Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Zusammenfassung

Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Zusammenfassung

Elektroporation ist eine wesentliche nicht-viralen Gen Transfektion Annäherung an DNA Plasmide oder kleinen RNA-Molekülen in Zellen bringen. Eine sensorische Neuron im Dorsal Root Ganglion (DRGs) erstreckt sich ein einziges Axon mit zwei Niederlassungen. Ein Zweig geht an die peripheren Nerven (periphere Zweig) und der andere Zweig tritt das Rückenmark durch den Dorsal Root (zentrale Niederlassung). Nach der neuronalen Verletzung regeneriert der peripheren Zweig robust während der zentralen Zweig nicht regenerieren. Aufgrund der hohen Regenerationsfähigkeit hat sensorische Axon Regeneration als Modellsystem verbreitet Säugetier-Axon Regeneration im peripheren Nervensystem (PNS) und das zentrale Nervensystem (ZNS) zu studieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll über vorher festgelegten Ansatz zur Genexpression in Reife sensorischen Neuronen in Vivo über Elektroporation zu manipulieren. Basierend auf Transfektion mit Plasmide oder kleine RNS Oligos (SiRNAs oder Micro-RNAs), ermöglicht der Ansatz sowohl Verlust und Gewinn-of-Function-Experimente, die Rolle der Gene-of-Interests oder Micro-RNAs in Regulation der Axon Regeneration in Vivozu studieren. Darüber hinaus kann die Manipulation der Gene Expression in Vivo innerhalb einer relativ kurzen zeitlichen Verlauf sowohl räumlich als auch zeitlich gesteuert werden. Dieses Modellsystem bietet ein einzigartiges Werkzeug, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen mit denen Säugetier-Axon Regeneration regulierten in Vivoist.

Einleitung

Verletzungen des Nervensystems verursacht durch neuronale Trauma oder verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen führen in der Regel Mängel in motorischen, sensorischen und kognitiven Funktionen. Vor kurzem wurde viel Aufwand regenerative Potenz Wiedereinsetzung in den vorigen in Erwachsenen Neuronen zur Wiederherstellung der physiologischen Functionsof verletzte Nervenzellen^1,2,3gewidmet. Sensorische Neuronen in der DRG sind eine Ansammlung von Nervenzellen, die verschiedene sensorische Reize wie Schmerz, Temperatur, Touch oder Körperhaltung, an das Gehirn vermitteln. Jedes dieser Neuronen ist Pseudo-unipolar und enthält ein einziges Axon, das mit einer Erweiterung in Richtung der Peripherie und der andere Zweig in Richtung Rückenmark⁴gabelt. Die Erwachsenen sensorischen Neuronen in DRGs gehören ein paar Reifen Säugetier-Neuronen bekannt, deren Axone aktiv nach Verletzungen zu regenerieren. Daher sind Verletzungen von sensorischen Axonen ausgiebig als entscheidende Modell eingesetzt worden, um die Mechanismen der axonalen Regeneration in Vivozu studieren.

In Vivo gen Transfection Techniken, die in der Regel weniger zeitaufwendig, einrichten und flexibler als die Verwendung von transgenen Tieren sind, spielen wichtige Rollen im Studium der Funktionen der Gene und Signalwege im Nervensystem. Die wichtigsten Techniken können kategorisiert werden, in zwei Ansätze: Instrument und Virus-basierte⁵. Viral-basierte in-Vivo -gen Lieferung in Erwachsenen Neuronen bieten präzise raumzeitlichen Manipulation der Gen-Expression-⁶. Arbeitsintensive Prozesse sind jedoch im viral-basierte Methoden wie die Produktion und Reinigung der Viruspartikel enthält das gewünschte gen beteiligt. Darüber hinaus könnten viele virale Vektoren das Immunsystem des Wirtes, aktivieren, die stören der Datenerfassung, Datenanalyse und die Interpretation der experimentellen Ergebnisse möglicherweise in die Irre führen kann. Elektroporation, ein typisches Instrument-basierte Transfektion Ansatz nutzt einen elektrischen Impuls erhöhen die Durchlässigkeit der Zell- und Kernmembran vorübergehend, der den Zustrom von Gen-Vektoren oder kleine RNS Oligos aus Raum außerhalb der Zellen^{7 begünstigt} . In-vitro- Elektroporation ist weithin anerkannt als eine vorübergehende aber höchst effiziente Strategie für die Manipulation gezielt Genexpression in vielen Zelltypen. Obwohl nur mit geringer transfecting Effizienz im Vergleich zu viralen Vektoren in Vivo Elektroporation zu transiente Genexpression führt, hat verschiedene Vorteile gegenüber viralen Ansätzen. Zum Beispiel kann es auf fast allen Geweben und Zellen^7,8,9angewendet werden. Darüber hinaus entweder Plasmide Kodierung Gene-of-Interest oder kleine RNS Oligos (z. B. SiRNAs, Micro-RNAs) gegen bestimmte Protokolle können direkt in das Zielgewebe injiziert und dann elektrisch gepulst, die machen des Verfahrens weniger Arbeit - und Zeit - Konsum. Darüber hinaus ist es möglich, mehrere Plasmide und RNS Oligos gleichzeitig mit einzelnen Electroporation transfecting.

