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Resumen

Aquí presentamos un protocolo de secuenciación de próxima generación para la secuenciación de rRNA 16S que permite la identificación y caracterización de comunidades microbianas en vectores. Este método implica la extracción de ADN, amplificación y código de barras de muestras mediante PCR, secuenciación en una celda de flujo y bioinformática para que coincida con los datos de la secuencia a la información filogenética.

Resumen

En décadas recientes, enfermedades transmitidas por vectores han resurgido y ampliado en alarmantes índices, causando considerables morbosidad y mortalidad en todo el mundo. Carecen de vacunas eficaces y ampliamente disponibles para la mayoría de estas enfermedades, haciendo necesario el desarrollo de estrategias de mitigación de la enfermedad de nuevo. Para ello, una prometedora vía de control de enfermedades implica orientación el microbioma del vector, la comunidad de microbios que habitan en el vector. El microbioma vector desempeña un papel fundamental en la dinámica de patógeno, y las manipulaciones de la microbioma han llevado vector reducido abundancia o patógeno de transmisión por un puñado de enfermedades transmitidas por vectores. Sin embargo, traducir estos resultados en aplicaciones de control de la enfermedad requiere un conocimiento profundo de la ecología microbiana del vector, históricamente limitada por la escasa tecnología en este campo. El advenimiento de métodos de secuenciación de última generación ha permitido la secuenciación rápida, altamente paralela de diversas comunidades microbianas. Dirigidas a gene del rRNA 16S altamente conservadas ha facilitado las caracterizaciones de los microbios presentes en vectores bajo diferentes condiciones ecológicas y experimentales. Esta técnica consiste en la amplificación del gen 16S rRNA, muestra de código de barras mediante PCR, las muestras de la carga en una celda de flujo para la secuencia, y bioinformática se acerca para que coincida con los datos de la secuencia con información filogenética. Especie o género nivel identificación de un número elevado de repeticiones se logra normalmente a través de este enfoque, así evitar problemas de baja detección, resolución y salida de cultivo tradicional, microscopía y tinciones histológicas técnicas. Por lo tanto, este método es adecuado para la caracterización de vectores de microbios en condiciones diversas pero actualmente no puede proporcionar información sobre la función microbiana, ubicación dentro del vector, o respuesta al tratamiento antibiótico. En general, secuenciación de próxima generación de 16S es una técnica poderosa para la mejor comprensión de la identidad y el papel de los microbios del vector en la dinámica de la enfermedad.

Introducción

El resurgimiento y propagación de enfermedades transmitidas por vectores en las últimas décadas plantean una grave amenaza para la salud humano y fauna mundial. Carecen de vacunas efectivas para la mayoría de estas enfermedades, y control de esfuerzos se ven obstaculizados por la naturaleza biológica compleja de interacciones host vector y vectores. Entender el papel de las interacciones microbianas dentro de un vector en la transmisión del patógeno puede permitir el desarrollo de estrategias novedosas que sortear estos desafíos. En particular, las interacciones entre vector asociado microbios comensales, simbiontes y patógeno, conocido como el microbioma, pueden tener consecuencias importantes para la transmisión de patógeno. Abrumadora evidencia ahora apoya esta afirmación con ejemplos que demuestran un vínculo entre el microbioma del vector y la competencia para enfermedades como la malaria, Zika virus y la enfermedad de Lyme1,2,3. Sin embargo, traducir estos resultados en las estrategias de control de enfermedades requiere un conocimiento mucho más detallado de la estructura, función y origen del vector microbiomes. Identificación y caracterización de la comunidad microbiana del vector bajo diferentes condiciones ecológicas y experimentales constituyen un importante camino a seguir en este campo.

