Chargée de l’enquête la régénération axonale mammifères : In Vivo électroporation du Ganglion de la racine dorsale de souris adulte

Résumé

Électroporation est une approche efficace pour livrer des gènes d’intérêts dans les cellules. En appliquant cette approche in vivo sur les neurones du ganglion de la racine dorsale de souris adulte (DRG), les auteurs décrivent un modèle pour l’étude de la régénération axonale in vivo.

Résumé

Électroporation est une approche de transfection du gène non viraux essentiel pour introduire des plasmides d’ADN ou de petites molécules d’ARN dans des cellules. Un neurone sensitif du ganglion de la racine dorsale (DRGs) s’étend d’un seul axone avec deux branches. Une branche va au périphérique nerf (branche périphérique) et l’autre branche pénètre dans la moelle épinière par l’intermédiaire de la racine dorsale (direction de la centrale). Après la lésion neurale, la branche périphérique régénère vigoureusement tandis que la branche centrale ne régénère pas. En raison de la forte capacité régénératrice, la régénération axonale sensorielle a été largement utilisée comme système modèle pour étudier la régénération axonale mammifères en système nerveux périphérique (SNP) et le système nerveux central (CNS). Nous décrivons ici un protocole approche établie antérieurement pour manipuler l’expression des gènes dans les neurones sensoriels matures in vivo par électroporation. Après transfection avec plasmides ou petits RNA oligos (siARN ou micro-ARN), l’approche permet les deux expériences de perte et de gain de-fonction d’étudier les rôles des gènes-de-intérêts ou de micro-ARN dans le règlement d’axon regeneration in vivo. En outre, la manipulation de l’expression génique in vivo peut être commandée spatialement et temporellement dans un cours laps de temps relativement court. Ce système de modèle fournit un outil unique pour étudier les mécanismes moléculaires par lesquels la régénération axonale mammifères est réglementé en vivo.

Introduction

Lésions du système nerveux provoquée par un traumatisme nerveux ou diverses maladies neurodégénératives généralement entraîner des défauts dans les fonctions motrices, sensorielles et cognitives. Récemment, beaucoup d’efforts a été consacré à la restitutio in integrum puissance régénératrice dans les neurones adultes pour restaurer les statuts physiologique blessé neurones^1,2,3. Les neurones sensoriels dans le PMSI sont un amas de cellules nerveuses qui transmettent les stimuli sensoriels différents, tels que douleur, température, touch ou posture du corps, le cerveau. Chacun de ces neurones est Pseudo-aléatoire unipolaire et contient un seul axone qui bifurque avec une branche qui s’étend vers la périphérie et l’autre branche vers la moelle épinière⁴. Les neurones sensoriels adultes en GHM sont parmi les quelques neurones mammifères matures connues pour régénérer leurs axones activement après une blessure. Par conséquent, lésions des axones sensoriels ont été employées intensivement comme un modèle crucial pour étudier les mécanismes de la régénération axonale in vivo.

In vivo techniques de transfection génétique, qui sont généralement moins de temps à mettre en place et plus souple que l’utilisation d’animaux transgéniques, ont joué un rôle essentiel dans l’étude des fonctions des gènes et signalisation dans le système nerveux. Les principales techniques peuvent être classés en deux approches : la⁵axée sur l’instrument et la base de virus. Base virale in vivo la livraison de gène dans les neurones adultes peut fournir précise manipulation spatio-temporelle de gene expression⁶. Cependant, beaucoup de travail processus interviennent dans les méthodes axées sur le viral, tels que la production et la purification des particules virales contenant le gène désiré. En outre, beaucoup de vecteurs viraux pourrait activer le système immunitaire de l’hôte, qui peut interférer avec l’acquisition de données, analyse de données et éventuellement induire en erreur l’interprétation des résultats expérimentaux. Électroporation, une approche axée sur l’instrument typique de la transfection, utilise une impulsion électrique pour augmenter la perméabilité des cellules et des membranes nucléaires transitoirement, ce qui favorise l’afflux de vecteurs de gènes ou de petits RNA oligos depuis l’espace à l’extérieur des cellules⁷ . In vitro électroporation est largement reconnue comme une stratégie transitoire mais très efficace pour manipuler l’expression des gènes ciblés dans plusieurs types de cellules. Bien que en vivo électroporation ne conduit qu’à l’expression transitoire avec la faible efficacité de transfection par rapport aux vecteurs viraux, il a plusieurs avantages par rapport aux approches virales. Par exemple, il peut être appliqué à presque tous les tissus et cellules^7,8,9. En outre, deux plasmides codant des gènes d’intérêt ou petits RNA oligos (p. ex., siRNAs, microARN) contre certaines transcriptions peuvent être injectés directement dans le tissu cible et puis électrique pulsés, qui rendre la procédure moins du travail - et temps - consommer. En outre, il est possible de transfectants plusieurs plasmides et RNA oligos simultanément avec l’électroporation unique.

Nous avons établi une démarche d’électroporation in vivo pour manipuler l’expression des gènes dans les neurones sensoriels de souris adultes et appliquée avec succès et validé cette approche dans nombreuses études pionnières^{1,2,3 ,8,10}. Nous présentons ici un protocole détaillé afin de faciliter l’utilisation de cette approche pour les études futures de la régénération axonale chez les mammifères.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément au protocole animal approuvé par le Comité de l’emploi et de Johns Hopkins Institutional Animal Care.

1. matériels et réactifs

1. Animaux
   1. Utilisez la souris CF1 femelles âgés de six semaines, pesant 30 à 35 g pour les expériences.
      Remarque : Les souris ont été logés en groupe (5 souris par cage) dans des cages stérilisés individuellement ventilés avec 1/4" corn cob literie et 2" carrées nidification pour la nidification. Les cages ont été maintenus dans un cycle lumière-obscurité de 12 h à l’adresse contrôlé et la température de la pièce était entre 19,4 ° C et 25 ° C. Les souris ont été nourries avec globale alimentation rongeur et fournissant le système automatique de l’eau.
2. Instruments de
   1. Utiliser les instruments chirurgicaux suivants pour procéder efficacement à la chirurgie : fourrure de seringues jetables (27 G, 1,0 mL) pour injection intrapéritonéale, tondeuse, microscope stéréo dissection, pinces de microchirurgie, microchirurgie ciseaux et pinces-gouges petit os et stérilisés éponges non tissé.
      NOTE : Tous les instruments et les matériaux sont stérilisés à l’autoclave avant la chirurgie ou préalablement stérilisé par les producteurs. Pendant la chirurgie, les instruments sont pulvérisés avec de l’alcool de 75 % de maintenir la stérilisation.
3. Solutions anesthésiques
   1. Utiliser la solution anesthésique #1 pour induire l’anesthésie et utiliser la solution #2 de l’anesthésie avant l’injection de DRG pour maintenir l’anesthésie.
      1. Pour rendre la solution anesthésique #1, diluer la kétamine et xylazine dans du sérum physiologique stérile à une concentration finale de 10 mg/mL et 1,2 mg/mL.
      2. Pour rendre la solution anesthésique #2, diluer avertin dans du sérum physiologique stérile à une concentration finale de 20 mg/mL.
4. L’ADN plasmidique et ARN Oligos
   1. Préparer les plasmides à l’aide de la trousse commerciale suivant les protocoles du fabricant en conséquence. Diluer le plasmide DNAs dans l’eau désionisée stérile à la concentration de 2,0 µg/µL.
   2. Ajouter la solution de colorant vert rapide pour atteindre une concentration finale de 0,005 à 0.01 % (v/v) pour une meilleure visualisation de l’esquisse de la DRG pendant l’injection.
   3. Dissoudre les oligos siARN ou miARN dans les tampons correspondants fournis par les fabricants pour atteindre une concentration finale à 50 µM.
5. Pipette de micro-injection
   1. Tirer le verre capillaire en utilisant les micropipettes et couper l’extrémité de la pipette de verre capillaire extraite avec des ciseaux de microchirurgie à générer une ouverture avec un diamètre extérieur approximatif de 50 µm. Puis stériliser la pipette de verre sous la lumière UV sur un banc propre pendant 20 à 30 min environ.
   2. Mont la pipette de verre stérilisé sur le titulaire de la pipette reliée à une microinjection intracellulaire Pipeter système. Définissez les paramètres du système microinjection à 30 lb/po2 de pression et 8 ms de durée.
6. Système d’électroporation
   1. Connecter les électrodes au système électroporation onde carrée et définir les paramètres suivants : ms 15 impulsions à 35 V avec intervalles de 950 ms pour in vivo électroporation.
7. La perfusion et la Solution de fixation
   1. Dissoudre la poudre de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x à une concentration de 4 % (p/v). Stocker la solution de la PFA à 4 ° C.

2. experimental procédures

1. Exposition chirurgicale de la L4 et L5 DRGs
   1. Anesthésier la souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de la solution anesthésique #1 préparé auparavant (avec la kétamine 100 mg/kg de poids corporel et de xylazine 12 mg/kg de poids corporel).
   2. Raser la zone chirurgicale avec la tondeuse de la fourrure.
      Remarque : Puisqu’il y aura une autre chirurgie pour l’écrasement du nerf sciatique gauche, la fourrure de la cuisse postérieure gauche peut être rasée en même temps.
   3. Placez votre souris sur la couverture chauffée (35,0 ° C) et de surveiller la température rectale avec une sonde de température.
   4. Pour tester l’anesthésie, pincez les orteils et la queue de la souris et observer les réponses comportementales.
   5. Bande des quatre membres de la souris sur le tableau des visages.
   6. Essuyer la zone chirurgicale avec solution iodophore, puis à 75 % d’alcool pour enlever l’iodophore avant de couper la peau.
   7. Appliquer pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
   8. Avant l’incision, marque les deux côtés de la ligne de crête iliaque avec un marqueur de fin. Tracer une ligne reliant deux points de crêtes iliaques pour faciliter l’identification des positions des GHM L5.
   9. Faire une incision de 3 cm le long de la ligne médiane du bas du dos avec des micro-ciseaux. En outre, détacher les muscles paraspinous, tels que le multifidus musculus et le musculus longissimus lumborum, de la L3 à S1 apophyses épineuses et exposer les articulations facettaires de 5-L4 et L5-6.
   10. Utiliser un micro-rongeur pour enlever les joints de facette du 5-L4 et L5-6. En outre, supprimer l’arc neural gauche de L4 et L5 pour exposer la face dorsale de la DRG.
2. Injection de DRG
   1. Injecter la solution anesthésique #2 (avec avertin 200 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale pour maintenir l’anesthésie avant l’injection de DRG.
   2. Charger les plasmides d’ADN ou RNA oligos (1 µL par DRG) dans la pipette capillaire de verre.
   3. Insérez l’extrémité de la pipette de verre capillaire soigneusement dans le PMSI.
   4. Injecter progressivement 1,0 µL de solution de plasmides d’ADN ou RNA oligos dans le PMSI en utilisant la microinjection intracellulaire administrer des systèmes (30 psi, 8 ms).
      Remarque : La durée de l’injection devrait durer pas moins de 5 minutes.
3. Électroporation
   1. Laisser tomber des PBS sur les bouts des électrodes.
   2. Nettoyer le saignement avec de la gaze de coton carré stérilisé.
   3. Pincez la cible DRG avec les électrodes doucement et appliquer 5 impulsions carrées électriques avec le système d’électroporation.
   4. Fermer les couches de muscle et de peau respectivement avec les sutures de nylon de 5-0.
   5. Placez votre souris sur une couverture chauffée (35,0 ° C) sous une grande attention jusqu'à ce qu’il a complètement repris conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Retourner la souris à la cage après qu’il a pleinement récupéré de l’anesthésie.
      Remarque : Il faut environ 60 min pour la souris complètement récupérer de l’anesthésie sur la couverture de 37 ° C. Faites dissoudre un ibuprofène comprimé (200 mg) dans 1 000 ml d’eau (0,2 mg/ml) destinés à l’alimentation quotidienne pour soulager la douleur postopératoire.
4. Écrasement du nerf sciatique
   1. Deux ou trois jours (selon le protocole expérimental) après l’électroporation DRG, anesthésier la souris par voie intrapéritonéale avec solution anesthésique #2 (avec avertin 400 mg/kg de poids corporel).
   2. Bande des quatre membres de la souris sur le tableau des visages.
   3. Faire une incision de 1 cm 0,5 cm vers la gauche le long de la ligne médiane. Couper les muscles, tels que le muscle grand fessier et le muscle piriforme, longitudinalement. Exposer le segment du nerf sciatique entre le plus grand foramen sciatique et l’entaille sciatique.
   4. Écrasement du nerf avec une pince de microchirurgie pour 12 s et marque le site de l’écrasement par une suture d’epineural en nylon 10-0. Faire un noeud sur la membrane durale pour marquer le site de l’écrasement.
   5. Fermer les couches de muscle et de peau avec suture de nylon de 5-0.
   6. Placez votre souris sur une couverture chauffée (35,0 ° C) avec une grande attention jusqu'à ce qu’il a complètement repris conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal. Retourner la souris à la cage après qu’il a pleinement récupéré de l’anesthésie.
      Remarque : Il faut environ 60 min pour la souris complètement récupérer de l’anesthésie sur la couverture de 37 ° C. Faites dissoudre un ibuprofène comprimé (200 mg) dans 1 000 ml d’eau (0,2 mg/ml) destinés à l’alimentation quotidienne pour soulager la douleur postopératoire.
5. Perfusion de souris, PMSI et récolte de nerf sciatique
   1. Deux ou trois jours après l’écrasement du nerf sciatique (selon le protocole expérimental), anesthésier la souris par voie intrapéritonéale avec solution anesthésique #2.
   2. Perfuse la transcardially souris avec du PBS (pH 7,4), suivie de paraformaldéhyde glacée de 4 % (PFA) (pH 7.5) dans du PBS.
   3. Après la perfusion, séparez les DRGs ainsi que les racines nerveuses et le nerf sciatique avant le genou avec soin par micro-ciseaux et micro-forceps sous le microscope à dissection. Placez le nerf sciatique directement chez 4 % PFA pour la nuit à 4 ° C.
6. Imagerie et en mesurant les axones sensoriels marqués par Fluorescence
   1. Dénudez la gencive attachée et la membrane sur le nerf sciatique fixe avec micro-ciseaux et pinces-micro soigneusement sous le microscope à dissection. Puis, échanger les 4 % PFA avec PBS et laver le nerf trois fois.
   2. Déposer le nerf sciatique sur une lame et continuez tout droit. Ajouter 80 µL de solution antifade autour du nerf, puis poser une lamelle sur elle. Aplatir le tissu tout monté avec pression.
   3. Placer les tissus de niveler le microscope inversé epifluorescent équipé d’un accessoire pour l’acquisition de mosaïque et de traitement d’image.
      Remarque : Les longueurs d’excitation et d’émission sont 488 nm et 509 nm. Il est également possible de prendre plusieurs images qui se chevauchent manuellement et relier les images avec ImageJ avec la plug-in de mosaïque.
   4. Lorsque vous mesurez la longueur des axones régénérés, trace identifiables tous marqués au fluorescently des axones dans le nerf sciatique depuis le site d’écrasement (marqué par la suture epineural de 10-0) à l’extrémité de l’axone distal.

Résultats

Pour quantifier la cytotoxicité du protocole actuel et de valider que la transfection in vivo DRG électroporation est assez élevée, nous avons injecté et électroporation fluorescent-étiquetées micro-ARN ou siARN dans L4 et L5 DRGs. Les DRGs détachés ont été traitées par cryo-sectionnement et immunohistochimie (Figure 1A-B). Lors de l’estimation du taux de survie de cellule après l’injection et l’électroporation, ...

Discussion

Plusieurs étapes chirurgicales nécessitent une attention particulière. Le L4 et L5 DRGs (emplacement de somas), qui dominent le nerf sciatique, doivent être correctement identifiés et une injection de gènes chimères. Dans le cas contraire, la GFP-étiquetage seront absent dans les axones du nerf sciatique. Les crêtes iliaques peuvent considérer comme des repères anatomiques utiles pour déterminer des L4 et L5 DRGs. Dans la plupart des souris, la facette conjointe entre les vertèbres L5 et L6 est proche de cel...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief