Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Resumen

Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Resumen

Cultivo de Caenorhabditis elegans (C. elegans) de manera a gran escala en placas de agar puede ser desperdiciador de tiempo y difícil. Este protocolo describe un método sencillo y económico para obtener un gran número de animales para el aislamiento de proteínas para proceder con una mancha blanca /negra occidental, espectrometría de masas o análisis de proteómica más. Además, un aumento del número de nematodos para immunostainings y la integración de múltiples análisis en las mismas condiciones de cultivo pueden fácilmente lograrse. Además, se facilita una transferencia entre placas con diferentes condiciones experimentales. Técnicas comunes en la cultura de la placa implican a la transferencia de un solo C. elegans mediante un alambre de platino y la transferencia de agar poblada trozos con un bisturí. Sin embargo, con el aumento del número de nematodos, estas técnicas se convierten en demasiado tiempo. Este protocolo describe el cultivo a gran escala de C. elegans incluyendo numerosas medidas para minimizar el impacto de la preparación de la muestra sobre la fisiología de la lombriz. Líquido y la tensión de esquileo pueden alterar la duración de los procesos metabólicos en C. elegans, así requiriendo una descripción detallada de los pasos críticos para obtener resultados confiables y reproducibles. C. elegans es un organismo modelo, consistiendo en las células neuronales hasta la tercera, pero carece de vasos sanguíneos, proporcionando así la posibilidad de investigar únicamente neuronales alteraciones independientes de control vascular. Recientemente, neurodegeneración precoz en la retinopatía diabética fue encontrada antes de alteraciones vasculares. Así, C. elegans es de especial interés para el estudio de los mecanismos generales de las complicaciones diabéticas. Por ejemplo, una formación creciente de había avanzada glicación final (edades) y especies reactivas del oxígeno (ROS) se observaron, que se encuentran reproducible en C. elegans. Protocolos para manejar las muestras de tamaño adecuado para un espectro más amplio de investigaciones se presentan aquí, ejemplificado por el estudio de la diabetes inducida por alteraciones bioquímicas. En general, este protocolo puede ser útil para estudios que requieren gran C. elegans números y en que cultivos líquidos no es conveniente.

Introducción

Análisis de proteína, como un western blot o espectrometría de masas, requieren miligramos de proteína. Esta producción requiere de un cultivo a gran escala de cientos de C. elegans, que se pueden lograr cultivos líquidos o en medios sólidos transferencia de los nematodos por lavado. Líquido y la tensión de esquileo induce la expresión de canales de sodio epitelial (ENaC), que puede aumentar el estrés osmótico a través de una mayor absorción de sodio, potencialmente alterar la vida de C. elegans y afectar los análisis metabólicos¹ . Por lo tanto, algunos pasos críticos en este protocolo para el enfoque basado en la placa toman la reducción de estrés que afectan a la variabilidad experimental en cuenta. Cultivo líquido, por otro lado, influye en el fenotipo de los nematodos y complica la cultura y la colección de un número exacto de nematodos². Por otra parte, sustancias reactivas pueden modificarse por los componentes de los medios de comunicación y pueden distribuir irregularmente antes de llegar a los nematodos. Con respecto a las limitaciones de cultivo líquido, este protocolo proporciona un acercamiento alternativo al cultivo de las muestras a gran escala de C. elegans.