Un procedimiento para la identificación de los habitantes microbianos de un vector del patógeno se facilita utilizando señal de negro-legged occidental, pacificus de Ixodes, una especie de vector del patógeno de la enfermedad de Lyme burgdorferi de Borrelia. Aunque las garrapatas albergan más tipos de patógenos humanos que cualquier otro artrópodo, relativamente poco se conoce sobre la biología y la comunidad ecología de garrapatas microbiomes4. Es evidente que las garrapatas albergan una gran variedad de virus, bacterias, hongos y protozoarios comensales, endosimbionte y residentes microbiana transitoria5,4. Trabajo previo ha demostrado fuertes variaciones de Ixodes microbiomes asociados a la geografía, especie, sexo, etapa de la vida y harina de sangre fuente6,7,8. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a esta variación sigue siendo desconocidos y garantizan que más detalladas investigaciones sobre el origen y el montaje de estas comunidades microbianas. Las garrapatas pueden adquirir microbios a través de la transmisión vertical, en contacto con hosts y captación del ambiente a través de los espiráculos, la boca y el poro anal9. Comprender los factores que forma la formación inicial y desarrollo de la garrapata microbioma, específicamente la contribución relativa de la transmisión vertical y medio ambiente, es importante para la comprensión de los patrones naturales y las variaciones de señal diversidad de microbioma y cómo estas comunidades interactúan durante la transmisión del patógeno, con posibles aplicaciones para el control de la enfermedad o del vector.

Técnicas moleculares de gran alcance, tales como secuenciación de próxima generación, ahora existen para la identificación de las comunidades microbianas y pueden emplearse para caracterizar microbiomes vector bajo diversas condiciones ambientales o experimentales. Antes de la llegada de estos métodos de secuenciación de alto rendimiento, la identificación de los microbios confiado predominante en microscopia y cultura. Mientras que la microscopía es una técnica fácil y rápida, métodos morfológicos para la identificación de microbios son inherentemente subjetivas y grueso y limitada por baja sensibilidad y detección10. Métodos basados en la cultura son ampliamente utilizados para la identificación microbiana y pueden utilizarse para determinar la susceptibilidad de los microbios a drogas tratamientos11. Sin embargo, este método también sufre de baja sensibilidad, como se ha estimado que menos del 2% de microbios ambientales pueden ser cultivado en un laboratorio de ajuste de12. Métodos de tinción histológicas también han sido empleados para detectar y localizar microbios específicos en vectores, permiten investigaciones de diversas distribuciones de taxones dentro de la garrapata y estudiar hipótesis sobre las interacciones microbianas. Sin embargo, previo conocimiento de la identidad microbiana se requiere para la selección de las manchas correspondientes, haciendo este enfoque resultan inadecuadas para la identificación y caracterización microbiana. Además, la coloración histológica es un proceso muy tiempo-intensivo, laborioso y no escala bien para tamaños de muestra grandes. Aproximaciones moleculares tradicionales como Sanger secuenciación se limitan semejantemente en su sensibilidad y la detección de diversas comunidades microbianas.

Secuenciación de próxima generación permite la rápida identificación de los microbios de un gran número de muestras. La presencia de genes marcadores estándar y bases de datos de referencia más permite mayor resolución taxonómica, a menudo al nivel de género o especie. Subunidad pequeña ribosomal RNAs se utilizan con frecuencia para lograr este objetivo, con 16S rRNA es el más común debido a la presencia de regiones conservadas y variables dentro del gen, lo que permite la creación de cebadores universales con amplicones único para cada bacteriano especies13,14. Este informe detalla un procedimiento para la identificación de taxa en el microbioma de la garrapata a través de rRNA 16S que ordena nueva generación. En particular, este protocolo hace hincapié en las etapas de preparación de muestras para la secuencia. Más generalizaron más detalles sobre la secuencia y pasos de Bioinformática se proporcionan, ya que hay una variedad de plataformas de secuenciación y los programas de análisis actualmente disponibles, cada uno con la extensa documentación existente. La viabilidad general de este enfoque de secuenciación de próxima generación se demuestra aplicando a una investigación de la Asamblea de la comunidad microbiana en un vector clave de la enfermedad.

Protocolo

1. recolección y esterilización superficial de la señal

  1. Recoger garrapatas arrastrando un paño de 1 m2 blanco por un hábitat asociados de garrapata, quitar garrapatas atado a especie, o cría de garrapatas en el laboratorio15,16. Usar pinzas finas para manipular las garrapatas y almacenarlas a-80 ° C.
  2. Coloque las garrapatas en los tubos PCR individuales y eliminar contaminantes de la superficie con un vórtex durante 15 s con 500 μL de peróxido de hidrógeno (H2O2), etanol al 70% y ddH2O.
  3. Poner las garrapatas en un nuevo tubo PCR y déjelos secar al aire.
  4. En este tubo, alterar mecánicamente los tejidos de la garrapata machacando las garrapatas con un mortero y una maja (utilizado en este estudio), con pequeñas perlas en una batidora de grano, o corte la señal aparte con un bisturí.

2. purificación de DNA

  1. Purificar el ADN de las señales individuales, siguiendo las instrucciones proporcionadas en un kit de extracción de ADN disponible en el mercado. Responsables para un volumen final de 100 μL.
    Nota: Consulte la figura 1 para un resumen de los pasos 2.2-2.8. Métodos de extracción alternativos incluyen extracción de fenol-cloroformo17,18, etanol precipitación19o la extracción con un quelante de material20,21.
  2. Confirman éxito purificación de DNA usando un fluorómetro o un espectrofotómetro. Para análisis de fluorescencia, utilice 10 μL de la plantilla de la DNA en un análisis de ADN de doble hebra μL 190. El rendimiento esperado es de 0.1-1.0 ng/μL22. Para espectrofotometría, use 1 μL de la plantilla de la DNA en una cuantificación de ácidos nucleicos. El ratio esperado de A260/280 es aproximadamente 1.823.
  3. Si no proceder inmediatamente a la amplificación, almacenar las muestras a-20 ° C.

3. 16S rRNA Gene amplificación

  1. Configurar el amplicon PCR en una reacción de 27,5 μL que contiene: 5 μL de cada cebador en 1 μM; 12.5 μL de la mezcla PCR disponible en el mercado; y 5 μL de ADN extraído de las señales individuales en una concentración de 5 ng/μL.
    Nota: Use los siguientes cebadores para la amplificación de la región hipervariable de V3-V4 del 16S rRNA gen13:
    5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3',
    5' - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3'
  2. Pasar los tubos a un termociclador programado para: una desnaturalización inicial a 95 ° C por 3 min; 25 ciclos de 1) 95 ° C por 30 s, 2) 57 ° C por 30 s, 3) 72 ° C por 30 s; una extensión final a 72 ° C por 5 min; y un asimiento final a 10 ° C.
  3. Una vez que se realiza la polimerización en cadena, visualizar el producto PCR por la carga de 4 a 6 μL muestra en un gel de agarosa al 1.5%. Buscar una banda en 460 bp para confirmar la amplificación.
    Nota: Producto de PCR Amplicon puede no ser visible en el gel si la concentración de la muestra es demasiado baja (< 10 ng). Presencia de dímeros de primer es común en las muestras de baja concentración. Si hay otras bandas no objetivo, ajustar la temperatura de recocido o disminuir el número de ciclos.
  4. Si no proceder inmediatamente a la purificación, almacenar las muestras a 4 ° C.

4. purificación de amplicones de 16S

  1. Usando un nuevo tubo PCR para cada muestra, combinar el producto PCR con ddH2O para obtener total 60 μL. Para muestras con bajas concentraciones de ADN, realizar amplicones PCR por triplicado para reducir el sesgo de la amplificación y las muestras de concentrado de la piscina.
  2. Llevar perlas paramagnéticas a temperatura ambiente y agitar bien antes de usar.
  3. Añadir 48 μL de perlas paramagnéticas a 60 μL de la muestra e incubar por 5 min lugar claro de los tubos en una parrilla magnética durante 5 minutos hasta que la solución se convierte. Eliminar el sobrenadante.
    Nota: Esta concentración de grano está dirigido a la eliminación de dímeros de primer (< 60 bp). Si es necesario, ajustar la concentración de grano para quitar otras bandas no específicos.
  4. Con tubos en la rejilla magnética, Añadir 500 μL de recién preparado 80% EtOH. Inmediatamente después de agregar el EtOH a todos los tubos, pipeta el líquido. No quite los granos. Repetir la adición de EtOH y el retiro una vez más.
  5. Secar las muestras para eliminar exceso EtOH dejando los tubos abiertos en la rejilla magnética durante 5 min., o hasta pequeñas grietas son visibles en los granos.
  6. Añadir 20 μL de tampón TE e incubar las muestras fuera del imán, a temperatura ambiente, durante 5-10 minutos.
  7. Coloque los tubos en el imán. Una vez se separan los granos y el líquido, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para obtener el producto PCR limpio.
  8. (Opcional) Visualizar el producto para confirmar purificación de amplicones exitosa por la carga de 4 a 6 μL muestra en un gel de 1,5%. La banda 460 de bp debe ser visible, y no debe ser dimero de cartilla.
  9. Si no, proceder inmediatamente a índice de polimerización en cadena, almacenar las muestras de 4 ° C.