Wir haben eine in Vivo Elektroporation Ansatz zur Genexpression in Erwachsenen Maus sensorischen Neuronen zu manipulieren und erfolgreich im Einsatz und Validierung solcher Ansatz in zahlreichen Pionier Studien^{1,2,3 ,8,10}. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll um die Nutzung dieses Ansatzes für zukünftige Studien der Säugetier-Axon Regeneration zu erleichtern.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß dem tierischen Protokoll durch die Johns Hopkins institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt durchgeführt.

(1) Materialien und Reagenzien

1. Tiere
   1. Verwenden Sie sechs Wochen alten weiblichen CF1 Mäuse mit einem Gewicht von 30 – 35 g für die Experimente.
      Hinweis: Die Mäuse waren Gruppe untergebracht (5 Mäusen pro Käfig) in individuell belüfteten sterilisierte Käfigen mit 1/4" Corn Cob Betten und 2" quadratischen Nestlets für den Nestbau. Die Käfige wurden in einem kontrollierten 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus beibehalten und die Raumtemperatur war zwischen 19,4 ° C und 25 ° C. Die Mäuse wurden mit globale Nagetier Diät Wasser und automatische Lieferung System eingespeist.
2. Instrumente
   1. Folgende chirurgische Instrumente nutzen, um effizient die Operation durchführen: Einwegspritzen (27 G, 1,0 mL) für die intraperitoneale Injektion, Pelz, Clipper, Stereo-Dissektion Mikroskop, Mikro-Chirurgie-Zange, Schere Mikro-Chirurgie und kleine Knochen Rongeurs und sterilisierte Vlies Schwämme.
      Hinweis: Alle Instrumente und Materialien sind vor der Operation autoklaviert oder vorsterilisierten von den Herstellern. Während der Operation werden die Instrumente mit 75 % Alkohol weiterhin die Sterilisation besprüht.
3. Betäubende Lösungen
   1. Verwenden Sie Betäubungsmittel Lösung #1 zu induzieren die Narkose und Anästhesie Lösung #2 vor DRG Injektion verwenden, um die Narkose aufrechtzuerhalten.
      1. Um Betäubungsmittel Lösung #1 zu machen, Ketamin und Xylazin in steriler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 10 mg/mL und 1,2 mg/mL zu verdünnen.
      2. Um Betäubungsmittel Lösung #2, verdünnen Sie avertin in steriler Kochsalzlösung in einer Endkonzentration von 20 mg/mL.
4. Plasmid DNA und RNS Oligos
   1. Bereiten Sie die Plasmide mit dem kommerziellen Kit des Herstellers Protokolle entsprechend nach. Verdünnen Sie das Plasmid DNA in sterilen deionisiertes Wasser auf die Konzentration von 2,0 µg/µL.
   2. Fügen Sie schnell grüne Farbstofflösung zur Erreichung eine Endkonzentration von 0,005-0,01 % (V/V) zur besseren Visualisierung der DRG Gliederung beim Einspritzen.
   3. Auflösen der SiRNA oder MicroRNA Oligos in entsprechenden Puffer zur Verfügung gestellt von Herstellern, eine Endkonzentration an 50 µM zu erreichen.
5. Mikro-Injektion Pipette
   1. Ziehen Sie die Kapillare Glas Mikropipette Puller und schneiden Sie die Spitze der Kapillare gezogenem Glaspipette mit Mikrochirurgie Schere, eine Öffnung mit einem ungefähren Außendurchmesser 50 µm zu generieren. Dann Sterilisieren Sie die Glaspipette unter UV-Licht auf einer sauberen Werkbank für 20 – 30 min. ca..
   2. Berg der sterilisierten Glaspipette auf die Pipette Halter mit einer intrazellulären Mikroinjektion verbunden verzichten System. Legen Sie die Parameter des Systems der Mikroinjektion 30 PSI Druck und 8 ms Dauer.
6. Electroporation System
   1. Schließen Sie die Elektroden an das Rechtecksignal Elektroporation System und legen Sie die folgenden Parameter: 15 ms Impulse bei 35 V mit 950 ms-Takt für in Vivo Elektroporation.
7. Perfusion und Befestigung Lösung
   1. Lösen Sie das Paraformaldehyd (PFA) Pulver in 1 X PBS in einer Konzentration von 4 % (w/V). Die PFA-Lösung bei 4 ° c Lagern