C. elegans es un organismo modelo con una red distinta de 302 células neuronales, que constituyen un tercio de sus células³. Desde su introducción en la ciencia, muchos homólogos y orthologous genes se han descrito, amplificando su valor como modelo para la investigación médica. Recientemente, se han presentado pruebas de deterioro neurológico en la retinopatía diabética, anterior a daño vascular,⁴. C. elegans carece de vasos sanguíneos, pero contiene una red neuronal distinta, lo que es un modelo conveniente para investigar alteraciones neuronales además de vascular. Así, C. elegans es de especial interés para el estudio de los mecanismos generales de las complicaciones diabéticas. Alteraciones bioquímicas en las complicaciones diabéticas implican la formación de las edades, que más influyen en la formación de ROS en respuesta a la hiperglucemia⁵. Las edades se encuentran en C. elegans y contribuyen al daño neuronal⁶. Enfermedades crónicas son causadas a menudo por procesos complejo, poligénicos, que requieren un enfoque multiparamétrico para la evaluación de sus mecanismos subyacentes, ejemplificado aquí con la evaluación de las complicaciones diabéticas. Este protocolo puede ser de utilidad para la obtención de múltiples parámetros simultáneamente, así como posteriormente. Se logra mayor comparabilidad y reproducibilidad de un enfoque multiparamétrico omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Protocolo

Nota: Este protocolo se divide en cinco secciones. En las secciones 1-3, se presenta el protocolo principal de cultura C. elegans en un a gran escala. Las secciones 4 y 5 proporcionan protocolos adicionales para la evaluación de metabolitos ejemplificadas en metabolitos diabéticas. En detalle, sección 1 describe una cultura general a gran escala en las placas. Sección 2 se centra en la transferencia de grandes cantidades de C. elegans, considerando que la sección 3 explica la recolección de una muestra a gran escala. Sección 4 explica el aislamiento de la proteína de la muestra y sección 5 describe la preparación de muestras para los análisis siguientes líquido cromatografía-espectrometría total en tándem (LC-MS/MS).

1. gran cultivo en placas

1. En general, trabajar bajo una campana estéril o junto a una llama abierta para evitar contaminaciones.
2. A cultura de gusanos hasta que alcanzan la etapa adulta joven, seguir este protocolo previamente publicados⁷ con las siguientes adaptaciones.
   1. Uso de bacterias vivas OP50 Escherichia coli para alimentar a los nematodos y preparar agar de fluorodeoxyuridine de 400 μm (no ampicilina/FUdR) para los experimentos.
   2. Para la preparación de una población sincrónica, utilizar OP50 no concentrado y para posteriores experimentos con los adultos, utilizar 3.3 x OP50 concentrado quitando el 70% del sobrenadante.
   3. Se recomiendan intervalos de alimentación diarias. Al evaluar el estrés oxidativo, diferentes intervalos y volúmenes de alimentación pueden interferir con los resultados.
   4. Para la inoculación, tome un plato con varios nematodos y corte en trozos de aproximadamente 0,5 x 1 cm² con un bisturí. La transferencia de dos a tres piezas en placas de medios (NGM) nematodos crecimiento de 60 mm de diámetro, que contiene OP50 no concentrada.
   5. Incubar las placas a la temperatura adecuada para la cepa (tipo N2 debe ser cultivado a 20 ° C) hasta que los huevos son visibles en la placa.
   6. Lave la mayoría de los huevos y animales adultos con 2 mL de buffer M9 y recoger en un tubo de 15 mL. Centrifugar la suspensión a 800 x g durante 2 minutos. Mientras tanto, empezar a preparar la solución de blanqueaba.
   7. Saque el tubo centrifugado y eliminar el buffer M9 con una pipeta de 10 mL. Añadir 10 mL de la solución y la mezcla decolorante en el vortex hasta que los nemátodos adultos son lisis. Esto toma generalmente unos 5 – 7 minutos, pero no debe tardar más de 15 minutos o los huevos no se desarrollarán completamente en el experimento.
   8. Centrifugar la suspensión a 800 x g durante 2 min lavado 3 veces con buffer M9 de 10 mL para eliminar los huevos de solución del blanqueo.
   9. Ahora agregar 150 μL de la suspensión de huevos en las placas OP50. Debe alcanzarse una densidad de 200-300 huevos en cada plato. Espere hasta nematodos alcanzaron la etapa adulta.
      Nota: El buffer M9 (pH 7.0) utilizado para los experimentos representados consta de las siguientes sustancias: 22 m m KH₂PO₄, 42 m m de Na₂HPO₄y 86 mM de NaCl. Después de la esterilización en autoclave la mezcla, añadir 1 mM MgSO4. La solución de blanqueaba contiene 0.5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl solucionado en agua destilada.
   10. Preparar estéril buffer M9, puntas de pipeta estériles con un corte punta salen los gusanos y tubos de 15 mL a recogerlas en.
   11. Aplicar aproximadamente 1 mL de buffer M9 sobre las placas, distribuir suavemente el búfer por balanceo y suavemente la pipeta los nematodos de la placa.
   12. Ahora, recoger los nematodos en el tubo. Aplicar 150 μL de la suspensión directamente en las placas (sembrado con OP50) con las puntas de pipeta corte y evaluar microscópicamente la densidad de los nematodos (recomendado: 50 – 100 nemátodos por placa de 60 mm).
   13. Si son demasiado densos, diluir la suspensión con buffer M9 y evaluarlo al microscopio hasta alcanzar la densidad deseada. Si el rendimiento es muy poco, que los gusanos establecerse o centrifugar la suspensión 10 s x 800 g para extraer el líquido.
       Nota: Se da un ejemplo de una suficiente densidad en la figura 1A (macroscópico) y 1B (microscópica) en aumento de X 20. Proceder empírico como se ha descrito.
   14. Tenga en cuenta que los gusanos se establecen rápidamente. Para asegurar una distribución equitativa entre las placas, invertir el tubo después de cada pila de placas (placas de 4 – 5).
       Nota: El corte pipeta de punta, así como el suave balanceo y lavado de las placas, reduce la tensión de esquileo.

