 이 연구에서는 관류 SAH의 유도 후 72 시간을 수행 했다. Intraperitoneally 5 µ g/g 몸 무게 (bw) midazolam, 30 ng/g bw 펜타닐, 및 0.5 µ g/g bw medetomidin를 주입 하 여 마 취를 유도. 충분 한 마 취 수준에 도달 했습니다, 통증 자극에 반응의 결핍에 의해 확인 된 후에 계속 합니다.
2. 가슴을 열고, 21 G 정 맥과 좌 심 실 펑크, 오른쪽 아 트리 움, 열고 클램프 설명 대로 하강 대동맥 다른¹⁵.
3. 다음과 같은 솔루션을 사용 하 여 transcardiac 관류 수행: (i) Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 MgCl₂ 와 CaCl₂ pH 7.4 1 g/L 포도 당, 및 (ii) 4 %paraformaldehyde 솔루션에 포함 된.
   1. (I) 2 분 동안 솔루션에 관류를 시작 하 고 (ii) 4 분에 대 한 솔루션을 계속.
   2. 최적의 관류 압력 마우스¹⁶에서 vasospasm을 분석을 발견은 70 mmHg의 압력을 일정으로 perfuse를 변수 관류 속도와 압력 제어 펌프를 사용 하 여 37 ° C의 온도에서 솔루션을 달 이다. 솔루션 (ii) 압력의 손실을 솔루션 (i)에서 전환 하는 때 피하십시오.
4. 방사선 불 투과성 캐스팅 에이전트와 함께 실 온에서 20 분 동안 관류 계속 관류와 솔루션 (i) (ii), 후 ( 재료의 표참조) 0.2 ml/min의 일정 한 속도로.
5. 밤새 4 ° C에서 방사선 불 투과성 주조 재료의 치료에 대 한 허용. 다음 앞에서 설명한¹⁷두개골에서 뇌를 제거 하 고 4 %PFA 솔루션 샘플을 전송 마이크로 CT 스캔까지 4 ° C에서 샘플을 저장할.

2. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영

1. 무딘 해 부 집게와 두뇌 플라스틱 튜브의 중앙에 놓습니다. 이미지 수집 동안 개체 이동 하지 않습니다 수 있도록 샘플 보다 약간 더 큰 직경 튜브를 선택 하십시오. 거 즈를 사용 하 여 튜브를 닫습니다.
2. 개체의 가로 축을 회전은 x 선 실에서 컴퓨터 탐색 제어 (CNC) 포지셔닝 시스템에 마이크로 스테핑 모터에 플라스틱 튜브를 연결 합니다.
3. X 선 방사선 아래 보기의 필드에서 샘플을 맞춥니다. 최대한 확대를 위해 x 선 소스에 최대한 가까이 개체를 배치 하 고 최대한 검출기에 거리를 극대화 합니다.
4. 단계 및 촬영 이미지 수집 프로토콜을 사용 하 여 다음 검색 매개 변수: 1 노출 시간 설정 신호 대 잡음 비율 (SNR)를 최적화, 전압 80 관 각 영사 s kV (현재 38 µ A), 1000 예측에서 결과 360 ° 회전.
5. 원시 데이터의 복구에 대 한 복구 소프트웨어를 사용 하 여 1024 x 1024 x 1024 복의 매트릭스로 Shepp-로 건 필터 적용 필터링된 다시 투영 알고리즘을 사용 ( 재료의 표참조). 추가 분석을 위해 가져올 결과 DICOM 데이터 3D 시각화 소프트웨어 ( 재료의 표참조).

3. 3 차원 재구성 Intracranial 혈관 나무와 선박 볼륨의 결정의

참고: 시각화 소프트웨어의 기능에 대 한 배경 정보는 도움말기능 사용 하 여 찾을 수 있습니다.

1. 가져오기함수를 사용 하 여 시각화 소프트웨어에 Dicom 데이터를 가져옵니다.
2. Volren기능을 가진 그릇 트리를 시각화 합니다. 큰 뇌 동맥 날카로운 윤곽선에 묘사를 시각화 임계값을 선택 합니다. 그것은 실험 시리즈에 속하는 모든 데이터 세트에 대 한 동일한 시각화 임계값을 사용 해야 합니다.
3. 사실상 해 부 기저 대뇌 동맥 (Willis의 원형) 기능 VolumeEdit 커서 혈관 주변으로. 다음 사실상 선박 세그먼트 분석을 해 부. 따라서, 정확 하 게 모든 작은 가지 주요 동맥에서 분리 하기 위하여 혈관 나무의 3 차원 모델을 회전 합니다. 분석할 선박 세그먼트를 제외 하 고 모든 혈관을 삭제 하려면 추가 분석을 위해 필수적 이다.
4. 임계값 생성 시각화 임계값 설정 함수 Autoskeleton 을 적용 한 센터-라인- SpatialGraph를 기반으로.
5. 그런 다음 SpatialGraphToLineSet 를 만드는 함수를 적용 한 라인 세트. 수동으로 커서 단일 전향을 선택 하 고 "분할"을 클릭 하 여 그것의 단일 전향으로 설정 하는 줄을 나눕니다. 이 단계는 단일 전향의 볼륨을 계산 하기 위해 중요 한.
6. LineSetToSpatialGraph 함수를 사용 하 여 공간 그래프를 다시 만듭니다.
7. SpatialGraphStatistics 함수를 사용 하 여 길이, 볼륨, 및 각 subsegment의 직경을 결정. 색상된 시각화에 대 한 혈관 직경의 과정을 나타내는 함수 사용 하 여 SpatialGraphView. "두께" 선박 직경 상관을 색칠 하는 세그먼트를 설정 합니다. 그것은 실험 시리즈에 속하는 모든 데이터 집합에 대 한 동일한 색상 지도 선택 하는 것이 중요입니다.
8. 추가 분석에 포함 되어야 하는 전향 결정할 수 전향의 길이 추가 합니다. 현재 연구에서 우리가 경 T의 인접 내부 경 동맥의 1 m m 및 2.5 m m 경 t.의 원심 중간 대뇌 동맥의의 구성 된 선박 세그먼트 평가 정의 된 선 세그먼트의 혈관 볼륨을 확인 하기 위해 볼륨을 추가 합니다.

