Investigação regeneração do axônio mamíferos: In Vivo Electroporation do gânglio de raiz Dorsal do rato adulto

Resumo

Eletroporação é uma abordagem eficaz para entregar genes de interesse em células. Aplicando-se esta abordagem na vivo sobre os neurônios do gânglio de raiz dorsal do rato adulto (DRG), descrevemos um modelo para estudo de regeneração do axônio em vivo.

Resumo

Eletroporação é uma abordagem de transfecção do gene não-virais essenciais para introduzir DNA plasmídeos ou pequenas moléculas de RNA em células. Um neurônio sensorial no gânglio da raiz dorsal (DRGs) estende-se a um único axônio com dois ramos. Um ramo vai para o periférico nervo (ramo periférico) e o outro ramo entra a medula espinhal através da raiz dorsal (agência central). Após a lesão neural, o ramo periférico regenera robustamente Considerando que a agência central não se regenera. Devido a alta capacidade regenerativa, regeneração do axônio sensorial foi amplamente utilizada como um sistema modelo para estudar a regeneração do axônio mamíferos no sistema nervoso periférico (SNP) e sistema nervoso central (SNC). Aqui, descrevemos um protocolo de abordagem estabelecida anteriormente para manipular a expressão gênica em neurônios sensoriais maduros na vivo via eletroporação. Baseado na transfecção com plasmídeos ou pequeno RNA oligos (siRNAs ou microRNAs), a abordagem permite ambas as experiências de perda e ganho-de-função estudar os papéis de genes de interesse ou microRNAs no Regulamento do axônio regeneração em vivo. Além disso, a manipulação do gene expressão na vivo pode ser controlada tanto espacial e temporalmente dentro de um curso de tempo relativamente curto. Este modelo sistema fornece uma única ferramenta para investigar o mecanismo molecular pelo qual a regeneração do axônio mamíferos é regulamentado na vivo.

Introdução

Lesões no sistema nervoso causaram por trauma neural ou várias doenças neurodegenerativas geralmente resultam em defeitos nas funções motoras, sensoriais e cognitivas. Recentemente, muito esforço tem sido dedicado para restabelecimento de potência regenerativa nos neurônios adultos para restaurar o functionsof fisiológicas ferido neurônios^1,2,3. Neurônios sensoriais em DRG são um aglomerado de células nervosas que transmitem diferentes estímulos sensoriais, tais como dor, temperatura, toque ou postura do corpo, para o cérebro. Cada um desses neurônios é pseudo unipolar e contém um único axônio que se bifurca com um ramo, estendendo-se em direção a periferia e o outro ramo indo em direção a medula espinhal⁴. Os neurônios sensoriais adultos DRGs estão entre alguns neurônios de mamíferos maduros conhecidos para regenerar seus axônios ativamente após lesão. Daí, lesões de axônios sensoriais têm sido empregadas extensivamente como um modelo fundamental para estudar os mecanismos de regeneração axonal em vivo.

Na vivo técnicas transfeccao de gene, que são geralmente menos demorado para configurar e mais flexível do que usando animais transgénicos, jogar papéis essenciais em estudar as funções dos genes e sinalização de caminhos no sistema nervoso. As principais técnicas podem ser classificadas em duas abordagens: instrumento-vírus baseados e⁵. Viral-baseado na vivo entrega gene nos neurônios adultos pode fornecer precisa spatiotemporal manipulação do gene expressão⁶. No entanto, processos de trabalho intensivos estão envolvidos em métodos baseados em viral, tais como a produção e purificação de partículas virais, contendo o gene desejado. Além disso, muitos vetores virais poderiam ativar o sistema imunológico do hospedeiro, que pode interferir com a aquisição de dados, análise de dados e possivelmente induzir em erro a interpretação dos resultados experimentais. Eletroporação, uma abordagem típica do transfection baseado no instrumento, utiliza um pulso elétrico para aumentar a permeabilidade da célula e as membranas nucleares, transitoriamente, o que favorece o afluxo de vetores de gene ou pequeno RNA oligos do espaço fora das células⁷ . Em vitro eletroporação é amplamente reconhecida como uma estratégia transitória, mas altamente eficiente para manipular a expressão de genes alvo em muitos tipos de células. Embora na vivo electroporation leva apenas a expressão do gene transiente com baixa eficiência transfecting comparada com vetores virais, tem várias vantagens sobre abordagens virais. Por exemplo, pode ser aplicado a quase todos os tecidos e células de^7,8,9. Além disso, qualquer codificação de genes de interesse ou pequenos oligos RNA (por exemplo, siRNAs, microRNAs) contra certas transcrições de plasmídeos podem ser injetados diretamente no tecido alvo e então eletricamente pulsados, que tornar o processo menos trabalho - e tempo - consumindo. Além disso, transfecting múltiplos plasmídeos e RNA oligos simultaneamente com eletroporação único é possível.

Nós temos estabelecido uma abordagem electroporation in vivo , para manipular a expressão gênica em neurônios sensoriais do rato adulto e aplicado com sucesso e validado tal abordagem em numerosos estudos pioneiros^{1,2,3 ,8,10}. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para facilitar o uso desta abordagem para futuros estudos de regeneração do axônio dos mamíferos.

Protocolo

Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com o protocolo animal aprovado pelo Comitê de uso e Johns Hopkins institucional Cuidado Animal.

1. materiais e reagentes

1. Animais
   1. Use ratos CF1 fêmeas seis semanas de idade, pesando 30 – 35 g para os experimentos.
      Nota: Os ratos foram alojados em grupo (5 ratos por gaiola) em gaiolas esterilizados individualmente ventilados com 1/4" milho espiga da cama e 2" quadrado nestlets para o assentamento. As gaiolas foram mantidas em um ciclo controlado de claro-escuro de 12-h e a temperatura foi entre 19,4 ° C e 25 ° C. Os ratos foram alimentados com dieta de roedor global e sistema de fornecimento de água automática.
2. Instrumentos
   1. Use os seguintes instrumentos cirúrgicos para realizar eficientemente a cirurgia: pele de seringas descartáveis (27 G, 1,0 mL) por injeção intraperitoneal, tosquiadeira, microscópio estéreo dissecação, microcirurgia pinça, tesoura microcirurgia e pequeno osso ruginas e esterilizadas não tecida esponjas.
      Nota: Todos os instrumentos e os materiais são autoclavados antes da cirurgia ou pré-esterilizados pelos produtores. Durante a cirurgia, os instrumentos são pulverizados com 75% de álcool para manter a esterilização.
3. Soluções anestésicas
   1. Use solução anestésica #1 para induzir a anestesia e usar anestesia solução #2 antes da injeção de DRG para manter a anestesia.
      1. Para tornar a solução anestésica #1, diluir ketamina e xilazina em solução salina estéril em uma concentração final de 10 mg/mL e 1,2 mg/mL.
      2. Para tornar a solução anestésica #2, dilua avertin em solução salina estéril em uma concentração final de 20 mg/mL.
4. Plasmídeo de DNA e RNA Oligos
   1. Prepare os plasmideos utilizando o kit comercial, seguindo o protocolo do fabricante, em conformidade. Dilua o plasmídeo DNAs em água desionizada estéril na concentração de 2,0 µ g / µ l.
   2. Adicionar a solução de corante Fast Green para atingir uma concentração final de 0,005-0,01% (v/v) para melhor visualização do contorno DRG durante a injeção.
   3. Dissolva os oligos siRNA ou microRNA nos correspondentes buffers fornecidos pelos fabricantes para atingir uma concentração final de 50 µM.
5. Injeção de micro pipeta
   1. Puxe o vidro capilar usando o extrator micropipeta e corte a ponta da pipeta vidro capilar puxada com uma tesoura de microcirurgia para gerar uma abertura com um diâmetro externo aproximado de 50 µm. Em seguida esterilize a pipeta de vidro sob luz UV sobre uma bancada limpa por 20-30 min aproximadamente.
   2. Monte a pipeta de vidro esterilizado no suporte da pipeta conectada a uma microinjeção intracelular dispensar o sistema. Defina os parâmetros do sistema de microinjeção a 30 psi de pressão e 8 ms de duração.
6. Electroporation sistema
   1. Conectar os eletrodos ao sistema de eletroporação de onda quadrada e definir os seguintes parâmetros: pulsos de 15 ms em 35 V com intervalos de ms 950 para eletroporação na vivo .
7. Perfusão e solução de fixação
   1. Dissolva o pó de paraformaldeído (PFA) em PBS 1x em uma concentração de 4% (p/v). Armazenar a solução PFA em 4 ° C.

2. experimentais procedimentos

1. Exposição cirúrgica da L4 e L5 DRGs
   1. Anestesia o mouse usando uma injeção intraperitoneal de solução anestésica #1 preparado anteriormente (com cetamina 100mg/kg de peso corporal e xilazina 12 mg/kg de peso corporal).
   2. Raspe a área cirúrgica com o aparador de pelos.
      Nota: Uma vez que haverá outra cirurgia para o esmagamento de esquerda nervo ciático, a pele da região posterior da coxa esquerda pode ser raspada simultaneamente.
   3. Coloque o mouse sobre o cobertor aquecido (35,0 ° C) e monitorar a temperatura retal com uma sonda de temperatura.
   4. Para testar a anestesia, apertar os dedos do pé e cauda de rato e observar as respostas comportamentais.
   5. Tape os quatro membros do mouse sobre o quadro de avisos.
   6. Limpe a área cirúrgica com solução Iodofor e, em seguida, com 75% de álcool para remover o Iodofor antes de cortar a pele.
   7. Aplica a pomada oftálmica nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.
   8. Antes da incisão, marque ambos os lados das cristas ilíacas com uma caneta fina. Desenha uma linha conectando dois pontos das cristas ilíacas, a fim de facilitar a identificar as posições dos DRGs L5.
   9. Faça uma incisão de 3 cm ao longo da linha mediana da região lombar com microtesoura. Além disso, desanexar musculatura paraespinhal, tais como o multifidus musculus e o musculus longissimus lombar, do L3 para processos espinhosos de S1 e expor as articulações faceta de L4-5 e L5-6.
   10. Use um micro-rongeur para remover as articulações faceta de L4-5 e L5-6. Além disso, remova o arco neural esquerdo de L4 e L5 para expor o lado dorsal os DRGs.
2. Injeção de DRG
   1. Injetar a solução anestésica #2 (com avertin 200 mg/kg de peso corporal) intraperitonealmente para manter a anestesia antes da injeção de DRG.
   2. Carrega o plasmídeo de DNA ou RNA oligos (1 µ l por DRG) dentro da pipeta capilar de vidro.
   3. Insira a ponta da pipeta capilar de vidro cuidadosamente no RDG.
   4. Gradualmente, injetar 1,0 solução µ l de plasmídeos de DNA ou RNA oligos em DRG usando a microinjeção intracelular dispensar sistemas (30 psi, 8 ms).
      Nota: A duração da injeção deve durar nada menos do que 5 minutos.
3. Electroporation
   1. Largue o PBS nas pontas dos eletrodos.
   2. Limpe o sangramento com gaze de algodão esterilizado de quadrados.
   3. Beliscar o alvo DRG com os eléctrodos suavemente e aplicar 5 pulsos quadrado elétricos com o sistema de eletroporação.
   4. Feche as camadas de músculo e pele respectivamente com suturas de nylon 5-0.
   5. Coloque o mouse sobre um cobertor aquecido (35,0 ° C) sob muita atenção até que completamente recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Retorne o rato da gaiola em casa depois que recuperou totalmente da anestesia.
      Nota: Demora cerca de 60 min para o mouse para se recuperar completamente da anestesia do cobertor de 37 ° C. Dissolva um ibuprofeno comprimido (200 mg) em 1.000 ml de água (0,2 mg/ml) para a alimentação diária para aliviar a dor pós-cirúrgica.
4. Esmagamento do nervo ciático
   1. Dois ou três dias (dependendo do projeto experimental) após o electroporation DRG, anestesia o mouse intraperitonealmente com solução anestésica #2 (com avertin 400 mg/kg de peso corporal).
   2. Tape os quatro membros do mouse sobre o quadro de avisos.
   3. Faça uma incisão de 1 cm 0,5 cm para o lado esquerdo ao longo da linha mediana. Os músculos, como o músculo glúteo máximo e piriforme, cortado longitudinalmente. Expor o segmento do nervo ciático entre o forame isquiático maior e o entalhe sciatic.
   4. Esmagamento do nervo com fórceps de microcirurgia para 12 s e marca o local da queda com uma sutura de epineural nylon 10-0. Faça um nó na membrana dural para marcar o local da queda.
   5. Feche as camadas de músculo e pele com sutura de nylon 5-0.
   6. Coloque o mouse sobre um cobertor aquecido (35,0 ° C) com muita atenção até que completamente recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Retorne o rato da gaiola em casa depois que recuperou totalmente da anestesia.
      Nota: Demora cerca de 60 min para o mouse para se recuperar completamente da anestesia do cobertor de 37 ° C. Dissolva um ibuprofeno comprimido (200 mg) em 1.000 ml de água (0,2 mg/ml) para a alimentação diária para aliviar a dor pós-cirúrgica.
5. Perfusão de mouse, DRG e colheita de nervo ciático
   1. Dois ou três dias após o esmagamento do nervo ciático (dependendo do design experimental), anestesiar o mouse intraperitonealmente com solução anestésica #2.
   2. Perfundir o rato transcardially com PBS (pH 7,4) seguido por gelada paraformaldeído 4% (PFA) (pH 7,5) em PBS.
   3. Após a perfusão, separe cuidadosamente os DRGs juntamente com as raízes nervosas e nervo ciático antes do joelho com microtesoura e pinça-micro sob o microscópio de dissecação. Coloque o nervo ciático diretamente em 4% PFA overnight a 4 ° C.
6. Imaging e medindo os axônios sensoriais fluorescência-etiquetada
   1. Tire o tecido anexado e membrana no nervo ciático fixo com micro tesouras e micropinça cuidadosamente sob o microscópio de dissecação. Em seguida, trocar o 4% PFA com PBS e lavar o nervo três vezes.
   2. Coloque o nervo ciático em um slide e mantê-lo reto. Adicione 80 µ l de solução antidesgaste em torno do nervo e, em seguida, deitar uma lamela nela. Achate o tecido todo montado com pressão.
   3. Coloque os tecidos de flattened sobre o microscópio invertido epifluorescent, equipado com um acessório para o mosaico de aquisição e processamento de imagem.
      Nota: Os comprimentos de excitação e emissão são 488 nm e 509 nm. Também é possível tomar várias imagens sobrepostas manualmente e costurar as imagens juntos usando o ImageJ com o plug-in de mosaico.
   4. Quando se mede o comprimento dos axônios regenerados, rastrear todos os identifiable fluorescently-rotulado axônios no nervo ciático do local da queda (marcado com a sutura epineural de 10-0) para as extremidades do axônio distal.

Resultados

Para quantificar a citotoxicidade do protocolo atual e para validar que a taxa de transfecção de na vivo DRG eletroporação é alta o suficiente, nós injetamos e electroporated marcadas fluorescentemente microRNA ou siRNA em L4 e L5 DRGs. Os DRGs desanexados foram processados através de cryo-seccionamento e imuno-histoquímica (Figura 1A-B). Ao estimar a taxa de sobrevivência de células após a injeção e eletroporação, os ...

Discussão

Várias etapas cirúrgicas requerem especial atenção. A L4 e L5 DRGs (localização de somas), que dominam o nervo ciático, precisam ser corretamente identificado e injetado com construções de gene. Caso contrário, o GFP-rotulagem estarão ausente em axônios do nervo ciático. As cristas ilíacas podem ser vistas como útil pontos anatômicos para localizar a L4 e L5 DRGs. Na maioria dos ratos, o aspecto comum entre as vértebras L5 e L6 é próxima de cristas ilíacas¹². Alternativamente, ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECM 830 Square wave electroporation system	BTX Harvard Apparatus	45-0052	For in vivo electroporation
Tweezertrodes electrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	For in vivo electroporation, 1 mm flat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Intracellular Microinjection Dispense Systems
Glass Capillary Puller	NARISHIGE	PC-10
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	1902328
Stereo Dissection Microscope	Leica	M80
Microsurgery Rongeur	F.S.T	16221-14
Microsurgery Forceps	FST by DUMONT, Switzerland	11255-20	Only for sciatic nerve crush
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, standard wall
Tape	Fisherbrand	15-901-30	For fixing the mouse on the corkboard
2, 2, 2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin stock solution
2-methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin stock solution
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	Non-target siRNA with fluorescence
microRNA Mimic Transfection Control with Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	Non-target microRNA with fluorescence
Plasmids preparation kit	Invitrogen Purelink	K210016	GFP-coding plasmid preparation
Fast Green Dye	Millipore-Sigma	F7252	For better visualization of the DRG outline during injection
Ketamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Anesthesia induction
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Anesthesia induction
Acetaminophen	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Post-surgical pain relief