2. la transferencia de grandes cantidades de Caenorhabditis elegans

1. Lavar los nematodos con aproximadamente 500 μl de buffer M9, dependiendo de la edad y sequedad de las placas. Con el mismo buffer, repita extraer los nematodos hasta que la mayoría de los animales se recoge en suspensión.
2. Poco a poco toman los nematodos con una punta de pipeta corte y transferir a un plato preparado con OP50. Deje que la placa se seque.
   Nota: Tenga cuidado de no aplicar mucho más que el volumen recomendado. Especialmente en experimentos a largo plazo, las placas no podrían tolerarlo y el agar puede romperse, permitiendo que los nematodos se arrastren en las grietas.

3. la cosecha de una gran muestra de Caenorhabditis elegans

1. Dependiendo del método seleccionado, comienzan los experimentos con una cantidad suficiente de C. elegans. Para LC-MS/MS análisis, preparar 20 platos (60 x 15 mm) por grupo con aproximadamente 100 nemátodos por placa para asegurar un rendimiento de al menos 200 μg de proteína por muestra.
   Nota: Esta parte del Protocolo no requiere trabajar en condiciones estériles, como los nematodos serán recogidos y congelados.
2. En el día de la recogida de muestras, preparar nitrógeno líquido para rápido-congele las muestras recolectadas. Mantener no estéril buffer M9 sobre hielo a ralentizar el metabolismo de los nematodos.
3. Lavar el C. elegans de las placas aplicando 1 mL de buffer M9 y suavemente girando las placas. Esto evita recoger nematodos fallecidos y la mayoría de los huevos, si hay cualquier presente, porque se adhieren a las bacterias y agar.
4. Tomar el volumen y transferirlo a un tubo de 15 mL.
5. Después de la recolección de la muestra completa, espere a que los nematodos se asiente o centrifugar el tubo brevemente a 800 x g y eliminar la mayor parte del buffer M9. Lavar la muestra 3 x con aproximadamente 10 mL de M9 (10 veces el volumen de muestra) para eliminar cualquier bacteria.
   Nota: Para asegurarse de que se hayan retirado todos los nematodos fallecidos, flotación de sacarosa es otra opción. Sin embargo, esto no era conveniente para los experimentos muestra¹⁵. Sacarosa es hidrolizada a glucosa y fructosa. En los experimentos representados, se evaluó el papel de la glucosa para promover cambios bioquímicos encontrados la diabetes crónica. Así, la flotación de sacarosa potencialmente podría confundir los resultados.
6. Preparar un tubo de 1,5 mL con 1 mL de buffer M9 y un tubo de vacío 1,5 mL para cada muestra. Transferir el sedimento con una pipeta de cristal del tubo de 15 mL al tubo de vacío 1.5 mL. Este paso es crucial para asegurar a una transferencia cuantitativa.
   Nota: A diferencia de durante los pasos anteriores, aquí los nematodos son más concentrados. Debido a una posible adhesión a puntas de pipeta de plástico, se espera que la pérdida de gran parte de la muestra. Por lo tanto, utilizar pipetas de vidrio.
7. Después de la transferencia, utilice la pipeta de cristal para tomar 1 mL de buffer M9 del segundo tubo de 1,5 mL para enjuagar los nematodos de la pared de la pipeta. También, lavar los nematodos restantes del tubo de 15 mL y transferir al tubo de muestras.
8. Centrifugar el tubo de muestra a 19.000 x g durante 1 minuto y retire tanto sobrenadante como sea posible.
9. Cierre el tubo con Parafilm e inmediatamente rápido-congele lo en nitrógeno líquido. Guarde el tubo a-80 ° C hasta que la preparación lisada.