5. código de barras y la purificación de la muestra

  1. Asignar combinaciones de cartilla única a cada muestra mediante la selección de primers ya sea adelante o atrás, o ambos, de un kit de índice de biblioteca disponibles en el mercado.
    Nota: Únicamente etiquetado muestras permite diferenciación después de la secuencia. Kits normalmente proporcionan suficientes bases para secuencia 96 384 muestras.
  2. Sujete las dos cartillas, o índices, a muestras mediante la realización de PCR en una reacción de 25 μL que contenía 2,5 μL de cada cebador (N7xx y S5xx), 12,5 μL de mezcla maestro de PCR disponible en el mercado, 5 μL de ddH2O y 2.5 μL de producto productos limpios.
  3. Mover los tubos en un termociclador programado para: una desnaturalización inicial a 95 ° C por 3 min; ciclos de 8-14 de 1) 95 ° C por 30 s, 2) 55 ° C por 30 s, 3) 72 ° C por 30 s; una extensión final a 72 ° C por 5 min; y un asimiento final a 10 ° C.
  4. Una vez que se realiza la polimerización en cadena, visualizar el producto PCR por la carga de 4 a 6 μL muestra en un gel de agarosa al 1.5%. Buscar una banda en 550 bp para confirmar la amplificación.
    Nota: Use los resultados de visualización para informar condiciones ciclo de PCR de índice. Baje la cuenta de ciclo de fijación no específica de mitigar o incrementar la cuenta de ciclo para obtener bandas visibles para cada muestra.
  5. Repita el procedimiento de limpieza en el paso 4. Para evitar la dilución durante la limpieza, realizar PCR de índice por duplicado y piscina el producto aquí.
  6. Si no proceder inmediatamente a la biblioteca cuantificación y normalización, almacenar las muestras a 4 ° C.

6. normalización y cuantificación de la biblioteca

  1. Calcular la concentración de cada producto purificado, con código de barras de paso 5.5 con un fluorómetro o espectrofotómetro (ver paso 2.2). Diluir las muestras en solución tampón TE para obtener concentraciones de aproximadamente 13:00.
    Nota: La cuantificación de la biblioteca es necesaria para alcanzar la muestra de concentración recomendado para la plataforma de secuenciación de carga. Cuantificación de la biblioteca se logra mediante qPCR, pero estimar la concentración de la muestra antes de qPCR ahorra tiempo y reactivos. La concentración de 13:00 se recomienda para maximizar la exactitud de la cuantificación de la biblioteca, ya que es la concentración media de los estándares de qPCR proporcionado en el kit de cuantificación24.
  2. Realizar qPCR en una reacción de 10 μL que contiene 6.0 μL de qPCR master mix (del kit de cuantificación de biblioteca), 2.0 μL de ddH2O y 2.0 μL de la muestra o estándar. Ejecute cada muestra y estándar por triplicado para mayor exactitud y precisión. Ejecutar cada muestra en tres o más niveles de dilución (por ej., 12:01, 1 pm y 22:00 para las concentraciones de partida estimadas) para cuantificación precisa.
    Nota: Toda la información sobre los primers suministrados y las normas varían basada en el kit de cuantificación utilizado y están disponible en la hoja de datos técnicos de productos. Consulte la Tabla de materiales para el kit de cuantificación utilizado en este estudio.
  3. Mover la placa de qPCR o tubos a un instrumento PCR en tiempo real programado para: una desnaturalización inicial de 95 ° C por 5 min; 35 ciclos de 1) 95 ° C para 30 s y 2) 60 ° C por 45 s; y a un paso de la disociación de 1) 95 ° C por 15 s, 2) 60 ° C durante 30 s y 3) 95 ° C por 15 s.
  4. Calcular el promedio a partir de concentración para cada muestra, usando los valores de cuantificación obtenidos de los resultados de qPCR y los niveles de dilución de la muestra utilizados.
    Nota: por ejemplo, una concentración promedio de 14:00 para una muestra diluida 1: 100.000 produce una concentración original de la partida de 200 nM. Si ninguno de los niveles de dilución de una muestra determinada cae dentro del intervalo de las curvas estándar, resultados de cuantificación no pueden ser exactas; en cuyo caso, ajustar los niveles de dilución y volver a realizar la qPCR.
  5. Diluir cada muestra de código de barras purificado, 4 nM en buffer TE, basado en las concentraciones promedio calculado en el paso 7.5.
    Nota: por ejemplo, para una concentración media de la muestra de 200 nM, diluir la muestra 1:50 en TE del almacenador intermediario para alcanzar una concentración de nM 4. La concentración de la muestra exacta variará según el secuencia sistema y reactivo kit usado. Consulte la guía de usuario del sistema de secuenciación para la concentración recomendada.
  6. Crear la biblioteca combinada agregando volúmenes iguales (típicamente 5-10 μL) de todas las bibliotecas individuales en un solo tubo.
    Nota: todas las muestras deben estar a una concentración de nM 4, añadir volúmenes iguales alcanza una concentración igual de todas las muestras en la biblioteca combinada.
  7. Repita los pasos 6.2-6.4 en la biblioteca combinada para confirmar la concentración nM 4.
  8. Calcular la concentración de biblioteca combinada y diluir o volver a constituir la biblioteca final, agrupada utilizando tampón Tris como sea necesario para lograr 4 nM.
  9. Si no proceder inmediatamente a la carga de la muestra, almacenar las muestras a-20 ° C. Realizar la secuenciación ejecutar poco después de la cuantificación para minimizar pérdidas o cambios en la concentración de ADN durante el almacenamiento.

7. Biblioteca desnaturalización y dilución y secuenciación ejecutar (realizar el mismo día)

  1. Desnaturalizar la biblioteca combinada de 4 nM de paso 6.9 con NaOH.
    Nota: Estos pasos de preparación de biblioteca final varían para cada sistema de secuenciación. Consulte la guía de usuario de sistema de secuenciación para protocolos más detallados y actualizados. Nuevos usuarios probablemente tendrá que ser entrenado en el uso de la plataforma de secuenciación o pueden enviar sus colecciones a un centro de secuenciación del núcleo.
  2. Diluir la biblioteca desnaturalizada a la concentración de carga deseada mediante el tampón suministrado en el kit de reactivos de secuenciación (Tabla de materiales).
    Nota: Las concentraciones de carga óptima varían según el sistema de secuenciación y por lo general van desde 1-250 pM25.
  3. Desnaturalizar y diluir el control de la secuencia.
    Nota: Agregar un control de secuencia corrige problemas de secuenciación derivados de las bibliotecas de baja diversidad. Desnaturalizar el control de la secuencia utilizando NaOH y diluir a la misma concentración como la biblioteca.
  4. Combinar la biblioteca y el control de la secuencia.
    Nota: La relación de control de la secuencia a biblioteca combinada dependerá de la diversidad de la biblioteca y el sistema de secuenciación, pero es típicamente 1:126.
  5. Cargar la biblioteca combinada y la mezcla de control de la secuencia a la celda de flujo de la secuencia.