결과

3 차원 intracranial 혈관 트리의 가상 재건

3 차원 복원된 intracranial 혈관 나무 제공 매우 정확한 혈관 해부학 (그림 1). 우리 선박 직경 미세 결정 사이 그리고 2 해부학 적인 몸의 구조 정의 지점에서 3 차원 가상 개조에서 직경 기반 비교를 수행 하는 정확도 평가, (1: 중간 대뇌 동맥 (MCA) 1 m m의 원심 왼쪽에 경 T; 2: 오른쪽 MCA 경 T의 원심 1 m m). 혈관 직경의 미세한 결정에 대 한 고해상도 카메라 (무한대 X-21, Deltapix) DeltaPix 통찰력 소프트웨어 버전 2.0.1와 마이크로미터 눈금 보정 사용 되었다. 이 평가 대 한 10 뇌 샘플 (5 SAH, 5 가짜) 분석 되었다. 이들은 7의는 SAH 유도 되었다, 5 가짜 수술 (수술 후 일 1과 2에 각각 사망 SAH 그룹의 2 동물) 동안에 12 마우스의 시리즈에서. Intracranial 혈관 해부학 (가상 재건 대 미세한 결정의 정확한 가상 재건을 나타내는 미세 하 고 거의 결정 직경 사이의 중요 한 차이가 있었다 ± 표준 오차를 의미: 왼쪽 MCA 150 ± 9 µ m 대 왼쪽된 MCA 150 ± 8 µ m; 바로 MCA 153 ± 8 μ m 대154 ± 9 µ m, 그림 2참조).

SAH와 쥐의 대뇌 vasospasm의 정량화

(I) 2 해부학 정의 포인트 (왼쪽 및 오른쪽 MCA)에 직경 1 m m 내부 경 동맥 (ICA)와 왼쪽, 그리고 (ii)는 선박에 2.5 m m MCA 구성 된 미리 정의 된 대표적인 3.5 m m 선 세그먼트의 볼륨이 했다 대뇌 vasospasm을 계량 하기 SAH를 운영 하는 가짜 동물 뇌 견본에서 결정 (n = 5). 선박 볼륨은 SAH 가짜에 비해 크게 낮은 (36 ± 4 nL 대 71 ± 9 nL, p < 0.05). 혈관 직경은 SAH 가짜에 비해 낮은 (MCA 왼쪽: 140 ± 11 µ m 대 160 ± 10 µ m, p = 0.11; MCA를 마우스 오른쪽: 130 ± 16 µ m 대 158 ± 13 µ m, p < 0.05; 그림 3참조), 레벨의 중요성만 분석가 대 한 도달 하는 동안 오른쪽 MCA의입니다.

그림 1. Intracranial 혈관 트리의 가상 재건입니다. (A) 표시는 대표적인 두뇌 샘플; (B) 혈관 트리 재건축 사실상 해당 표시 됩니다. ((C)) 왼쪽 MCA의 직경의 색상된 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 . 정확도 맥 관 구조 디지털 재건의. 평균 직경 미세 결정 들에 비해 3D 복원된 뇌 견본에서 측정. 데이터는 평균 ± 표준 오차의 평균으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 . 선박 볼륨 및 선박 직경 SAH 후. (A) 비교의 MCA 직경 측정 SAH 맥 3D 복원된 관 구조에서 쥐를 가짜 고. (B) 선박 볼륨 SAH에 가짜 쥐와. 데이터는 평균 ± 표준 오차의 평균으로 표시 됩니다. p < 0.05입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

Murine SAH 모델 기본 SAH 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 대뇌 vasospasm 자주 SAH^9,11후 DCI로 이어지는 메커니즘을 조사 하는 실험 연구에서 끝점으로 사용 됩니다. 그러나, 쥐에서 뇌 vasospasm의 정량화 또는 다른 작은 동물 모델 SAH의 도전 이다. 일반적으로, vasospasm 혈관 내 수술 관류와 주조^7,,912 후 정의 된 해 부 지점에서 혈관 직경의 비보 전 결정 또는 둘레의 계량은 조직학에 정의 된 혈관의 섹션^10,11. 그러나, 이러한 방법은 일부의 단점이: Vasospasm 정의 해 부 포인트;에 평가 됩니다 vasospasm 선박 세그먼트를 이웃의 평가 벗어날 수 있습니다. 조직학 아티팩트 오류의 또 다른 소스를 제공합니다. 또한, 평가 배 직경 측정은 정확한 위치는 조사에 의해 결정 되기 때문에 오히려 주관적 수 있습니다.