4. proteína aislamiento para espectrometría de masas

Nota: El aislamiento de proteínas descrito aquí puede utilizarse también para otros ensayos (por ejemplo, western blot).

1. Añadir a la muestra congelada, los mismos volúmenes de granos de óxido de circonio de 0,5 mm y al menos 2 x el volumen de tampón lisado que contiene un cóctel de inhibidores de proteinasa.
   Nota: Los análisis de correlación de nematodos a proteína representado se realizaron utilizando 100 μl de buffer. LC-MS/MS muestras fueron sometidas a lisis con 200 μL de tampón.
2. Empezar el homogenizador durante 1 minuto en velocidad 9. Asegurar que las muestras son completamente lisadas. Repita este paso si ellos no son completamente lisadas.
3. Centrifugar las muestras durante 30 min a 4 ° C a 19.000 x g. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo en hielo y almacenarlo a-80 ° C hasta que otras medidas van a tomar.
   Nota: El búfer no desnaturalizantes utilizado para los experimentos representados consta de las siguientes sustancias: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Triton-X y 2 mM de EDTA.
   Nota: Después de haber seguido los pasos de este protocolo y haber aplicado la escala sugerida, el rendimiento de una pelotilla de proteína de aproximadamente 1.000 nematodos debe ser aproximadamente de 500 μg. Para comparaciones más, consulte figura 2 y los Resultados de representante.

5. preparación para la medición de espectrometría de masas tándem cromatografía líquida

Nota: Dependiendo del parámetro de interés, la preparación de la muestra será diferente. Este protocolo se centra en metilglioxal y determinación de la edad.

1. Medir intracelular metilglioxal por derivatización con 1, 2-diaminobenzene (DB) como se describió previamente⁹.
   1. Homogeneizar las muestras con 20 μl de ácido tricloroacético de helado 20% (peso/vol) en cloruro de sodio 0,9% (peso/vol) y 80 μl de agua en un tubo de 1,5 mL.
   2. Las muestras de 5 microlitros con estándar interno de la espiga (¹³C₃-MG; 400 nM), mezclar por Vortex y les centrifugar luego a 21.000 x g durante 5 min a 4 ° C.
   3. Transferencia 35 μl del sobrenadante para el vial de muestra HPLC que contiene un inserto de vidrio de 200 μl.
   4. Añadir 5 μl de azida de sodio 3% (peso/vol) a cada muestra seguido de 10 μl de 0,5 mM DB 200 mM HCl conteniendo 0,5 mM ácido dietilentriaminopentaacético (DETAPAC) en agua.
   5. Incubar las muestras durante 4 h a temperatura ambiente, protegido de la luz.
   6. Analizar las muestras por LC-MS/MS, como se describió previamente⁹.
      Nota: Para la medida de las edades, aislar las proteínas como se describe en la sección 4 del protocolo.
2. Medir la concentración de proteína de los lisados (descongelados) utilizando un ensayo de Bradford¹⁰.
   1. Preparar alícuotas de 30 μl de una curva estándar con albúmina de suero bovino (BSA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de la siguiente concentración: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0,6; 0,8; y 1,0 mg/dL.
      Nota: Si la muestra se preparó en el tamaño sugerido (ver paso 4.1 para la preparación de lisado con 200 μL de tampón), debe ser la concentración estimada en el rango de aproximadamente 2 a 7 mg/mL. En este caso, diluya las muestras 1:10 con PBS antes de la medición.
      Nota: Para los primeros experimentos con este método, se recomienda medir las muestras en diferentes diluciones (1, 1:10 y 1: 100). Como no hay ninguna determinación exacta del número de nematodos, el rendimiento puede variar entre investigadores individuales.
   2. Utilice una placa de 96 pocillos transparente (poliestireno) y Pipetear 10 μl de cada concentración estándar y de las muestras en las diluciones solicitadas por duplicado en los pocillos.
   3. Diluir la proteína análisis tinte reactivo concentrado 1:5 con agua destilada (aq. dest.) y añadir 200 μL de la dilución para cada muestra en la placa. Incubar la placa por 10 min a temperatura ambiente.
   4. Medir la absorbancia dentro de 30 min a 595 nm con un lector de placas. Las muestras pueden ser interpoladas de la curva estándar calculada. Más detalles del método se han descrito ampliamente en la literatura¹⁰.
3. Medir las edades intracelulares como anteriormente descrito^11,12.
   1. Lavar los extractos de proteína total (200 μg) 3 x con agua por ultracentrifugación en unidades de filtro centrífugo de 10 kDa.
   2. Añadir 10 μl de HCl de 100 mM, 10 μl de pepsina (2 mg/mL de ácido clorhídrico de 20 mM) y 10 μl de timol (2 mg/mL en 20 mM HCl) a la proteína recuperada (aproximadamente 100 μL) e incubar las muestras a 37 ° C durante 24 h.
   3. Neutralizar y tampón las muestras a pH 7.4 mediante la adición de 12.5 μl de tampón de fosfato de potasio de 0,5 M (pH 7,4) y 5 μl de 260 mM KOH.
   4. Añadir 10 μl de pronasa E [2 mg/mL en tampón de fosfato de potasio de 10 mM (pH 7,4)] y 10 μl de una solución de penicilina-estreptomicina e incubar las muestras a 37 ° C durante 24 h.
   5. Añadir 10 μl de aminopeptidasa [2 mg/mL en tampón de fosfato de potasio de 10 mM (pH 7,4)] y 10 μl del prolidase [2 mg/mL en tampón de fosfato de potasio de 10 mM (pH 7,4)] e incubar las muestras a 37 ° C durante 48 h.
   6. Analizar el hidrolizado resultante por LC-MS/MS, como se describió anteriormente¹².

Resultados

Aquí ejemplos de creación de una gran escala C. elegans cultura para aplicaciones en la investigación de la diabetes se presentan. Puede ser de interés para relacionarse con los parámetros de un solo animal, en lugar de normalizar la concentración de proteína total. En un análisis que requiere un pequeño número de nematodos, esto puede lograrse fácilmente por conteo de los nematodos. Para un a gran escala C. elegans la cultura que implican cientos de nematodos...

Discusión

Este protocolo presenta un enfoque fiable para el cultivo a gran escala de C. elegans para obtener resultados cuantitativos. Los hallazgos de la literatura podrían repetirse tal como se muestra en los Resultados de representante. Aunque este protocolo para la recogida de muestras a gran escala de C. elegans parece un método sencillo, hay algunos riesgos a tener en cuenta. Con respecto a la sincronización de la población de nematodos, este protocolo describe un acercamiento por blanq...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.