מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול בקנה מידה גדול Caenorhabditis elegans במדיה מוצק. כחלופה תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מאפשר קבלת הפרמטרים של סולמות שונים המעובדים המבוסס על צלחת. פעולה זו מגדילה את comparability של תוצאות על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.

Abstract

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) בצורה רחבת היקף על פלטות אגר ניתן ולהקשות. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וזולה כדי לקבל מספר גדול של חיות בשביל הבידוד של חלבונים כדי להמשיך עם אבן חשופה המערבי, ספקטרומטר מסה או ניתוחים פרוטאומיקס נוספות. יתר על כן, עלייה של מספרי נמטודות immunostainings ושילוב של מספר ניתוחים בתנאים culturing אותו בקלות ניתן להשיג. בנוסף, העברה בין לוחות עם תנאים שונים ניסיוני הוא הקל. טכניקות נפוצות בתרבות צלחת לכלול ההעברה של יחיד C. elegans באמצעות חוט פלטינה וגושים בהעברת אגר מיושבים באמצעות אזמל. עם זאת, עם הגדלת מספרים נמטודות, טכניקות אלו הופכים זמן רב יתר על המידה. פרוטוקול זה מתאר את התרבות בקנה מידה גדול של C. elegans כולל מדרגות רבות כדי למזער את ההשפעה של הכנת הדוגמא על הפיזיולוגיה של התולעת. נוזל לבין מאמץ גזירה יכול לשנות את תוחלת החיים של ואת התהליכים המטאבוליים C. elegans, וכך מצריכים תיאור מפורט של השלבים הקריטיים כדי לאחזר תוצאות אמין לשחזור. C. elegans הוא אורגניזם מודל, המורכב תאים עצביים עבור עד שליש, אבל חסר כלי הדם, ובכך מספק את האפשרות לחקור אך ורק שינויים עצביים עצמאית של שליטה בכלי הדם. לאחרונה, הקשורים ניוון מוחיים מוקדם ב רטינופתיה סוכרתית נמצאה לפני שינויים בכלי הדם. לכן, C. elegans הוא עניין מיוחד לימוד מנגנונים כלליים של סיבוכים סוכרתית. לדוגמה, מערך מוגברת של מתקדמת glycation end מוצרים (גילאי), מינים חמצן תגובתי (ROS) נצפית, אשר נמצאים reproducibly C. elegans. פרוטוקולים לטפל בדגימות של גודל מספקת קשת רחבה של חקירות מוצגים כאן, ומעוררות את המחקר של סוכרת-induced שינויים ביוכימיים. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות שימושי עבור מחקרים הדורשים גדולה C. elegans מספרים ב תרבות נוזלי אשר אינה מתאימה.

Introduction

ניתוחים חלבון, כגון תספיג או ספקטרומטר מסה, דורשים מיליגרם של חלבון. תשואה זו דורשת culturing בקנה מידה גדול של מאות C. elegans, אשר ניתן לבצע על-ידי תרבית נוזלית או במדיה מוצק נמטודות את מעבירה על ידי שטיפה. נוזל לבין מאמץ גזירה המניע את הביטוי של תעלות נתרן אפיתל (ENaC), אשר יכול להגביר את הלחץ osmotic באמצעות ספיגה מוגברת של נתרן, פוטנציאל לשנות את תוחלת החיים של C. elegans , המשפיעים על חילוף החומרים ניתוחים¹ . לכן, כמה צעדים קריטיים פרוטוקול זה הגישה המבוססת על הצלחת לקחת והורדת המתח משפיע על השתנות ניסיוני בחשבון. תרבית נוזלית, מצד שני, השפעות של פנוטיפ של נמטודות, מסבך את התרבות ואת אוסף של מספר מדויק של נמטודות². יתר על כן, תגובתי חומרים יכולים להשתנות על-ידי רכיבי מדיה ולהפיץ ייתכן לצר לפני הגיעם של נמטודות. לגבי המגבלות של תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מספק גישה חלופית culturing דוגמאות בקנה מידה גדול של C. elegans.

C. elegans הוא אורגניזם מודל עם רשת נפרדים של תאים עצביים 302, ממציא שליש כל שלה תאים³. מאז השקתו בקטע של מדעים, רבים הומולוגי orthologous הגנים היו כמתואר לעיל, הגברה ערכו כמודל למחקר רפואי. לאחרונה, ראיות לקות נוירולוגית ב רטינופתיה סוכרתית, שקדמו נזק בכלי הדם, הוצגו⁴. C. elegans חסר כלי הדם, אך מכילה רשת עצביים שונים, שהופך אותו מודל מתאים לחקור שינויים עצביים מלבד אלה כלי הדם. לכן, C. elegans הוא עניין מיוחד לימוד מנגנונים כלליים של סיבוכים סוכרתית. שינויים ביוכימיים סיבוכים סוכרתית לערב את היווצרות הגילאים, אשר בהמשך להשפיע על היווצרות של ROS בתגובה היפרגליקמיה⁵. הגילאים נמצאים C . elegans ולתרום נזקים עצביים⁶. מחלות כרוניות לעיתים קרובות נגרמות על ידי תהליכים מורכבים, בקשתית הדורשות גישה multiparametric להערכה של מנגנונים הבסיסית שלהם, כפי שהודגם כאן עם הצהרתו של סיבוכים סוכרתית. פרוטוקול זה ניתן לשימוש להשגת פרמטרים מרובים בו זמנית, כמו גם לאחר מכן. Comparability מוגברת, הפארמצבטית בגישה multiparametric יכולה להיות מושגת על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מחולק לחמישה מדורים. בסעיפים 1-3, מוצג הפרוטוקול העיקרי תרבות C. elegans ב בקנה מידה גדול. סעיפים 4 ו-5 מספקים פרוטוקולים נוספים להערכת ביטוי מטבוליטים המתרחשים מטבוליטים סוכרתית. בפירוט, סעיף 1 מתאר תרבות בקנה מידה גדול כללית על צלחות. סעיף 2 מתמקד העברת כמויות גדולות של C. elegans, ואילו בסעיף 3 מסביר קציר של מדגם בקנה מידה גדול. סעיף 4 מסביר את הבידוד חלבון מן המדגם, סעיף 5 מתאר את הכנת הדוגמא עבור ניתוחים שלאחר מכן נוזלי כרומטוגרפיה-טנדם ספקטרומטר מסה (LC-MS/MS).

1. בקנה מידה גדול תרבות על צלחות

1. באופן כללי, לעבוד תחת כיסוי סטרילי או ליד להבה פתוחה כדי להימנע contaminations.
2. לתרבות תולעים עד שיגיעו הבמה למבוגרים צעירים, בצע את פרוטוקול שפורסמו בעבר⁷ עם עיבודים הבאים.
   1. להשתמש חיידקים החיים Escherichia coli OP50 כדי להאכיל את נמטודות ולהכין מיקרומטר 400 fluorodeoxyuridine אגר (לא אמפיצילין/FUdR) לניסויים.
   2. עבור הכנת אוכלוסיה סינכרונית, להשתמש unconcentrated OP50 ולהשתמש בשביל להצליח ניסויים עם המבוגרים, 3.3 x OP50 מרוכז על-ידי הסרת 70% תגובת שיקוע.
   3. מרווחי זמן ההאכלה היומית מומלצים. בעת הערכת סטרס חמצוני, במרווחי זמן שונים ואמצעי אחסון האכלה שעשויות לפגום בתוצאות.
   4. עבור חיסון לקחת צלחת עם מספר נמטודות, לחתוך אותו לחתיכות של 0.5 x 1 ס מ² עם אזמל. העברת שלושה חלקים על גבי לוחיות גדילה נמטודות מדיה (NGM) של 60 מ מ קוטר, המכיל unconcentrated OP50.
   5. דגירה הלוחות בטמפרטורה מתאימה המתח (N2 פראי-סוג צריך להיות תרבותי ב- 20 ° C) עד ביצים גלויים על הצלחת.
   6. לשטוף את מרבית ביצים עם חיות למבוגרים עם 2 מ של מאגר M9 ולאסוף אותם בצינור 15 מ"ל. Centrifuge את המתלים ב x 800 גרם למשך 2 דקות. בינתיים, מתחילים בהכנת הפתרון הלבנה.
   7. תוציאי את הצינור centrifuged ולהסיר המאגר M9 עם pipet 10 מ"ל. להוסיף 10 מ של פתרון הלבנת ואת תערובת המערבולת עד נמטודות למבוגרים הם lysed. זה לוקח בדרך כלל כ- 5-7 דקות, אבל לא צריך לקחת יותר מ 15 דקות או הביצים לא יתפתח באופן מלא בהמשך לניסוי.
   8. Centrifuge את המתלים ב 800 x גרם עבור 2 דק שטיפת 3 פעמים עם 10 מ"ל M9 המאגר כדי לנקות את הביצים של הלבנת פתרון.
   9. עכשיו להוסיף 150 µL של ההשעיה ביצה על צלחות OP50. צפיפות של 200 – 300 ביצים צריך להגיע על כל צלחת. המתן עד נמטודות הגיע השלב למבוגרים.
      הערה: המאגר M9 (pH 7.0) המשמש את הניסויים מתוארים מורכב של החומרים הבאים:₂PO 22 מ מ ח'₄, 42 מ"מ נה₂HPO₄ו- 86 מ מ NaCl. לאחר autoclaving התערובת, להוסיף 1 מ"מ MgSO4. הפתרון הלבנת מכיל 0.5 מ' NaOH, 2.3 מ מ NaOCl נפתר במים מזוקקים.
   10. להכין מאגר M9 סטרילי, טיפים פיפטה סטרילי עם חתך עצה כדי לשטוף את התולעים, וצינורות 15 mL כדי לאסוף אותם.
   11. להחיל כ 1 מ"ל של מאגר M9 על הלוחות, פזר בעדינות המאגר על ידי נדנוד בעדינות pipet של נמטודות רלוונטי.
   12. עכשיו, לאסוף את נמטודות בצינור. החל µL 150 של השעיה ישירות על הלוחות (נזרע עם OP50) עם העצות פיפטה לחתוך ולאחר להעריך ברמה המיקרוסקופית צפיפות נמטודות (מומלץ: 50 – 100 נמטודות לכל צלחת 60 מ מ).
   13. אם הם יותר מדי צפוף, לדלל את המתלים. באמצעות מאגר M9, להעריך את זה תחת המיקרוסקופ עד הצפיפות הרצויה. אם התשואה הוא קטן מדי, תעזוב את התולעים להתמסד centrifuge ה s ההשעיה 10 ב 800 x גרם כדי להסיר את הנוזלים.
       הערה: דוגמה של צפיפות מספיק ניתנת איור 1A (מאקרוסקופית) ו 1B (מיקרוסקופיים)-הגדלת X 20. המשך מדעית כמתואר.
   14. זכור כי תולעים תירגע במהירות. כדי להבטיח חלוקה שוויונית של בין הלוחות, היפוך הצינור לאחר כל ערימת צלחות (4 – 5 צלחות).
       הערה: החתך פיפטה עצה, כמו גם את נדנוד עדין ומפחית את הכביסה של הצלחות, גזירה.

2. העברה של כמויות גדולות של Caenorhabditis elegans

1. לשטוף את נמטודות עם µL כ-500 מאגר M9, בהתאם לגיל יובש של הלוחות. באמצעות המאגר אותו, חזור על ניתוק של נמטודות עד שרוב החיות נאספים ההשעיה.
2. אט-אט תופסים את נמטודות עם טיפ פיפטה לחתוך ולהעביר אותם על צלחת המוכנים OP50. תן את הצלחת לייבש.
   הערה: יש להיזהר לא להחיל הרבה יותר מאשר אמצעי האחסון המומלץ. במיוחד בניסויים לטווח ארוך, הלוחות שאולי לא אסבול את זה, אגר יכולה לשבור, המאפשר את נמטודות לזחול לתוך הסדקים.

3. הקציר של גדולים דוגמת Caenorhabditis elegans

1. בהתאם לשיטה שנבחרה, להתחיל ניסויים עם כמות מספקת של C. elegans. עבור ניתוחים LC-MS/MS, הכינו צלחות 20 (60 מ"מ x 15 מ"מ) לכל קבוצה כ-100 נמטודות לכל צלחת כדי להבטיח תשואה לפחות 200 µg של חלבון עבור כל דגימה.
   הערה: חלק זה של הפרוטוקול אינו דורש עובד בתנאים סטריליים יותר, כמו נמטודות שנגבו, קפוא.
2. ביום של אוסף דגימה, להכין בחנקן נוזלי snap-להקפיא הדוגמאות שנאספו. לשמור על מאגר שאינו סטרילי M9 על קרח כדי להאט את חילוף החומרים של תולעים נימיות.
3. לשטוף את C. elegans של הצלחות על-ידי החלת 1 מ"ל M9 מאגר מתערבל בעדינות את הצלחות. זה מונע איסוף נמטודות המנוח ואת רוב הביצים, אם יש יותר מתנות, כי הם מקל חיידקים ועל אגר.
4. קח את עוצמת הקול, להעביר אותו צינור 15 מ"ל.
5. אחרי האוסף של המדגם המלא, המתן נמטודות להתפשר או centrifuge את הצינור בקצרה ב x 800 גרם ולהסיר רוב המאגר M9. לשטוף את הדגימה 3 x עם-10 מ"ל של M9 (10 x האחסון מדגם) כדי להסיר את כל החיידקים.
   הערה: כדי להבטיח כי כל נמטודות המנוח יוסרו, ציפה סוכרוז הוא אפשרות נוספת. עם זאת, זה לא היה מתאים ניסויים המוצג¹⁵. סוכרוז hydrolyzed גלוקוז, פרוקטוז. בניסויים מתוארים, תפקידו של גלוקוז הוערכה על מנת לקדם שינויים ביוכימיים נמצאו סוכרת כרונית. לפיכך, סוכרוז ציפה יכול באופן פוטנציאלי וחיסול את התוצאות.
6. להכין שפופרת אחת 1.5 mL מ ל 1 M9 מאגר שפופרת ריק mL 1.5 אחת עבור כל דגימה. העברה בגדר עם pipet זכוכית מהצינור 15 מ"ל הצינור mL 1.5 ריק. שלב זה חיוני להבטיח העברה כמותית.
   הערה: בניגוד במהלך השלבים הקודמים, כאן נמטודות מרוכזים יותר. בגלל הדבקות אפשרית טיפים pipet פלסטיק, אובדן של חלק גדול מן המדגם צפוי. לכן, השתמש במקום זאת פיפטות זכוכית.
7. לאחר ההעברה, השתמש על פיפטה מזכוכית לקחת 1 מ"ל M9 מאגר מהצינור 1.5 mL השני לשטוף את נמטודות מהקיר פיפטה. כמו כן, לשטוף את נמטודות הנותרים מהצינור 15 מ"ל ומעבירים אותם אל הצינור מדגם.
8. Centrifuge הצינור מדגם ב x 19,000 g עבור 1 דקות ולאחר מכן להסיר את תגובת שיקוע רב ככל האפשר.
9. חותם הצינור עם מצלמות-מיקרוסקופים ומיד snap-להקפיא אותו בחנקן נוזלי. לאחסן את הצינור ב- 80 ° C עד הכנת lysate.

4. חלבון לבידוד ספקטרומטר מסה

הערה: בידוד חלבון המתוארים כאן יכול לשמש גם עבור מבחני אחרים (למשל, תספיג).

1. לדגימת קפוא, להוסיף את אמצעי האחסון באותו של חרוזים זירקוניה 0.5 מ מ ולפחות 2 x הנפח של lysate מאגר שמכיל קוקטייל מעכבי proteinase.
   הערה: הניתוחים המתאם נמטודות-כדי-חלבון מתוארים בוצעו באמצעות 100 µL של המאגר. LC-MS/MS הדגימות היו lysed עם µL 200 המאגר.
2. התחל את מהמגן עבור 1 דקות על מהירות 9. ודא כי הדגימות הן לחלוטין lysed. חזור על שלב זה אם הם הם לא לגמרי lysed.
3. Centrifuge את הדגימות למשך 30 דקות ב 4 ° C ב 19,000 x g. להעביר את תגובת שיקוע צינור על הקרח ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס עד נוסף מדידות עומד להילקח.
   הערה: המאגר הלא-denaturing משמש את הניסויים מתוארים מורכב של החומרים הבאים: 20 מ מ טריס HCl (pH 8), 137 מ מ EDTA NaCl, 1% טריטון-X ו- 2 מ מ.
   הערה: לאחר השלבים של פרוטוקול זה, שיש להחיל את קנה המידה המוצע, התשואה של גלולה חלבון של נמטודות כ-1,000 צריך להיות כ- 500 µg. להשוואות יותר, להתייעץ עם איור 2 ואת התוצאות נציג.

5. משאבות למדידות ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית

הערה: בהתאם הפרמטר של עניין, הכנת הדוגמא יהיו שונים. פרוטוקול זה מתמקד methylglyoxal ונחישות גיל.

1. למדוד תאיים methylglyoxal על ידי derivatization עם 1, 2-diaminobenzene (DB) כפי שתואר לעיל⁹.
   1. Homogenize את הדגימות עם 20 µL של חומצת חומץ טריכלור הקר של 20% (wt/כרך) ב- 0.9% (wt/כרך) נתרן כלוריד, µL 80 מים צינור 1.5 מ.
   2. ספייק הדגימות של 5 µL עם תקן פנימי (¹³C₃-MG; 400 ננומטר), לערבב אותם על ידי vortexing ולאחר מכן centrifuge אותם ב x 21,000 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
   3. העברת µL 35 של תגובת שיקוע למבחנה דגימת HPLC המכיל הוספה זכוכית 200 µL.
   4. להוסיף 5 µL של אזיד הנתרן 3% (wt/כרך) כל מדגם ואחריו 10 µL של 0.5 מ מ DB 200 מ"מ HCl המכילה 0.5 מ מ diethylenetriaminepentaacetic חומצה (DETAPAC) במים.
   5. דגירה בדגימות במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
   6. לנתח את הדגימות מאת LC-MS/MS, כפי שתואר לעיל⁹.
      הערה: עבור המידה הגילאים, לבודד את החלבונים כמתואר בסעיף 4 של הפרוטוקול.
2. מודדים את ריכוז חלבון lysates (המופשרים) שימוש assay ברדפורד¹⁰.
   1. היכונו aliquots של 30 µL עיקול תקן מתובל שור אלבומין (BSA) נפתרה בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) הריכוז הבאים: 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 מ"ג/ד"ל.
      הערה: אם המדגם הוכן בגודל המוצע (ראה שלב 4.1 עבור הכנת lysate עם µL 200 המאגר), הריכוז מוערך צריך להיות בטווח של-7-2 מ"ג/מ"ל. במקרה זה, לדלל את דגימות 1:10 עם PBS לפני המדידה.
      הערה: עבור הניסויים הראשונים בשיטה זו, מומלץ למדוד את הדגימות ב דילולים שונים (1, 1:10 ו- 1: 100). מאחר אין קביעה מדויקת של המספר של נמטודות, התשואה יכולים להיות שונים בין חוקרים בודדים.
   2. השתמש צלחת 96-ובכן שקוף (פוליסטירן), פיפטה 10 µL של כל ריכוז רגיל ושל הדגימות ב דילולים שבחרת ב כפילויות בהבארות.
   3. לדלל את החלבון assay לצבוע ריאגנט להתרכז 1:5 עם מים מזוקקים (aq. dest.) ולהוסיף 200 µL של הדילול כל מדגם על הצלחת. דגירה את הצלחת. בשביל 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. למדוד את ספיגת בתוך 30 דקות ב- 595 nm בקורא צלחת. להיות עם אינטרפולציה הדגימות מן העקומה סטנדרטי מחושב. עוד פרטים על השיטה תוארו בהרחבה ב-¹⁰ספרות.
3. למדוד הדורות תאיים כמו שתואר לעיל^11,12.
   1. לשטוף את תמציות חלבונים הכולל (כ-200 µg) x 3 עם המים על ידי ultracentrifugation ב 10 יחידות צנטריפוגליות מסנן kDa.
   2. להוסיף החלבון התאושש (כ-100 µL) µL 10 מ"מ HCl 10 µL של פפסין (2 מ"ג/מ"ל ב- 20 מ מ HCl), µL 10 של תימול (2 מ"ג/מ"ל ב- 20 מ מ HCl), דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
   3. לנטרל ואת מאגר הדגימות ב- pH 7.4 על-ידי הוספת µL 12.5 0.5 M אשלגן פוספט מאגר (pH 7.4) ו µL 5 של 260 מ מ KOH.
   4. להוסיף 10 µL של Pronase E [2 מ"ג/מ"ל במאגר 10 מ מ אשלגן פוספט (pH 7.4)] ו 10 µL של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין, דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
   5. להוסיף 10 µL של aminopeptidase [2 מ"ג/מ"ל במאגר 10 מ מ אשלגן פוספט (pH 7.4)] ו 10 µL של prolidase [2 מ"ג/מ"ל במאגר 10 מ מ אשלגן פוספט (pH 7.4)], דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
   6. לנתח את hydrolysate שנוצר על ידי LC-MS/MS, כמו שתואר לעיל¹².

תוצאות

הנה דוגמאות של יצירת בקנה מידה גדול של C. elegans תרבות עבור יישומים במחקר הסוכרת מוצגים. זה יכול להיות עניין להתייחס הפרמטרים חיה יחידה, יותר מאשר את ההדורים לריכוז החלבון הכולל. ב- assay הדורשות מספר קטן של נמטודות, זו יכולה להיות מושגת בקלות על ידי ספירת של נמטודות. עבור ב?...

Discussion

פרוטוקול זה מציג גישה אמין עבור culturing בקנה מידה גדול של C. elegans כדי להשיג תוצאות כמותיות. ממצאים מתוך הספרות יכול לשכפל כמוצג בתיבה על התוצאות נציג. אף-על-פי פרוטוקול זה עבור האוסף של דוגמאות בקנה מידה גדול של C. elegans נראה שיטה ישר קדימה, ישנם החסרונות בטוח לקחת בחשבון. לגבי ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.