목표 그러므로 횡단면 영상 데이터⁷에서 전체 대뇌 혈관 세그먼트의 혈관 볼륨을 계산 하 여 대뇌 vasospasm을 수량화 하는 메서드를 설정 했다. 여기에 제시 된 체적 방법의 가장 중요 한 장점은 그 전체 선박 세그먼트 시험 될 수 있다 이다. 이 선박 직경 측정 포인트의 정의의 필요성을 피 한다. 전체 선박 세그먼트의 평가의 더 이점은 이다 그것은 아마도 더 근 이나 말 초 혈관의 vasospasm 탈출 수 정의 점에서 혈관 직경의 결정 보다 vasospasm 척도를 더 객관적인 매개 변수 제공 평가입니다. 색상 코드를 사용 하 여 혈관 직경의 디지털 표현을 vasospasm 정도의 직관적인 추정 수 있습니다. 또한, 체적 평가 vasospastic 선박 대표 결과에서 같이 혈관 직경의 평가에 비해 큰 차이를 리드. 여기에 제시 된 방법으로 달성 하는 가상 재건 혈관 해부학을 정확 하 게 반영 합니다. 이 용기에 직경 현미경으로 측정 하 고 디지털 복원에서 유사, 이전 연구⁷의 관측을 재현 했다 대표 시리즈의 평가 의해 표시 됩니다. 그러나, 그것의 장점에도 불구 하 고 더 연구는 필요 여부에 상관 없이 여기에 제시 된 방법은 vasospasm 분석의 전통적인 방법에 우수한 평가 합니다.

여기에 제시 된 방법의 한계는 그것 casted 뇌의 미세한 분석 또는 조직학 분석 (마이크로 CT 검사 뇌 샘플, 데이터 처리 뇌 샘플 당 45 분 당 90 분)에 비해 더 많은 시간을 준다. 또한, 마이크로 CT 스캐너의 여부는 응용 프로그램을 제한할 수 있습니다. 여기 검사 하는 동물의 수가이 원고에 설명 된 프로토콜의 타당성을 입증 하기에 충분 했다. 그러나, 치료 연구에는 프로토콜을 사용 해야 경우 동물 숫자를 계산 했 선박 볼륨 및 직경에 기대 효과에 따라. 이와 murine SAH 모델을 사용 하 여 다른 연구의 또 다른 한계는 vasospasm 결정 비보 전입니다. 이것은 경도 연구 불가능 SAH 유도 및 다른 시간 지점에서 vasospasm 전에 초기 계획 값을 조사 합니다. 비록 그것을 증명 하는 연구는 쥐에서 vivo에서 자기 공명 단층 촬영¹⁸, 계산 된 단층 촬영 혈관¹⁹또는 디지털 빼기를 사용 하 여의 큰 intracranial 혈관의 해부학을 묘사 하 제품은²⁰, 우리의 지식, 이러한 방법을 하지 아직 사용 되었습니다 분석 murine SAH 모델 vivo에서 대뇌 vasospasm 하. 메모의 대뇌 vasospasm 여기에 제시 된의 후속 체적 평가와 대뇌 맥 관 구조의 디지털 재건 비보 전 마이크로 CT 데이터 사용에 국한 되지 않습니다. 마우스에 고해상도 혈관 교차 단면 뇌 이미징 미래에 사용할 수 있게 한다, vivo에서vasospasm volumetric 분석 수행 사용할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidin	Pfizer, Karlsruhe, Germany	n.a.
Midazolam	Ratiopharm, Ulm, Germany	n.a.
Fentanyl	Curamed, Karlsruhe, Germany	n.a.
Venofix 21G	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	n.a.	21G cannula
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	D8662
4% paraformaldehyde solution	Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany	100496
Microfil MV-122	Flowtech Inc., Carver, MA, USA	n.a.	Radiopaque
Micro-CT system Y.Fox	Yxlon, Garbsen, Germany	n.a.
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1	TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany	n.a.	Reconstruction software
Amira software version 5.4.2	FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA	n.a.	Visualization software
PHD ultra syringe pump	Harvard Apparatus	70-3	Pressure controlled pump
anatomical forceps (blunt)	B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany	160323_v
Infinity X-21	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.	high resolution camera
DeltaPix Insight software version 2.0.1	Deltapix, Maalov, Denmark	n.a.
C57BL6 mice	Charles River, Cologne, Germany