Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su terreni solidi. Come alternativa alla coltura liquida, questo protocollo permette di ottenere parametri di diverse scale sotto la piastra-base di coltivazione. Questo aumenta la comparabilità dei risultati omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.

Abstract

La coltura di Caenorhabditis elegans (c. elegans) in maniera su larga scala su piastre di agar possa essere che richiede tempo e difficile. Questo protocollo descrive un metodo semplice e poco costoso per ottenere un gran numero di animali per l'isolamento delle proteine di procedere con ulteriori analisi proteomica, spettrometria di massa o un western blot. Inoltre, un aumento dei numeri del nematode per immunostainings e l'integrazione delle analisi multiple sotto le stesse condizioni di coltura può essere raggiunto facilmente. Inoltre, un trasferimento tra piastre con differenti condizioni sperimentali è facilitato. Tecniche comuni nella cultura piastra coinvolgono il trasferimento di un singolo c. elegans utilizzando un filo di platino e il trasferimento di agar popolate pezzi usando un bisturi. Tuttavia, con l'aumento del nematode numeri, queste tecniche diventano eccessivamente lunghe. Questo protocollo descrive la coltura su grande scala di c. elegans compresi i numerosi passaggi per ridurre al minimo l'impatto della preparazione del campione sulla fisiologia del worm. Fluido e shear stress può modificare la durata di vita e processi metabolici in c. elegans, richiedendo così una descrizione dettagliata delle fasi critiche al fine di recuperare risultati affidabili e riproducibili. C. elegans è un organismo modello, costituito da cellule di un neurone per fino a un terzo, ma in mancanza di vasi sanguigni, fornendo così la possibilità di indagare esclusivamente alterazioni neuronali indipendente di controllo vascolare. Recentemente, neurodegenerazione precoce nella retinopatia diabetica è stata trovata prima di alterazioni vascolari. Così, c. elegans è di particolare interesse per lo studio di meccanismi generali delle complicazioni diabetiche. Ad esempio, una formazione aumentata di glycation prodotti finiti avanzati (età) e specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono osservata, che si trovano in modo riproducibile in c. elegans. Protocolli di gestire campioni di dimensioni adeguate per uno spettro più ampio di indagini sono presentati qui, esemplificato dallo studio delle alterazioni biochimiche indotte da diabete. In generale, questo protocollo può essere utile per gli studi che richiedono grande c. elegans numeri e nella quale coltura liquida non è adatta.

Introduzione

Analisi di proteine, come una macchia occidentale o spettrometria di massa, richiedono milligrammi di proteine. Questo rendimento richiede una coltura su grande scala delle centinaia di c. elegans, che possono essere compiute in coltura liquida o in terreni solidi trasferendo i nematodi mediante lavaggio. Fluido e shear stress induce l'espressione di canali epiteliale del sodio (ENaC), che potrebbe aumentare lo stress osmotico attraverso un maggiore assorbimento di sodio, potenzialmente alterare la durata della vita di c. elegans e che interessano analisi metaboliche¹ . Di conseguenza, alcuni passaggi critici nel presente protocollo per l'approccio basato su piastra prendere la riduzione dello stress che colpiscono la variabilità sperimentale in considerazione. Coltura liquida, d'altra parte, influenza il fenotipo dei nematodi e complica la cultura e la raccolta di un numero esatto di nematodi². Inoltre, sostanze reattive possono essere modificate da componenti multimediali e possono essere distribuito in modo non uniforme prima di raggiungere i nematodi. Per quanto riguarda le limitazioni della coltura liquida, questo protocollo fornisce un approccio alternativo alla coltura campioni su larga scala di c. elegans.

C. elegans è un organismo di modello con una rete distinto di cellule neuronali 302, che costituiscono un terzo di tutte le sue cellule³. Sin dalla sua introduzione in scienza, molti omologhi e geni ortologhi sono state descritte, amplificando il suo valore come un modello per la ricerca medica. Recentemente, la prova per danno neurologico nella retinopatia diabetica, prima del danno vascolare, è stata presentata⁴. C. elegans è privo di vasi sanguigni, ma contiene una rete neuronale distinta, che lo rende un modello adatto per studiare alterazioni neuronali a parte quelle vascolari. Così, c. elegans è di particolare interesse per lo studio di meccanismi generali delle complicazioni diabetiche. Le alterazioni biochimiche nelle complicazioni diabetiche comportano la formazione di età, che influenzano ulteriormente la formazione di ROS in risposta all'iperglicemia⁵. Età si trovano in c. elegans e contribuire al danno neuronale⁶. Malattie croniche sono spesso causate da processi complessi, poligenici che richiedono un approccio multiparametrico per la valutazione dei loro meccanismi di fondo, come esemplificato qui con la valutazione delle complicazioni diabetiche. Questo protocollo può essere utile per ottenere più parametri simultaneamente, così come successivamente. Una maggiore comparabilità e riproducibilità di un approccio multiparametrico si ottengono omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.

Protocollo

Nota: Questo protocollo è diviso in cinque sezioni. Punti 1-3, è presentato il protocollo principale alla cultura c. elegans a larga scala. Sezioni 4 e 5 forniscono ulteriori protocolli per la valutazione dei metaboliti esemplificati che accadono in metaboliti diabetiche. In dettaglio, sezione 1 descrive una cultura generale su larga scala sulle piastre. Sezione 2 si concentra sul trasferimento di grandi quantità di c. elegans, considerando che la sezione 3 spiega la raccolta di un campione su larga scala. Sezione 4 spiega l'isolamento della proteina dal campione e sezione 5 descrive la preparazione dei campioni per le analisi successive liquido cromatografia-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

1. su larga scala cultura sulle piastre

1. In generale, di lavorare sotto una cappa sterile o accanto a una fiamma aperta per evitare contaminazioni.
2. Alla cultura vermi fino a raggiungere la fase adulta giovane, seguire questo protocollo precedentemente pubblicato⁷ con i seguenti adattamenti.
   1. Utilizzare batteri viventi Escherichia coli OP50 per nutrire i nematodi e preparare agar di 400 µM fluorodeossiuridina (non ampicillina/FUdR) per gli esperimenti.
   2. Per la preparazione di una popolazione sincrona, utilizzare OP50 non concentrato e per successivi esperimenti con gli adulti, utilizzare 3.3 x OP50 concentrato rimuovendo il 70% del surnatante.
   3. Gli intervalli di alimentazione quotidiani sono raccomandati. Nel valutare lo sforzo ossidativo, diversi intervalli e volumi per l'alimentazione potrebbero interferire con i risultati.
   4. Per inoculazione, prendere un piatto con diversi nematodi e tagliarla a pezzi di circa 0,5 x 1 cm² con un bisturi. Trasferire due o tre pezzi sulle piastre di supporto (NGM) crescita del nematode di 60 mm di diametro, contenenti OP50 non concentrato.
   5. Incubare le piastre alla temperatura adatta per il ceppo (selvaggio-tipo N2 devono essere messi a coltura a 20 ° C) fino a quando le uova sono visibili sulla piastra.
   6. Lavare la maggior parte delle uova e animali adulti con 2 mL di buffer di M9 e raccoglierli in una provetta da 15 mL. Centrifugare la sospensione a 800 x g per 2 min. Nel frattempo, iniziare a preparare la soluzione sbiancante.
   7. Togliere il tubo centrifugato e rimuovere il buffer M9 con una pipetta da 10 mL. Aggiungere 10 mL della soluzione sbiancante e mix su vortice fino a quando i nematodi adulti vengono lisati. Questo richiede solitamente circa 5 – 7 min, ma non dovrebbe durare più di 15 min o le uova non svilupperà completamente più avanti nell'esperimento.
   8. Centrifugare la sospensione a 800 x g per 2 min. lavare 3 volte con tampone di 10ml M9 per cancellare le uova da candeggio soluzione.
   9. Ora aggiungere 150 µ l della sospensione uovo sulle piastre OP50. Una densità di 200-300 uova dovrebbe essere raggiunto su ogni piatto. Attendere nematodi raggiunto lo stadio adulto.
      Nota: Il buffer di M9 (pH 7.0) utilizzato per gli esperimenti raffigurati consiste delle seguenti sostanze: 22mm KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄e 86 mM NaCl. Dopo la sterilizzazione in autoclave la miscela, aggiungere 1 mM MgSO4. La soluzione sbiancante contiene 0,5 M NaOH, 2,3 mM NaOCl risolto in acqua distillata.
   10. Preparare il tampone sterile M9, punte di pipetta sterile con un taglio punta per lavare via il worm e provette da 15 mL per raccoglierli in.
   11. Applicare circa 1 mL di tampone di M9 sulle piastre, distribuire delicatamente il buffer di oscillazione e delicatamente dispensare i nematodi fuori la piastra.
   12. Ora, raccogliere i nematodi nel tubo. Applicare 150 µ l di sospensione direttamente sulle piastre (seminato con OP50) con le punte di taglio pipetta e microscopicamente valutare la densità dei nematodi (consigliato: 50 – 100 nematodi per piastra di 60 mm).
   13. Se sono troppo dense, diluire la sospensione con buffer di M9 e valutarlo sotto il microscopio, fino a raggiunta la densità desiderata. Se il rendimento è troppo poco, lasciate che i vermi stabilirsi o centrifugare la sospensione 10 s a 800 x g per rimuovere il liquido.
       Nota: Un esempio di una sufficiente densità è dato in Figura 1A (macroscopiche) e 1B (microscopica) alle 20 l'incremento di X. Procedere empiricamente come descritto.
   14. Tenete a mente che i vermi si stabilirsi rapidamente. Per garantire un'equa distribuzione tra le piastre, capovolgere la provetta dopo ogni pila di piatti (4 – 5 piatti).
       Nota: Il taglio Pipettare punta, come pure l'oscillazione delicata e lavaggio delle piastre, riduce la sollecitazione di taglio.

2. trasferimento di grandi quantità di Caenorhabditis elegans

1. Lavare i nematodi con circa 500 µ l di tampone di M9, a seconda dell'età e la secchezza delle piastre. Utilizzando lo stesso buffer, Ripeti staccando i nematodi, fino a quando la maggior parte degli animali sono raccolti in sospensione.
2. Lentamente prendono i nematodi con un puntale taglio e trasferirli su un piatto preparato con OP50. Asciugare la piastra.
   Nota: Fare attenzione a non applicare più di volume consigliato. Soprattutto in esperimenti a lungo termine, le piastre non potrebbero tollerare e l'agar può rompersi, permettendo i nematodi la ricerca per indicizzazione nelle fessure.

3. raccolta di un grande campione di Caenorhabditis elegans

1. A seconda del metodo selezionato, è possibile iniziare gli esperimenti con una quantità sufficiente di c. elegans. Per le analisi LC-MS/MS, preparare 20 piastre (60 x 15 mm) per ogni gruppo con circa 100 nematodi per piastra per garantire un rendimento di almeno 200 µ g di proteine per esempio.
   Nota: Questa parte del protocollo non richiede lavorando in condizioni sterili in piu ', come i nematodi saranno raccolti e congelati.
2. Il giorno della raccolta del campione, preparare azoto liquido per snap-congelare i campioni raccolti. Tenere non sterili M9 buffer sul ghiaccio per rallentare il metabolismo del nematode.
3. Lavare via il c. elegans dalle piastre applicando 1 mL di tampone di M9 e raggiunga le piastre. Questo evita di raccolta defunti nematodi e la maggior parte delle uova, se non ci sono affatto presente, perché si attaccano per i batteri e agar.
4. Prendere il volume e trasferirlo in una provetta da 15 mL.
5. Dopo la raccolta del campione completo, attendere i nematodi a stabilirsi o centrifugare la provetta brevemente a 800 x g e rimuovere la maggior parte del buffer M9. Lavare il campione 3 x con circa 10 mL di M9 (10 volte il volume del campione) per rimuovere i batteri.
   Nota: Per garantire che vengano rimossi tutti i nematodi defunti, galleggiamento saccarosio è un'altra opzione. Tuttavia, questo non era adatto per gli esperimenti visualizzati¹⁵. Saccarosio è idrolizzato a glucosio e fruttosio. Negli esperimenti raffigurati, il ruolo di glucosio è stato valutato per promuovere cambiamenti biochimici trovati in diabete cronico. Così, galleggiamento saccarosio potenzialmente poteva confondere i risultati.
6. Preparare una provetta da 1,5 mL con 1 mL di tampone di M9 e una provetta di vuoto 1,5 mL per ogni campione. Trasferire il pellet con una pipetta di vetro dal tubo da 15 mL al tubo vuoto 1,5 mL. Questo passaggio è fondamentale per garantire un trasferimento di quantitativo.
   Nota: A differenza durante i passaggi precedenti, qui i nematodi sono più concentrati. A causa di un'eventuale adesione alle punte di pipetta di plastica, è prevista la perdita di gran parte del campione. Pertanto, utilizzare pipette in vetro.
7. Dopo il trasferimento, è possibile utilizzare la pipetta di vetro per prendere 1 mL di tampone di M9 dal secondo tubo di 1,5 mL per risciacquare i nematodi dalla parete pipetta. Inoltre, lavare i nematodi rimanenti dal tubo da 15 mL e trasferirli nella provetta.
8. Centrifugare la provetta a 19.000 x g per 1 min e quindi rimuovere tanto surnatante come possibile.
9. Sigillare il tubo con Parafilm e immediatamente snap-freeze e in azoto liquido. Conservare la provetta a-80 ° C fino a quando la preparazione del lysate.

4. proteine isolamento per spettrometria di massa

Nota: L'isolamento di proteine qui descritto può essere utilizzato anche per altri dosaggi (ad es., macchia occidentale).

1. Per il campione congelato, aggiungere gli stessi volumi di grani di ossido di zirconio di 0,5 mm e almeno 2 x il volume di lisato tampone contenente un cocktail di inibitore della proteinasi.
   Nota: L'analisi di correlazione di nematodi / proteine raffigurati sono stati eseguiti utilizzando 100 µ l di tampone. Campioni di LC-MS/MS sono stati lisati con 200 µ l di tampone.
2. Avviare l'omogeneizzatore per 1 min velocità 9. Garantire che i campioni vengono lisati completamente. Ripetere questo passaggio se essi non sono completamente lisati.
3. Centrifugare i campioni per 30 min a 4 ° C a 19.000 x g. Trasferire il surnatante in una provetta di nuova sul ghiaccio e conservare a-80 ° C fino a quando ulteriori misure stanno per essere prese.
   Nota: Il buffer non-denaturante utilizzato per gli esperimenti raffigurati si compone delle seguenti sostanze: 20 mM Tris-HCl (pH 8), 137 mM NaCl, 1% Triton-X e 2 mM EDTA.
   Nota: Dopo aver seguito la procedura del presente protocollo e dopo aver applicato la scala suggerita, il rendimento di un pellet di proteina da circa 1.000 nematodi dovrebbe essere circa 500 µ g. Per ulteriori confronti, consultare Figura 2 e i Risultati di rappresentante.

5. preparazione del campione per la misura di liquido cromatografia-spettrometria di massa

Nota: A seconda del parametro di interesse, la preparazione del campione sarà diverso. Questo protocollo si concentra sulla determinazione dell'età e methylglyoxal.

1. Misurare methylglyoxal intracellulare di derivatizzazione con 1,2-diaminobenzene (DB) come descritto in precedenza⁹.
   1. Omogeneizzare i campioni con 20 µ l di acido tricloroacetico di gelida 20% (wt/vol) in cloruro di sodio 0,9% (wt/vol) e 80 µ l di acqua in una provetta da 1,5 mL.
   2. I campioni di 5 µ l con lo standard interno di Spike (¹³C₃-MG; 400 nM), mescolare nel vortex e centrifugare poi li a 21.000 x g per 5 min a 4 ° C.
   3. Trasferire 35 µ l del surnatante la fiala del campione HPLC contenente un inserto di vetro 200 µ l.
   4. Aggiungere 5 µ l di sodio azide 3% (wt/vol) per ogni campione seguita da 10 µ l di mM 0,5 DB a 200 mM HCl contenente 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic acido (DETAPAC) in acqua.
   5. Incubare i campioni per 4 h a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
   6. Analizzare i campioni mediante LC-MS/MS, come descritto in precedenza⁹.
      Nota: Per la misurazione di età, isolare le proteine come descritto nella sezione 4 del protocollo.
2. Misurare la concentrazione di proteina dei lisati (scongelati) utilizzando un saggio di Bradford¹⁰.
   1. Preparare aliquote di 30 µ l per una curva standard addizionata con albumina di siero bovino (BSA) risolto in tampone fosfato salino (PBS) delle seguenti concentrazioni: 0; 0,1; 0.2; 0.3; 0.4; 0,6; 0,8; e 1,0 mg/dL.
      Nota: Se il campione è stato preparato presso la dimensione suggerita (Vedi punto 4.1 per la preparazione di lisato con 200 µ l di tampone), la concentrazione stimata dovrebbe essere nel range di 2 – 7 mg/mL circa. In questo caso, diluire i campioni 01:10 con PBS prima della misurazione.
      Nota: Per i primi esperimenti utilizzando questo metodo, si consiglia di misurare i campioni in varie diluizioni (1, 01:10 e 1: 100). Come non c'è nessuna determinazione esatta del numero di nematodi, il rendimento può variare tra singoli ricercatori.
   2. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti (polistirolo) trasparente e Pipettare 10 µ l di ogni concentrazione standard e dei campioni nelle diluizioni selezionate in duplicato nei pozzetti.
   3. Diluire la proteina dosaggio tintura reagente concentrato 1:5 con acqua distillata (aq. dest.) e aggiungere 200 µ l della diluizione per ogni campione sul piatto. Incubare la piastra per 10 min a temperatura ambiente.
   4. Misurare l'assorbanza entro 30 min a 595 nm con un lettore di piastra. I campioni possono essere interpolati dalla curva standard calcolata. Più dettagli del metodo sono stati descritti estesamente nella letteratura¹⁰.
3. Misurare le età intracellulari come descritto in precedenza^11,12.
   1. Gli estratti di proteine totali (circa 200 µ g) di lavare 3 volte con acqua di ultracentrifugazione in 10 unità di filtraggio centrifugo di kDa.
   2. Aggiungere 10 µ l di HCl 100 mM, 10 µ l di pepsina (2 mg/mL in HCl 20 mM) e 10 µ l di timolo (2 mg/mL in HCl 20 mM) alla proteina recuperata (circa 100 µ l) e incubare i campioni a 37 ° C per 24 h.
   3. I campioni del buffer a pH 7.4 con l'aggiunta di 12,5 µ l di tampone di fosfato di potassio 0,5 M (pH 7.4) e neutralizzare e 5 µ l di 260mm KOH.
   4. Aggiungere 10 µ l di Pronase E [2 mg/mL in tampone fosfato di potassio 10 mM (pH 7.4)] e 10 µ l di una soluzione di penicillina-streptomicina e incubare i campioni a 37 ° C per 24 h.
   5. Aggiungere 10 µ l di aminopeptidasi [2 mg/mL in tampone fosfato di potassio 10 mM (pH 7.4)] e 10 µ l di prolidasi [2 mg/mL in tampone fosfato di potassio 10 mM (pH 7.4)] e incubare i campioni a 37 ° C per 48 h.
   6. Analizzare l'idrolizzato risultante mediante LC-MS/MS, come descritto in precedenza¹².

Risultati

Qui esempi di creazione di una larga scala di c. elegans della coltura per applicazioni nella ricerca del diabete sono presentate. Può essere di interesse per correlare i parametri di un singolo animale, piuttosto che per normalizzare e alla concentrazione di proteine totali. In un'analisi che richiedono un piccolo numero di nematodi, questo può essere facilmente realizzata contando i nematodi. Per una larga scala di c. elegans cultura coinvolgendo centinaia di nematod...

Discussione

Questo protocollo presenta un metodo affidabile per la coltura su grande scala di c. elegans per ottenere risultati quantitativi. I risultati dalla letteratura possono essere replicati come mostrato nei Risultati di rappresentante. Anche se questo protocollo per la raccolta di campioni su larga scala di c. elegans sembra un metodo semplice, ci sono certe insidie di prendere in considerazione. Per quanto riguarda la sincronizzazione della popolazione del nematode, questo protocollo descr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.