8. Análisis de la secuencia del amplicón

  1. Evaluar el éxito global de la gestión al examinar las métricas de funcionamiento en el entorno informático de la nube correspondiente al sistema de secuenciación utilizado.
    Nota: Las métricas de funcionamiento, como número de secuencia de lecturas, variará basado en secuenciación kit plataforma y reactivo utilizado. Valores objetivo para los sistemas de secuenciación común se enumeran en la tabla 1.
  2. Descargar los datos de secuencia cruda y bioinformática deseado software de código abierto, penetraciones cuantitativas en ecología microbiana (QIIME)27 o28de Mothur.
    Nota: Tanto QIIME y Mothur son código abierto y gratis descargar. Instrucciones detalladas sobre el uso de estos programas pueden encontrarse en línea y son lo suficientemente detalladas para los usuarios de primera vez. Los pasos siguientes proporcionan una visión amplia de una tubería de Bioinformática en QIIME. Familiaridad con el python no es necesario pero será facilitar la aplicación de las siguientes secuencias de comandos
  3. Crear y validar el archivo de mapeo usando el script "validate_mapping_file.py" en QIIME.
    Nota: El archivo de asignación contiene todos los metadatos necesarios para llevar a cabo análisis de datos, como ID de muestra, secuencias de la cartilla de productos y descripción de la muestra. El paso de validación comprueba que se han introducido todos los datos necesarios en el formato adecuado.
  4. Demultiplexar y filtrar secuencias usando el script "split_libraries.py" (figura 1).
    Nota: Esta secuencia de comandos asigna Lee código de barras para las muestras basadas en las combinaciones de primer índice y muestra identificadores de entrada en el archivo de asignación. También realiza varios calidad filtrado medidas para control de error basado en definido por el usuario cortes de calidad mínima puntuación, longitudes de secuencia y ajuste del extremo de la secuencia.
  5. Asignar unidades taxonómicas operacionales (OTUs) a las secuencias usando el script "pick_open_references_otus.py".
    Nota: En este paso, las secuencias se agrupan contra una colección de la secuencia de referencia basada en un umbral de identidad (por lo general 97%). Lecturas que no coincidan con la colección de la secuencia de referencia se agrupan uno contra el otro. De novo y referencia cerrado OTU selección opciones también están disponibles, pero cosecha referencia es recomendado por los desarrolladores QIIME.
  6. Normalizar la tabla OTU usando el script "alpha_rarefaction.py" o "normalize_table.py".
    Nota: Este paso corrige para la variación en las sumas de la columna, o secuencia total Lee por muestra, que se derivan tecnologías de secuenciación moderno. Normalización puede realizarse utilizando vacuo tradicional, o a través de métodos alternativos como la escala de la suma acumulativa.
  7. Realizar varios diversidad alfa, diversidad beta y análisis de la diversidad de composición taxonómica a la vez usando el script "core_diversity_analysis.py".
    Nota: Como alternativa, estos análisis pueden ejecutar por separado usando los scripts individuales (por ejemplo, "alpha_diversity.py").

Resultados

Un total de 42 garrapatas de huevo separadas tres garras y dos periodos de exposición ambiental, 0 y 2 semanas en el suelo, se procesaron para la secuencia del microbioma. Cada grupo de tratamiento, considerado como una sola vez el embrague y exposición, figura 6-8 muestras de garrapata de replicar. Estos extractos de garrapatas procesados fueron cargados en un secuenciador de última generación y rendido 12,885,713 Lee extremo apareado pasando el filtro. En esta prueba se incluyeron 3...

Discusión

Generación de secuenciación del 16S rRNA ha convertido en un enfoque estándar para la identificación microbiológica y permitió el estudio de cómo microbiomes vector afectan la transmisión de patógeno. El protocolo descrito aquí detalla el uso de este método para investigar la Asamblea de la comunidad microbiana en I. pacificus, una especie de vector para la enfermedad de Lyme; sin embargo, fácilmente puede ser aplicado para el estudio de otras especies de garrapatas o especies de artrópodos vectores...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por National Science Foundation otorga a A.S. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
ItemName of Material/EquipmentCompanyCatalog #
1DNeasy Blood & Tissue KitQiagen69504
2Qubit 4 FluorometerThermoFisher ScientificQ3326
3NanoDrop 8000 SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-8000-GL
42x KAPA HiFi HotStart ReadyMixKapa BiosystemsKK2501
5AMPure XP beadsAgen CourtA63880 
6Magnetic RackThermoFisher ScientificMR02
6TE bufferTeknovaT0223
7Nextera Index KitIlluminaFC-121-1011
8KAPA Library Quantification KitRocheKK4824
9MiSeq SystemIlluminaSY-410-1003
10MiSeq Reagent Kit v3 IlluminaMS-102-3001
1110 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20TeknovaT7724

Referencias

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