Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

Resumo

Aqui nós apresentamos um protocolo de sequenciamento de próxima geração para sequenciação de rRNA 16S, que permite a identificação e caracterização das comunidades microbianas na vetores. Este método envolve a extração de DNA, amplificação e código de barras das amostras através de PCR, sequenciamento em uma pilha de fluxo e bioinformática para combinar dados de sequência de informação filogenética.

Resumo

Nas últimas décadas, as doenças transmitidas por vetores têm ressurgiu e expandiu-se em alarmantes taxas, causando considerável morbidade e mortalidade em todo o mundo. Eficazes e amplamente disponíveis vacinas estão faltando para a maioria destas doenças, necessitando o desenvolvimento de estratégias de mitigação da doença romance. Para este efeito, uma avenida promissora de controle da doença envolve alvejar o vetor microbiome, a comunidade de micróbios que habitam o vetor. O vetor microbiome desempenha um papel fundamental na dinâmica do patógeno, e manipulações da microbiome conduziram a vector reduzida abundância ou patógeno de transmissão por um punhado de doenças transmitidas por vetores. No entanto, traduzir esses achados em aplicações de controle da doença requer uma compreensão completa da ecologia microbiana do vetor, historicamente limitada pela tecnologia insuficiente neste campo. O advento da próxima geração de sequenciamento abordagens permitiu arranjar em sequência rápida, altamente paralela de diversas comunidades microbianas. Direcionamento do gene de rRNA 16S altamente conservada tem facilitado caracterizações de micróbios presentes dentro vetores sob diferentes condições ecológicas e experimentais. Esta técnica envolve a amplificação do gene 16S rRNA, barcoding amostra através do PCR, amostras de carregamento para uma célula de fluxo para sequenciamento, e se aproxima de Bioinformática para combinar dados de sequência com informação filogenética. Espécie ou identificação de gênero-nível para um elevado número de repetições normalmente pode ser alcançada através desta abordagem, evadir-se, assim, desafios de baixa detecção, resolução e saída de cultivo tradicional, microscopia ou coloração histológica técnicas. Portanto, esse método é well-suited para caracterizar o vector micróbios sob diversas condições, mas atualmente não pode fornecer informações sobre função microbiana, localização dentro do vetor, ou a resposta ao tratamento com antibióticos. Em geral, 16S sequenciamento de próxima geração é uma técnica poderosa para compreender melhor a identidade e o papel dos micróbios vetor na dinâmica da doença.

Introdução

O ressurgimento e a propagação de doenças transmitidas por vetores nas últimas décadas representam uma séria ameaça para a saúde global de humanos e animais selvagens. Vacinas eficazes estão faltando para a maioria dessas doenças, e os esforços de controle são prejudicados pela natureza biológica complexa de vetores e interações vetor-hospedeiro. Compreender o papel das interações microbianas dentro de um vetor na transmissão do patógeno pode permitir o desenvolvimento de novas estratégias que contornar estes desafios. Em particular, as interações entre os comensais microbianas associada a vector, simbiontes e patógenos, referidos como o microbiome, podem ter consequências importantes para a transmissão de agentes patogénicos. Evidência esmagadora agora oferece suporte a essa afirmação, com exemplos que demonstram uma ligação entre o vetor microbiome e competência para doenças como malária, vírus Zika e doença de Lyme^1,2,3. No entanto, traduzir esses resultados em estratégias de controle de doenças requer uma compreensão mais detalhada da estrutura, função e origem do vetor microbiomes. Identificação e caracterização da comunidade microbiana vetor sob diferentes condições ecológicas e experimentais constituem um caminho importante para a frente neste campo.

Um procedimento para identificar os moradores microbianos de um vetor do patógeno é fornecido aqui, utilizando o Western nigripes carrapato, Ixodes pacificus, uma espécie de vetor do patógeno doença de Lyme Borrelia burgdorferi. Enquanto carrapatos abrigam mais tipos de patógenos humanos do que qualquer outros artrópodes, relativamente pouco é conhecido sobre a ecologia biologia e comunidade de carrapato microbiomes⁴. É evidente que os carrapatos abrigam um diversificado leque de vírus, bactérias, fungos e protozoários, que incluem comensais e endossimbiontes residentes microbiana transitória^5,4. Trabalho prévio demonstrou fortes variações em Ixodes microbiomes associado com geografia, espécie, sexo, fase de vida e refeição de sangue fonte^6,7,8. No entanto, os mecanismos subjacentes a esta variação permanecem desconhecidos e garantem que mais detalhadas investigações sobre a origem e o conjunto destas comunidades microbianas. Carrapatos podem adquirir micróbios através de transmissão vertical, contato com hosts e captação do ambiente através de espiráculos, boca e anal poro⁹. Compreender os fatores moldar a formação inicial e desenvolvimento de microbiome o carrapato, especificamente a contribuição relativa da transmissão vertical e ambiental, é importante para compreender os padrões naturais e variações na escala Microbiome diversidade e como essas comunidades interagem durante a transmissão do patógeno, com possíveis aplicações para controle de doença ou vetor.

Poderosas técnicas moleculares, tais como sequenciamento de próxima geração, agora existem para identificar comunidades microbianas e podem ser empregadas para caracterizar o vector microbiomes sob diversas condições ambientais ou experimentais. Antes do advento dessas abordagens de sequenciamento de alta produtividade, a identificação de micróbios baseou-se predominantemente na microscopia e cultura. Enquanto microscopia é uma técnica rápida e fácil, métodos morfológicos para a identificação de micróbios são inerentemente subjetivos e grosseiros e limitada pela baixa sensibilidade e deteção¹⁰. Métodos baseados em cultura são amplamente utilizados para identificação microbiana e podem ser usados para determinar a susceptibilidade de micróbios para tratamentos de drogas¹¹. No entanto, esse método também sofre de baixa sensibilidade, como estima-se que menos de 2% dos micróbios ambientais podem ser cultivadas em um laboratório de configuração¹². Abordagens de coloração histológicas também foi empregadas para detectar e localizar os micróbios específicos dentro de vetores, permitir investigações de várias distribuições de táxons dentro o carrapato e estudar hipóteses sobre as interações microbianas. No entanto, o conhecimento prévio da identidade microbiana é necessário para selecionando as manchas adequadas, fazendo com que esta abordagem inadequados para a identificação e caracterização microbiana. Além disso, a coloração histológica é um processo altamente demorada e trabalhoso e não se adapta bem para tamanhos de amostra grande. Abordagens moleculares tradicionais tais como Sanger sequenciamento da mesma forma são limitados em sua sensibilidade e a detecção de diversas comunidades microbianas.

Sequenciamento de última geração permite a identificação rápida de micróbios de um grande número de amostras. A presença de genes marcadores padrão e permite que mais de bancos de dados de referência avançada resolução taxonômica, frequentemente ao nível de gênero ou espécie. Pequena subunidade ribossomal RNAs são frequentemente usados para atingir esse objetivo, com 16S rRNA sendo os mais comuns devido à presença de regiões conservadas e variáveis dentro do gene, permitindo a criação de primers universais com amplicons exclusivo para cada bacteriana espécie de^13,14. Este relatório detalha um procedimento para identificar táxons no carrapato microbiome através do sequenciamento de próxima geração do 16S rRNA. Em particular, este protocolo enfatiza as etapas envolvidas na preparação de amostras para sequenciamento. Mais generalizada de detalhes sobre o sequenciamento e bioinformática passos são fornecidos, como há uma variedade de plataformas de sequenciamento e análise programas atualmente disponíveis, cada um com extensa documentação existente. A viabilidade global desta abordagem de sequenciamento de nova geração é demonstrada por aplicá-lo a uma investigação do conjunto da comunidade microbiana dentro de um vetor de doença chave.

Protocolo

1. assinale a coleção e a esterilização de superfície

1. Coletar carrapatos arrastando um pano² branca de 1 m sobre um habitat carrapato associada, remoção de carrapatos anexado para espécies de hospedeiros, ou criação de carrapatos, no laboratório^15,16. Use pinça fina para manipular carrapatos e armazená-los a-80 ° C.
2. Coloque carrapatos em tubos de PCR individuais e remover contaminantes superficiais vortexing por 15 s sucessivamente com 500 μL de peróxido de hidrogênio (H₂O₂), 70% de etanol e ddH₂O.
3. Coloque os carrapatos em um novo tubo PCR e deixe-os secar ao ar livre.
4. Neste tubo, mecanicamente romper tecidos carrapato, esmagando os carrapatos com um almofariz e um pilão (utilizado neste estudo), usando pequenos grânulos em um batedor do grânulo, ou cortar o carrapato com um bisturi.

2. purificação de DNA

1. Purifica o DNA de carrapatos individuais, seguindo as instruções fornecidas em um kit de extração de DNA disponível comercialmente. Eluir para um volume final de 100 μL.
   Nota: Consulte a Figura 1 para obter uma visão geral das etapas 2.2-2.8. Métodos de extração alternativos incluem o fenol-clorofórmio extração^17,18, etanol precipitação¹⁹ou extração com um quelante de material^20,21.
2. Confirme o sucesso da purificação de DNA usando um dados ou Espectrofotômetro. Para fluorometry, use 10 μL de modelo de DNA em um ensaio de DNA dupla-hélice μL 190. O rendimento esperado é de 0,1-1,0 ng/μL²². Por espectrofotometria, use 1 μL do modelo de DNA em uma quantificação de ácido nucleico. A relação de A260/280 esperada é aproximadamente 1.8²³.
3. Se não proceder imediatamente à amplificação, armazenar as amostras a-20 ° C.

3. 16S rRNA Gene amplificação

1. Configurar o amplicon PCR, em uma reação de 27,5 μL contendo: 5 μL de cada primer em 1 μM; 12,5 μL de mistura PCR disponível comercialmente; e 5 μL de DNA extraído de carrapatos individuais em uma concentração de 5 ng/μL.
   Nota: Use os seguintes primers para amplificação da região hipervariável V3-V4 do 16S rRNA gene¹³:
   5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3',
   5' - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3'
2. Mover os tubos para um thermocycler programado para: uma desnaturação inicial a 95 ° C por 3 min; 25 ciclos de 1) 95 ° C por 30 s, 2) 57 ° C por 30 s, 3) 72 ° C por 30 s; uma extensão final a 72 ° C por 5 min; e uma preensão final a 10 ° C.
3. Uma vez que a PCR é feito, visualize o produto PCR por 4-6 μL/amostra em um gel de agarose 1,5% de carregamento. Procure por uma banda em 460 bp para confirmar a amplificação.
   Nota: Produto Amplicon PCR pode não ser visível no gel se a concentração da amostra é muito baixa (< 10 ng). Presença de dímero da primeira demão é comum em amostras de baixa concentração. Se outras bandas não-alvo estão presentes, ajustar a temperatura do recozimento ou diminuir o número de ciclos.
4. Se não proceder imediatamente à purificação, armazenar as amostras em 4 ° C.

4. 16S Amplicon purificação

1. Usando um novo tubo PCR para cada amostra, aliam ddH₂O para obter total 60 μL do produto do PCR. Para amostras com baixas concentrações de DNA, execute amplicon PCR em triplicado para reduzir o viés de amplificação e piscina as amostras para se concentrar.
2. Trazer contas paramagnéticos à temperatura ambiente e vórtice-los bem antes de usar.
3. Adicionar 48 μL de grânulos paramagnéticos para 60 μL da amostra e incubar durante 5 min. do lugar os tubos em um rack magnético por 5 min até a solução torna-se claro. Remova o sobrenadante.
   Nota: Esta concentração do grânulo destina-se a remoção do dímero da primeira demão (< 60 bp). Se necessário, ajuste a concentração de grânulo para remover outras bandas inespecíficas.
4. Com tubos em rack magnético, adicionar 500 μL de 80%, recém-preparado EtOH. Imediatamente após a adição de EtOH para todos os tubos, pipete para fora o líquido. Não remova os grânulos. Repeti a adição de EtOH e remoção mais uma vez.
5. Secar as amostras para remover o excesso EtOH deixando os tubos aberto sobre o rack magnético por 5 min, ou até pequenas rachaduras são visíveis em grânulos.
6. Adicionar 20 μL de tampão TE e incubar as amostras fora do ímã, à temperatura ambiente, durante 5-10 min.
7. Coloque os tubos volta sobre o ímã. Uma vez que os grânulos e líquidos são separados, transfira o sobrenadante para um tubo fresco para obter o produto do PCR limpo.
8. (Opcional) Visualize o produto para confirmar o sucesso amplicon purificação por 4-6 μL/amostra em um gel de 1,5% de carregamento. A banda de bp 460 deve ser visíveis, e não deve haver nenhum dímero da primeira demão.
9. Se não avançar imediatamente para o índice do PCR, armazenar as amostras de 4 ° C.

5. código de barras e purificação da amostra

1. Atribua combinações de primeira demão única para cada amostra, selecionando as primeiras demão ou avanço ou retrocesso, ou ambos, de um kit de índice de biblioteca disponíveis comercialmente.
   Nota: Excepcionalmente etiquetar amostras permite a diferenciação após o sequenciamento. Kits normalmente fornecem suficiente cartilhas para sequenciar 96-384 amostras.
2. Anexe as primeiras demão duplas, ou índices, para amostras através da realização de PCR em uma reação de 25 μL contendo 2,5 μL de cada primer (N7xx e S5xx), 12,5 μL de comercialmente disponível mistura mestre PCR, 5 μL de DDQ₂O e 2,5 μL de produto amplicons limpos.
3. Mover os tubos para um thermocycler programado para: uma desnaturação inicial a 95 ° C por 3 min; 8-14 ciclos de 1) 95 ° C por 30 s, 2) 55 ° C por 30 s, 3) 72 ° C por 30 s; uma extensão final a 72 ° C por 5 min; e uma preensão final a 10 ° C.
4. Uma vez que a PCR é feito, visualize o produto PCR por 4-6 μL/amostra em um gel de agarose 1,5% de carregamento. Procure por uma banda em 550 bp para confirmar a amplificação.
   Nota: Use os resultados de visualização para informar condições de ciclismo índice do PCR. Diminuir a contagem de ciclo inespecificas de atenuar ou aumentar a contagem de ciclo para obter bandas visíveis para cada amostra.
5. Repita o procedimento de limpeza listado na etapa 4. Para evitar a diluição durante a limpeza, executar índice PCR em duplicado e piscina do produto aqui.
6. Se não proceder imediatamente à quantificação da biblioteca e normalização, armazenar as amostras em 4 ° C.

6. normalização e quantificação de biblioteca

1. Estimar a concentração de cada produto purificado, do código de barras da etapa 5.5 usando um dados ou espectrofotômetro (consulte a etapa 2.2). Dilua as amostras no buffer de TE para obter concentrações de aproximadamente 13:00.
   Nota: A quantificação da biblioteca é necessária para atingir a amostra concentração recomendada para a plataforma de sequenciamento de carregamento. Quantificação de biblioteca é conseguida através de qPCR, mas estimar a concentração da amostra antes da qPCR economiza tempo e reagentes. A concentração de 13:00 é recomendada para aumentar a precisão de quantificação de biblioteca, pois esta é a concentração média dos padrões de qPCR fornecidos no kit quantificação²⁴.
2. Execute qPCR em uma reação de 10 μL contendo 6,0 μL de mistura de mestre qPCR (do kit de quantificação de biblioteca) e 2.0 μL de DDQ₂O 2.0 μL da amostra ou padrão. Execute cada amostra e padrão em triplicado para maior precisão e rigor. Executar cada amostra em três ou mais níveis de diluição (ex., 12:01, 1 pm e 22:00 para as concentrações inicial estimadas) para garantir a exata quantificação.
   Nota: Informações detalhadas sobre as normas e as primeiras demão fornecidas irá variar com baseadas no kit quantificação usado e estão disponíveis na folha de dados técnicos de produtos. Consulte a Tabela de materiais para o kit de quantificação utilizado neste estudo.
3. Mover a placa qPCR ou tubos para um instrumento PCR em tempo real programado para: uma desnaturação inicial de 95 ° C por 5 min; 35 ciclos de 1) 95 ° C por 30 s e 2) 60 ° C durante 45 s; e um passo de dissociação de 1) 95 ° C por 15 s, 2) 60 ° C por 30 s e 3) 95 ° C por 15 s.
4. Calcule a média começa a concentração para cada amostra, usando os valores de quantificação obtidos a partir dos resultados de qPCR e os níveis de diluição de amostra utilizados.
   Nota: por exemplo, uma concentração média de 14:00 para uma amostra diluída 1: 100.000 produz uma concentração inicial original de 200 nM. Se nenhum dos níveis de diluição para uma determinada amostra cai dentro do intervalo das curvas padrão, resultados de quantificação podem não ser precisos; Nesse caso, ajustar os níveis de diluição e re-executar qPCR.
5. Diluir cada amostra de código de barras purificada, a 4 nM no buffer de TE, com base nas concentrações médias calculadas no passo 7.5.
   Nota: por exemplo, para uma concentração da amostra média de 200 nM, diluir a amostra 01:50 em TE buffer para obter uma concentração de nM a 4. A concentração de amostra precisa pode variar com base no kit de sistema e reagente de sequenciamento usado. Consulte o guia de usuário de sistema de sequenciamento para a concentração recomendada.
6. Crie a biblioteca combinada adicionando volumes iguais (tipicamente 5-10 μL) de todas as bibliotecas individuais em um único tubo.
   Nota: como todas as amostras devem ser em uma concentração de nM 4, adicionar volumes iguais alcança uma concentração igual de todas as amostras na biblioteca em pool.
7. Repita as etapas de 6.2-6.4 na biblioteca combinada para confirmar a concentração de nM a 4.
8. Calcular a concentração de biblioteca combinada e diluir ou reconstituir a biblioteca final, agrupada usando tampão Tris conforme necessário para conseguir 4 nM.
9. Se não proceder imediatamente à carga de amostra, armazenar as amostras a-20 ° C. Realize o sequenciamento executado logo após quantificação para minimizar a perda ou alterações de concentração de DNA durante o armazenamento.

7. Biblioteca desnaturação e diluição e sequenciamento execute (executar no mesmo dia)

1. Desnature a 4 nM biblioteca combinada da etapa 6,9 com NaOH.
   Nota: Estas etapas de preparação final biblioteca variam para cada sistema de sequenciamento. Consulte o guia de usuário do sistema de sequenciamento para protocolos mais detalhados e atualizados. Novos usuários provavelmente precisará ser treinados sobre o uso da plataforma de sequenciamento, ou podem enviar suas bibliotecas para uma facilidade de sequenciamento do núcleo.
2. Dilua a biblioteca desnaturada para a concentração desejada de carregamento usando o buffer fornecido no kit de reagente de sequenciamento (Tabela de materiais).
   Nota: Concentrações de carregamento ideal variam de acordo com o sistema de sequenciamento e, normalmente, variam de 1-250 pM²⁵.
3. Desnaturar e diluir o controle de sequenciamento.
   Nota: Adicionar um controle de sequenciamento corrige para questões de sequenciamento decorrentes das bibliotecas de baixa diversidade. Desnaturar o controle de sequenciamento utilizando NaOH e diluir a mesma concentração que a biblioteca.
4. Combine a biblioteca e o controle de sequenciamento.
   Nota: A relação do controle de sequenciamento para biblioteca combinada dependerá a diversidade da biblioteca e sistema de sequenciamento usado, mas é normalmente de 1:1²⁶.
5. Carrega a biblioteca combinada e mistura de controle de sequenciamento para a célula de fluxo de sequenciamento.

8. análise de sequência Amplicon

1. Avalie o sucesso global da execução examinando as métricas de execução sobre o ambiente de computação de nuvem correspondente para o sistema de sequenciamento usado.
   Nota: As métricas de execução, tais como o número de leituras de sequenciamento, irão variar com base no sequenciamento kit plataforma e reagente utilizado. Valores-alvo para sistemas comuns de sequenciação estão listados na tabela 1.
2. Baixar os dados brutos de sequenciamento e bioinformática desejada software open source, quantitativos Insights sobre ecologia microbiana (QIIME)²⁷ ou Mothur²⁸.
   Nota: Os dois QIIME e Mothur são código-fonte aberto e livre para fazer o download. Instruções detalhadas sobre como usar esses programas podem ser encontradas on-line em são suficientemente detalhadas para usuários de primeira viagem. As etapas a seguir fornecem uma visão ampla de um pipeline de bioinformática, realizado em QIIME. Familiaridade com o python não é necessária, mas irá facilitar a implementação dos seguintes scripts
3. Criar e validar o arquivo de mapeamento usando o script "validate_mapping_file.py" no QIIME.
   Nota: O arquivo de mapeamento contém todos os metadados necessários para realizar a análise de dados, incluindo identificação de amostra, sequências de amplicons da primeira demão e descrição da amostra. A etapa de validação verifica que todos os dados necessários tenham sido inscritos no formato adequado.
4. Demultiplex e filtrar sequências usando o script "split_libraries.py" (Figura 1).
   Nota: Este script atribui leituras de código de barras para amostras com base em combinações de primeira demão o índice e IDs de amostra de entrada no arquivo de mapeamento. Ele também realiza qualidade várias medidas para controle do sequenciamento do erro baseado em definido pelo usuário de madeira cortada para Pontuação de qualidade mínima, comprimentos de sequência e final-aparamento de filtragem.
5. Atribua unidades taxonômicas operacionais (OTUs) sequências usando o script "pick_open_references_otus.py".
   Nota: Nesta etapa, as sequências são agrupadas contra uma coleção de sequência de referência com base em um limite de identidade (normalmente 97%). Leituras que não coincidem com a coleção de sequência de referência são agrupadas um contra o outro. De novo e fechado-referência OTU escolher opções também estão disponíveis, mas abrir-referência colheita recomenda-se pelos desenvolvedores do QIIME.
6. Normalize a tabela OTU usando o script "alpha_rarefaction.py" ou "normalize_table.py".
   Nota: Este passo corrige para variação em somas de coluna, ou total sequência lê por amostra, que resultam de tecnologias modernas de sequenciamento. Normalização pode ser executada usando a rarefação tradicional, ou através de métodos alternativos tais como dimensionamento de soma cumulativa.
7. Execute várias diversidade alfa, beta-diversidade e análises de diversidade de composição taxonômica de uma vez usando o script "core_diversity_analysis.py".
   Nota: Em alternativa, estas análises podem ser executadas separadamente usando os scripts individuais (por exemplo, "alpha_diversity.py").

Resultados

Um total de 42 tiques de ovo separado três embreagens e dois períodos de exposição ambiental, 0 e 2 semanas no solo, foram processados para microbiome sequenciamento. Cada grupo de tratamento, considerado uma única vez de embreagem e exposição, contida 6-8 Replicar amostras de carrapato. Estes extratos de carrapato processados foram carregados de um sequenciador de última geração e renderam 12,885,713 leituras emparelhado-fim, passando o filtro. Incluído neste prazo foram 3 con...

Discussão

Próxima geração sequenciamento de 16S rRNA tem tornar-se uma abordagem padrão para identificação microbiana e permitiu o estudo de como vetor microbiomes afetar a transmissão do patógeno. O protocolo descrito aqui detalha o uso desse método para investigar o conjunto da comunidade microbiana em I. pacificus, uma espécie de vetor para a doença de Lyme; no entanto, pode facilmente ser aplicado para estudar outras espécies de carrapato ou espécies de artrópodes vetores.

Com...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item	Name of Material/Equipment	Company	Catalog #
1	DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
2	Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q3326
3	NanoDrop 8000 Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP beads	Agen Court	A63880
6	Magnetic Rack	ThermoFisher Scientific	MR02
6	TE buffer	Teknova	T0223
7	Nextera Index Kit	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA Library Quantification Kit	Roche	KK4824
9	MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001
11	10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20	Teknova	T7724