(2) experimentelle Verfahren

1. Chirurgische Exposition von L4 und L5 DRGs
   1. Betäuben Sie die Maus über eine intraperitoneale Injektion von Betäubungsmittel Lösung #1 zuvor (mit Ketamin 100 mg/kg Körpergewicht und Xylazin 12 mg/kg Körpergewicht) zubereitet.
   2. Der OP-Bereich mit Fell Clipper zu rasieren.
      Hinweis: Da gibt es eine weitere Operation für linken Ischiasnerv Crush, kann das Fell am linken hinteren Oberschenkel gleichzeitig rasiert.
   3. Platzieren Sie den Mauszeiger auf die beheizte Decke (35,0 ° C) und überwachen Sie die rektale Temperatur mit einem Temperaturfühler.
   4. Um die Narkose zu testen, drücken Sie die Zehen und Tail der Maus und beobachten Sie die Verhaltensreaktionen.
   5. Kleben Sie die vier Gliedmaßen der Maus auf die Pinnwand.
   6. Wischen Sie den OP-Bereich mit jodophor Lösung und dann mit 75 % Alkohol, die jodophor vor dem Schneiden der Haut zu entfernen.
   7. Tragen Sie ophthalmologischen Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
   8. Vor dem Schnitt markieren Sie beide Seiten der Beckenkamm Wappen mit einem feinen Filzstift. Zeichnen Sie eine Linie zwischen zwei Punkten der Beckenkamm Wappen zu erleichtern, die Positionen der L5 DRGs zu identifizieren.
   9. Machen Sie einen 3 cm Schnitt entlang der Mittellinie des unteren Rücken mit Mikro-Schere. Darüber hinaus lösen Sie die Paraspinous Muskeln, wie der Musculus Multifidus und der Musculus Longissimus Lumborum von L3 bis S1 Dornfortsätze und setzen Sie der Facettengelenke der L4-5 und L5-6 aus.
   10. Verwenden Sie eine Mikro-Rongeur, um der Facettengelenke der L4-5 und L5-6 zu entfernen. Darüber hinaus entfernen Sie Links neuralen Bogens von L4 und L5, die dorsale Seite der DRGs verfügbar zu machen.
2. DRG-Injektion
   1. Injektion von Betäubungsmittel Lösung #2 (mit avertin 200 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal weiterhin die Betäubung vor der DRG-Injektion.
   2. Die Kapillare Glaspipette Plasmid DNA oder RNS Oligos (1 µL pro DRG) bestücken.
   3. Die Kapillare Glas PIPETTENSPITZE vorsichtig in die DRG einführen.
   4. 1,0 µL Lösung von DNA Plasmide allmählich zu injizieren oder RNS Oligos in die DRG mit der intrazellulären Mikroinjektion verzichten Systeme (30 Psi, 8 ms).
      Hinweis: Die Dauer der Injektion sollte nicht weniger als 5 Minuten dauern.
3. Elektroporation
   1. Fallen Sie PBS auf Tipps der Elektroden.
   2. Bereinigen Sie die Blutung mit sterilisierten quadratische Baumwoll Gaze.
   3. Das Ziel DRG mit den Elektroden sanft Kneifen und 5 quadratische elektrische Impulse mit dem Elektroporation-System anwenden.
   4. Schließen Sie die Muskel und Haut Schichten jeweils mit 5: 0-Nylon-Fäden.
   5. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer beheizten Decke (35,0 ° C) unter Beachtung der engen, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen vollständig wiedererlangt hat. Die Maus zu Hause Käfig zurück, nachdem es vollständig von der Narkose erholt hat.
      Hinweis: Es dauert ca. 60 min. für die Maus aus der Narkose auf 37 ° C Decke vollständig erholen. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung um postoperative Schmerzen zu lindern.
4. Ischiasnerv Crush
   1. Betäuben Sie zwei oder drei Tage (abhängig von den Versuchsplan) nach der DRG-Elektroporation, die Maus intraperitoneal mit Narkose Lösung #2 (mit avertin 400 mg/kg Körpergewicht).
   2. Kleben Sie die vier Gliedmaßen der Maus auf die Pinnwand.
   3. Machen Sie einen 1 cm Schnitt 0,5 cm auf der linken Seite entlang der Mittellinie. Geschnitten Sie die Muskeln, wie Musculus Muskel und Piriformis Muskel Längsrichtung. Setzen Sie das Segment des Nervus ischiadicus zwischen größeren sciatic Foramen und sciatic Kerbe.
   4. Crush der Nerv mit Mikrochirurgie Zangen für 12 s und Mark die Crush-Website mit einer 10-0 Nylon Epineural Naht. Machen Sie einen Knoten auf der duralen Membran anlässlich die Crush-Website.
   5. Schließen Sie die Muskel und Haut Schichten mit 5: 0-Nylon-Naht.
   6. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einer beheizten Decke (35,0 ° C) mit großer Aufmerksamkeit, bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen vollständig wiedererlangt hat. Die Maus zu Hause Käfig zurück, nachdem es vollständig von der Narkose erholt hat.
      Hinweis: Es dauert ca. 60 min. für die Maus aus der Narkose auf 37 ° C Decke vollständig erholen. Lösen Sie eine Tablette (200 mg) Ibuprofen in 1.000 ml Wasser (0,2 mg/ml) für die tägliche Fütterung um postoperative Schmerzen zu lindern.
5. Maus-Perfusion, DRG und Ischiasnerv Ernte
   1. Zwei oder drei Tage nach der Ischiasnerv crush (abhängig von den experimentellen Design), die Maus intraperitoneal mit Narkose Lösung #2 zu betäuben.
   2. Durchspülen der Maus-Transcardially mit PBS (pH 7,4) gefolgt von eiskalten 4 % Paraformaldehyd (PFA) (pH 7,5) mit PBS-Puffer.
   3. Nach Perfusion trennen die DRGs zusammen mit den Nervenwurzeln und Ischiasnerv vor das Knie vorsichtig mit Mikro-Schere und Mikro-Pinzetten unter dem Mikroskop Dissektion. Legen Sie den Ischiasnerv direkt in 4 % PFA über Nacht bei 4 ° C.
6. Imaging und Messung der Fluoreszenz-markierten sensorische Axone
   1. Die beigefügten Gewebe und Membran auf den festen Ischiasnerv mit Mikro-Schere und Mikro-Pinzetten sorgfältig unter dem Mikroskop Dissektion abzustreifen. Dann tauschen die 4 % PFA mit PBS und Waschen der Nerv drei Mal.
   2. Legen Sie den Ischiasnerv auf einer Folie und halten Sie gerade. Fügen Sie 80 µL antifade Lösung um den Nerv, dann legen Sie einem deckgläschen auf. Glätten Sie das ganze montierte Gewebe mit Druck.
   3. Das invertierte Epifluorescent Mikroskop ausgestattet mit Zubehör für Mosaik-Akquisition und Bildverarbeitung legen Sie plattgewalzt Gewebe auf.
      Hinweis: Die Anregung und Emission Längen sind 488 nm und 509 nm. Es ist auch möglich, mehrere überlappende Bilder manuell und Nähen Sie die Bilder zusammen mit ImageJ mit dem Mosaik-Plug-in.
   4. Bei der Messung der Länge des regenerierten Axone verfolgen Sie alle identifizierbare mit der Bezeichnung von fluorescently Axone in den Ischiasnerv von der Crush-Website (gekennzeichnet mit dem 10-0-Epineural-Naht) an den distalen Axon enden.

Ergebnisse

Zur Quantifizierung der Zytotoxizität des aktuellen Protokolls und zu validieren, dass Transfektion in Vivo DRG Elektroporation ist hoch genug, wir injiziert und elektroporiert eindringmittel getaggt MicroRNA oder SiRNA in L4 und L5 DRGs. Die freistehende DRGs wurden durch Cryo-schneiden und Immunohistochemistry (Abbildung 1A-B) verarbeitet. Wenn die Zelle Überlebensrate nach Injektion und Elektroporation schätzen, waren die intak...

Diskussion

Mehrere chirurgische Schritte erfordern besondere Aufmerksamkeit. Die L4 und L5 DRGs (Lage des Somas), die den Ischiasnerv zu beherrschen, müssen korrekt erkannt und mit Genkonstrukte injiziert werden. Andernfalls werden die GFP-Kennzeichnung fehlt im Ischiasnerv Axone. Der Beckenkamm Wappen können als nützliche anatomischen Landmarken, L4 und L5 DRGs ermitteln angesehen werden. Bei den meisten Mäusen ist die Facette gemeinsame zwischen L5 und L6 Wirbeln proximate Beckenkamm Wappen¹². Alternat...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief