Investigadora de axón mamífero de regeneración: En Vivo electroporación de ganglio de raíz Dorsal de ratón adulto

Resumen

La electroporación es un enfoque efectivo para entregar genes de interés en las células. Al aplicar este enfoque en vivo en las neuronas del ganglio de la raíz dorsal de ratón adulto (DRG), se describe un modelo para el estudio de la regeneración del axón en vivo.

Resumen

La electroporación es un enfoque de transfección de genes no virales esenciales para introducir ADN plásmidos o pequeñas moléculas de ARN en células. Una neurona sensorial en el ganglio de raíz dorsal (GRD) extiende un solo axón con dos ramas. Una rama va al periférico del nervio (rama periférica) y la otra rama entra en la médula espinal a través de la raíz dorsal (rama central). Después de la lesión neuronal, la rama periférica regenera robusta mientras que la rama central no se regenera. Debido a la gran capacidad regenerativa, regeneración del axón sensorial ha sido ampliamente utilizada como un sistema modelo para estudiar la regeneración del axón mamífero en sistema nervioso periférico (PNS) y sistema nervioso central (SNC). Aquí, describimos un protocolo de acercamiento previamente establecido para manipular genes en neuronas sensoriales maduras en vivo a través de electroporación. Basado en la transfección con plásmidos o pequeño oligos de RNA (siRNAs o microRNA), el enfoque permite para que ambos experimentos de pérdida y ganancia de función estudiar el papel de los genes de interés o microRNA en regulación de la regeneración de axones en vivo. Además, la manipulación de la expresión génica en vivo puede ser controlada tanto espacial como temporal dentro de un curso de tiempo relativamente corto. Este sistema de modelo constituye una herramienta única para investigar los mecanismos moleculares que regeneración del axón mamíferos es regulado en vivo.

Introducción

Lesiones del sistema nervioso causaron por un traumatismo neural o diversas enfermedades neurodegenerativas generalmente son el resultado de defectos en las funciones de motor, sensoriales y cognitivas. Recientemente, se ha dedicado mucho esfuerzo al restablecimiento de potencia regenerativa en neuronas adultas para restaurar la functionsof fisiológica herido las neuronas^1,2,3. Las neuronas sensoriales en el DRG son un grupo de células nerviosas que transmiten diferentes estímulos sensoriales, tales como dolor, temperatura, tacto o postura del cuerpo, al cerebro. Cada uno de estas neuronas seudo unipolar y contiene un único axón que se bifurca con una rama que se extiende hacia la periferia y la otra rama hacia la médula espinal⁴. Las neuronas sensoriales adultos en DRGs son entre unas neuronas maduras de mamíferas conocidas para regenerar sus axones activamente después de la lesión. Por lo tanto, lesiones de los axones sensoriales han sido ampliamente utilizados como un modelo fundamental para el estudio de los mecanismos de regeneración axonal en vivo.

En vivo técnicas de transfección génica, que son generalmente menos desperdiciador de tiempo configurar y más flexible que el uso de animales transgénicos, han jugado papeles esenciales en el estudio de las funciones de genes y señalización de vías en el sistema nervioso. Las principales técnicas pueden dividirse en dos enfoques: instrumento y virus⁵. Viral basado en vivo entrega de genes en neuronas adultas puede proporcionar precisa manipulación espacio-temporal de gene expresión⁶. Sin embargo, procesos que requieren mucho trabajo participan en métodos basados en virales, tales como la producción y purificación de partículas virales que contiene el gen deseado. Además, muchos vectores virales podrían activar el sistema inmune del huésped, que puede interferir con la adquisición de datos, análisis de datos y posiblemente confundir la interpretación de resultados experimentales. Electroporación, un enfoque basado en el instrumento típico de la transfección, utiliza un impulso eléctrico para aumentar la permeabilidad celular y las membranas nucleares transitoriamente, que favorece la afluencia de vectores del gene o pequeño RNA oligos de espacio fuera de las células⁷ . Electroporación in vitro es reconocida ampliamente como una estrategia transitoria pero muy eficiente para manipular la expresión de genes específicos en muchos tipos celulares. Aunque en vivo electroporación sólo conduce a la expresión génica transitoria con baja eficiencia de transferencia en comparación con vectores virales, tiene diversas ventajas sobre enfoques virales. Por ejemplo, se puede aplicar a casi todas las células y tejidos^7,8,9. Además, ambos plásmidos que codifican genes de interés o pequeños RNA oligos (p. ej., siRNAs, microRNA) contra ciertas transcripciones pueden ser inyectados directamente en el tejido de la blanco y entonces pulsados eléctricamente, que hacer el procedimiento menos mano de obra - y tiempo - consumiendo. Además, es posible transfectar múltiples plásmidos y RNA oligos simultáneamente con electroporación sola.

Hemos establecido un método de electroporación en vivo para manipular genes en neuronas sensoriales de ratón adulto y aplicado con éxito y validado dicho enfoque en numerosos estudios pioneros de^{1,2,3 ,8,10}. Aquí, presentamos un protocolo detallado para facilitar el uso de este enfoque para futuros estudios de la regeneración del axón mamífero.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron según el protocolo animal aprobado por la Johns Hopkins institucional Animal cuidado y uso.

1. materiales y reactivos

1. Animales
   1. Utilizar ratones CF1 femeninos seis semanas de edad que pesa 30-35 g para los experimentos.
      Nota: Los ratones fueron alojados en grupo (5 ratones por jaula) en jaulas ventiladas individualmente esterilizados con 1/4" maíz mazorca ropa de cama y 2" cuadrado nestlets para anidar. Las jaulas se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h controlado y la temperatura ambiente fue de 19,4 ° C a 25 ° C. Los ratones fueron alimentados con una dieta de roedor global y automático sistema de abastecimiento de agua.
2. Instrumentos
   1. Utilizar los siguientes instrumentos quirúrgicos para llevar a cabo eficientemente la cirugía: piel de Iknyecciones desechables (27 G, 1,0 mL) por inyección intraperitoneal, clipper, microscopio estéreo disección, pinzas de microcirugía, tijeras de microcirugía y gubias hueso pequeño y esponjas no tejida esterilizadas.
      Nota: Todos los instrumentos y materiales son autoclave antes de la cirugía o previamente esterilizado por los productores. Durante la cirugía, los instrumentos son rociados con alcohol al 75% para mantener la esterilización.
3. Soluciones anestésicas
   1. Utilice solución anestésica #1 para inducir la anestesia y solución de anestesia #2 antes de la inyección de DRG para mantener la anestesia.
      1. Para hacer la solución anestésica #1, diluir la ketamina y xilacina en solución salina estéril a una concentración final de 10 mg/mL y 1.2 mg/mL.
      2. Para hacer la solución anestésica #2, diluir avertin en solución salina estéril a una concentración final de 20 mg/mL.
4. Plásmido de DNA y RNA Oligos
   1. Preparación de plásmidos mediante el kit comercial siguiendo los protocolos del fabricante por consiguiente. Diluir el plásmido DNAs en agua desionizada estéril a la concentración de 2.0 μg/μl.
   2. Añadir solución de tinte verde Fast Green para llegar a una concentración final de 0.005-0.01% (v/v) para mejor visualización del contorno DRG durante la inyección.
   3. Disolver los oligos siRNA o microRNA en buffers correspondientes proporcionados por los fabricantes para llegar a una concentración final a 50 μm.
5. Pipeta de microinyección
   1. Tire el vaso capilar utilizando el tirador de la micropipeta y cortar la punta de la pipeta de vidrio capilar tirado con tijeras de microcirugía para generar un orificio con un diámetro exterior de aproximadamente 50 μm. Luego esterilizar la pipeta de cristal bajo luz UV en un banco limpio para 20-30 min aproximadamente.
   2. Monte la pipeta de vidrio esterilizada en el soporte de pipeta conectada a una microinyección intracelular dispense el sistema. Configure los parámetros del sistema de microinyección en 30 psi de presión y 8 ms de duración.
6. Sistema de electroporación
   1. Conecte los electrodos para el sistema de electroporación de onda cuadrada y definir los siguientes parámetros: pulsos de 15 ms a 35 V con intervalos de 950 ms para la electroporación en vivo .
7. Perfusión y la solución de fijación
   1. Disolver el polvo paraformaldehido (PFA) en PBS 1 x a una concentración del 4% (w/v). Almacenar la solución de la PFA a 4 ° C.

2. experimentales procedimientos

1. Exposición quirúrgica de la L4 y L5 DRGs
   1. Anestesiar el ratón utilizando una inyección intraperitoneal de solución anestésica #1 preparado previamente (con ketamina 100 mg/kg de peso y 12 mg/kg de xilacina peso corporal).
   2. Rasure el área quirúrgico con la recortadora de pelo.
      Nota: Ya que habrá otra cirugía para el nervio ciático izquierdo agolpamiento, la piel del muslo posterior izquierdo puede ser afeitada simultáneamente.
   3. Coloque el ratón sobre la manta climatizada (35,0 ° C) y controlar la temperatura rectal con una sonda de temperatura.
   4. Prueba de la anestesia, pellizcar los dedos de los pies y cola de ratón y observar las respuestas conductuales.
   5. Los cuatro miembros del ratón sobre el panel de corcho con cinta.
   6. Limpie el área quirúrgico con solución de yodoforo y luego con alcohol al 75% para quitar el yodoforo antes de cortar la piel.
   7. Aplicar pomada oftálmica en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
   8. Antes de la incisión, marque ambos lados de la cresta ilíaca con un rotulador fino. Dibujar una línea que conecta dos puntos de las crestas ilíacas para facilitar la identificación de las posiciones de DRG L5.
   9. Hacer una incisión de 3 cm a lo largo de la línea media de la espalda baja con micro tijeras. Además, separar los músculos paraspinous, como la multifidus musculus del musculus longissimus lumborum, de L3 a S1 apófisis y exponer las articulaciones facetarias L4-5 y L5-6.
   10. Utilice una pinza de micro para quitar las articulaciones facetarias L4-5 y L5-6. Por otra parte, eliminar el arco neural izquierdo de L4 y L5 para exponer el lado dorsal de la GRD.
2. Inyección de DRG
   1. Inyectar la solución anestésica #2 (con avertin 200 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal para mantener la anestesia antes de la inyección de la DRG.
   2. Cargar los plásmidos de DNA o RNA oligos (1 μl por DRG) dentro de la pipeta capilar de vidrio.
   3. Inserte cuidadosamente la punta de la pipeta capilar de vidrio en el DRG.
   4. Poco a poco inyecte 1,0 solución μl plásmidos de DNA o RNA oligos en el DRG usando la microinyección intracelular dispensar sistemas (30 psi, 8 ms).
      Nota: La duración de la inyección debe durar no menos de 5 minutos.
3. Electroporación
   1. Gota de PBS sobre las puntas de los electrodos.
   2. Limpiar el sangrado con una gasa esterilizada cuadrado de algodón.
   3. Pellizque suavemente el objetivo DRG con los electrodos y aplicar 5 pulsos cuadrados eléctricos con el sistema de electroporación.
   4. Cerca de las capas de músculo y la piel con suturas de nylon 5-0 respectivamente.
   5. Coloque el ratón sobre una manta climatizada (35,0 ° C) debajo de mucha atención hasta que completamente ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Volver el ratón a la jaula casera después de que ha recuperado de la anestesia.
      Nota: Tarda aproximadamente 60 minutos para que el ratón para recuperarse totalmente de la anestesia en la manta de 37 ° C. Disolver un ibuprofeno (200 mg) la píldora en 1.000 ml de agua (0,2 mg/ml) para la alimentación diaria para aliviar el dolor post-surgical.
4. Aplastamiento del nervio ciático
   1. Dos o tres días (dependiendo del diseño experimental) después de la electroporación DRG, anestesiar el ratón por vía intraperitoneal con solución anestésica #2 (con avertin 400 mg/kg de peso corporal).
   2. Los cuatro miembros del ratón sobre el panel de corcho con cinta.
   3. Realizar una incisión de 1 cm de 0,5 cm en el lado izquierdo a lo largo de la línea media. Cortar los músculos, como el glúteo mayor y el músculo piriforme, longitudinalmente. Exponga el segmento del nervio ciático entre el foramen ciático mayor y la muesca ciática.
   4. Aplastamiento del nervio con pinzas de microcirugía para 12 s y marca el sitio de crush con sutura epineural nylon 10-0. Hacer un nudo en la membrana dural para marcar el sitio de crush.
   5. Cerca de las capas de músculo y la piel con sutura de nylon 5-0.
   6. Coloque el ratón sobre una manta climatizada (35,0 ° C) con mucha atención hasta que completamente ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Volver el ratón a la jaula casera después de que ha recuperado de la anestesia.
      Nota: Tarda aproximadamente 60 minutos para que el ratón para recuperarse totalmente de la anestesia en la manta de 37 ° C. Disolver un ibuprofeno (200 mg) la píldora en 1.000 ml de agua (0,2 mg/ml) para la alimentación diaria para aliviar el dolor post-surgical.
5. Perfusión de ratón, DRG y cosecha de nervio ciático
   1. Dos o tres días después del aplastamiento del nervio ciático (dependiendo del diseño experimental), anestesiar el ratón por vía intraperitoneal con solución anestésica #2.
   2. Inundar el transcardially ratón con PBS (pH 7.4) seguido por la helada 4% paraformaldehido (PFA) (pH 7,5) en PBS.
   3. Después de la perfusión, separar los DRGs junto con las raíces de nervio y el nervio ciático antes de la rodilla cuidadosamente con tijeras micro y micro pinzas bajo el microscopio de disección. Coloque el nervio ciático directamente en el 4% PFA durante la noche a 4 ° C.
6. La proyección de imagen y medición de los axones sensoriales marcados con fluorescencia
   1. Tira el tejido Unido y membrana en el nervio ciático fijo con tijeras micro y micro pinzas cuidadosamente bajo el microscopio de disección. Entonces, cambio el 4% del PFA con PBS y lavado el nervio tres veces.
   2. Coloque el nervio ciático en un portaobjetos y seguir recto. Añadir 80 μl de solución antifade alrededor del nervio, luego coloque un cubreobjetos sobre ella. Aplanar el tejido todo montado con la presión.
   3. Coloque los flattened tejidos en el microscopio invertido epifluorescent equipado con un accesorio para mosaico adquisición y procesamiento de imágenes.
      Nota: Las longitudes de excitación y emisión son 488 nm y 509 nm. También es posible tomar varias imágenes superpuestas manualmente y coser las imágenes ImageJ junto con el plug-in de mosaico.
   4. Al medir la longitud de los axones regenerados, trace identifiable todos fluorescently-labeled axones en el nervio ciático desde el sitio de crush (marcado con la sutura epineural de 10-0) a los extremos del axón distal.

Resultados

Para cuantificar la citotoxicidad del protocolo actual y para validar que tipo de transfección de en vivo DRG electroporación es lo suficientemente alta, inyectamos y electroporated fluorescencia etiquetada microRNA o siRNA en L4 y L5 GRD. Los DRGs separadas fueron procesados a través de cryo-seccionamiento e inmunohistoquímica (figura 1A-B). Estimación de la tasa de supervivencia de la célula después de la inyección y electr...

Discusión

Varios pasos quirúrgicos requieren especial atención. La L4 y L5 DRGs (localización del Soma), que dominan el nervio ciático, necesitan ser correctamente identificados e inyectado con construcciones de genes. De lo contrario, el etiquetado de GFP estará ausente en los axones del nervio ciático. Las crestas ilíacas pueden verse como puntos de referencia anatómicas útiles localizar L4 y L5 GRD. En la mayoría de ratones, empalme entre las vértebras L5 y L6 de la faceta es proximal a las crestas ilíacas

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief