다음-세대 16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 틱 미생물 특성

요약

여기 우리는 식별 및 벡터 내에서 미생물 커뮤니티의 16S rRNA 시퀀싱에 대 한 다음-세대 시퀀싱 프로토콜을 제시. 이 방법은 DNA 추출, 증폭 및 PCR, 시퀀싱 흐름 셀 및 생물 정보학에 계통 발생 정보를 시퀀스 데이터 일치를 통해 샘플의 바코드를 포함 한다.

초록

최근 수십 년간, 벡터 품 어진 질병이 다시 등장 있고 속도, 상당한 병 적 상태와 사망률 세계를 일으키는 놀라운 확대. 효과적이 고 널리 사용 가능한 백신은 소설 질병 완화 전략의 개발을 필요로 하는이 질병의 대부분 부족 합니다. 이 위해, 질병 통제의 한 유망한 애비뉴 벡터 미생물, 미생물 거주 벡터의 커뮤니티를 대상으로 포함 됩니다. 벡터 미생물 병원 체 역학에서 중추적인 역할을 담당 하 고는 미생물의 조작 벡터 품 어진 질병의 소수에 대 한 감소 된 벡터 풍부 또는 병원 체 전송 이어졌다. 그러나, 질병 제어 응용 프로그램에 이러한 결과 번역 벡터 미생물 생태학, 역사적으로이 분야에서 부족 한 기술에 의해 제한에 대 한 철저 한 이해를 필요 합니다. 차세대 시퀀싱 방법의 출현은 다양 한 미생물 커뮤니티의 급속 한, 높은 병렬 시퀀싱을 활성화 하 고 있다. 높은 보존 16S rRNA 유전자를 대상으로 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 내의 미생물의 characterizations 촉진 했다. 이 기술은 PCR, 시퀀싱, 흐름 셀에 로드 샘플 통해 샘플 바코드, 16S rRNA 유전자의 증폭과 생물 정보학 계통 발생 정보 시퀀스 데이터에 맞게 접근. 종 또는 속 수준 id 복제의 높은 숫자에 대 한 일반적으로 따라서 낮은 검출, 확인, 및 전통적인 경작, 현미경, 또는 조직학에 게 얼룩이 지기에서 출력의 문제를 우회 하는이 접근을 통해 달성 될 수 있다 기술입니다. 따라서,이 방법은 다양 한 조건 하에서 벡터 미생물을 특성화 하는 데 적합 하지만 현재 미생물 함수, 벡터, 또는 항생제 치료에 반응 내에서 위치 정보를 제공할 수 없습니다. 전반적으로, 16S 차세대 시퀀싱 정체성과 역할에서 질병 역학 벡터 미생물의 더 나은 이해를 위한 강력한 기술입니다.

서문

부활과 벡터 품 어진 질병의 확산을 최근 몇 십년 간에서 글로벌 인간과 야생 동물의 건강에 심각한 위협이 포즈. 이 질병의 대부분에 대 한 효과적인 백신 부족 하 고 제어 노력 벡터와 벡터-호스트 상호 작용의 복잡 한 생물 학적 특성에 의해 방해. 병원 체 전송에서 벡터 내 미생물 상호 작용의 역할을 이해 이러한 문제를 회피 하는 새로운 전략의 개발에 대 한 수 있습니다. 특히, 벡터 관련 미생물 공생, symbionts, 병원 균, 미생물로 사이 상호 작용 병원 체 전송에 대 한 중요 한 결과가 있을 수 있습니다. 압도적인 증거를 이제 벡터 미생물과 질병 말라리아, Zika 바이러스, 그리고 라임 질병^1,2,3에 대 한 능력 사이의 링크를 보여 주는 예제와 함께이 단언을 지원 합니다. 그러나, 질병 통제 예방 전략으로 이러한 결과 번역 구조, 기능, 및 벡터 microbiomes의 기원에 대 한 훨씬 더 상세한 이해를 요구 한다. 식별 및 다양 한 생태 및 실험 조건에서 벡터 미생물 커뮤니티의이 분야에서 앞으로 중요 한 경로 구성 합니다.

병원 체 벡터의 미생물 주민 확인을 위한 절차는 여기 서양 검은 다리 진드기, Ixodes pacificus, Lyme 질병 병원 체의 보렐 리아 burgdorferi종의 벡터를 이용 하 여 제공 됩니다. 틱 항구 다른 절지동물 보다 인간 병원 체의 더 많은 종류의, 하는 동안 상대적으로 작은 틱 microbiomes⁴의 생물학과 사회 생태에 대 한 알려져 있다. 그것은 분명 진드기 바이러스, 박테리아, 균 류, protozoans 공생, endosymbionts, 및 과도 미생물 주민^5,4의 다양 한 배열을 항구. 이전 작업 Ixodes microbiomes 지리, 종, 성별, 생활 단계, 및 혈액 식사 소스^6,,78와 관련 된 강력한 변화를 설명 했다. 그러나,이 변화를 기본 메커니즘 알 수와 자세한 출처의 조사와 이러한 미생물 커뮤니티의 보증 합니다. 틱 수직 전송을 통해 미생물을 수집할 수 있습니다 호스트 및 spiracles, 입, 항문 기 공⁹를 통해 환경에서 글귀와 접촉. 초기 형성 및 개발 틱 미생물의 형성 요인 이해, 특히 수직 및 환경 전송의 상대적 기여도 자연 패턴 및 눈금의 변화를 이해 하기 위한 중요 한 미생물 다양성 및 이러한 지역 사회 병원 체 전송, 질병 또는 벡터 제어 가능한 응용 프로그램 중 상호 작용 하는 방법.

차세대 시퀀싱 등 강력한 분자 기법, 지금 식별 미생물 지역 사회에 대 한 존재 하 고 다양 한 환경 또는 실험 조건에서 벡터 microbiomes 하 채택 될 수 있다. 이러한 높은 처리량 시퀀싱 접근의 출현 전에 미생물의 식별 현미경 검사 법 그리고 문화에 주로 의존 했다. 현미경 검사 법은 신속 하 고 쉽게 기술, 미생물을 식별 하기 위한 형태학 메서드는 본질적으로 주관적이 고 굵고 낮은 감도와 감지¹⁰제한. 문화 기반 방법 미생물 식별을 위해 광범위 하 게 사용 하 고 약물 치료¹¹미생물의 감수 성을 결정 하는 데 사용 수 있습니다. 그러나,이 방법은 또한 겪고 있다 낮은 감도에서 환경 미생물의 2% 미만¹²설정 실험실에서 경작 될 수 추정 되었습니다. 조직학 얼룩 접근 감지 하 고 벡터 내에서 특정 미생물을 지역화, 틱, 내 다양 한 taxa 배포판의 조사 활성화 미생물 상호 작용에 대 한 가설을 공부 고용 또한 있다. 그러나, 미생물 정체성의 사전 지식을 적절 한 얼룩, 미생물 특성화 및 식별에 어울리지이 이렇게 만들기를 선택 하는 데 필요 합니다. 또한, 조직학 얼룩 매우 시간이 오래 걸리는, 힘 드는 프로세스 이며 큰 샘플 크기 위해 잘 확장 되지 않습니다. 생어 시퀀싱은 마찬가지로 그들의 감도 다양 한 미생물 커뮤니티의 탐지에서 제한 등 전통적인 분자 접근.

다음-세대 시퀀싱 샘플의 많은 수에서 미생물의 급속 한 식별 수 있습니다. 표준 표식 유전자 및 참조 데이터베이스 추가 하면 종종 단계로 속 또는 종의 분류학 해상도 향상. 작은 소 단위 ribosomal RNAs는 자주 16S rRNA 유전자 보존 및 가변 지역의 존재로 인해 가장 일반적인 각 세균에 대 한 독특한 amplicons 보편적인 뇌관의 창조에 대 한 허용으로이 목표를 달성 하는 데 사용 됩니다. 종^13,14. 이 보고서는 16S rRNA 차세대 시퀀싱을 통해 틱 미생물에 taxa를 식별 하기 위한 절차를 자세히 설명 합니다. 특히,이 프로토콜 시퀀싱에 대 한 샘플 준비 단계를 강조 합니다. 더는 시퀀싱에 대 한 내용을 일반화 및 생물 정보학 단계 제공 됩니다, 현재 사용할 수 있는 다양 한 시퀀싱 플랫폼 및 분석 프로그램으로 각각의 광범위 한 기존 문서. 이 다음-세대 시퀀싱 방법의 전반적인 타당성은 주요 질병 벡터 내 미생물 커뮤니티 어셈블리의 조사에 적용 하 여 설명 했다.

프로토콜

1. 틱 컬렉션 및 표면 살 균

1. 틱 틱 관련 서식, 진드기 제거에 1 m² 흰 헝겊을 끌어 호스트 종, 또는 실험실^15,16틱 양육 수집. 미세 집게를 사용 하 여 진드기를 조작-80 ° c.에서 그들을 저장 하
2. 개별 PCR 튜브에 틱 하 고 15 vortexing에 의해 표면 오염 물질을 제거 연속적으로 과산화 수소 (H₂O₂), 70% 에탄올 및 ddH₂오 500 μ s
3. 새로운 PCR 튜브에 진드기를 놓고 건조 하도록 허용 합니다.
4. 이 튜브에 기계적으로 박격포와 유 봉 (이 연구에 사용), 작은 구슬 구슬 때리는에 사용 하 여 진드기를 분쇄 하 여 틱 조직을 방해 또는 틱 메스와 떨어져 절단.

2. DNA 정화

1. 상업적으로 이용 가능한 DNA 추출 키트에 제공 된 지침에 따라 개별 틱에서 DNA를 정화. 100 μ의 최종 볼륨을 elute.
   참고: 단계 2.2-2.8의 개요 그림 1 을 참조 하십시오. 대체 추출 방법에는 페 놀-클로 프롬 적 출^17,18, 에탄올 강수량¹⁹또는 추출 chelating 소재^20,21포함 됩니다.
2. 성공 DNA 정화 fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 확인 합니다. Fluorometry, 190 μ 이중 가닥 DNA 분석 결과에서 DNA 템플렛의 10 μ를 사용 합니다. 예상된 수익률은 0.1-1.0 ng/μ²². 분 광 광도 학, 핵 산의 정량화에 DNA 템플렛의 1 μ를 사용 합니다. 예상된 A260/280 비율 약 1.8²³이다.
3. 증폭, 즉시 진행-20 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우

3. 16S rRNA 유전자 증폭

1. 포함 하는 27.5 μ 반응에서 PCR amplicon 설정: 1 μ M;에서 각 뇌관의 5 μ 상용의 12.5 μ PCR 혼합; 그리고 5 ng/μ 농도에 개별 틱에서 추출한 DNA의 5 μ.
   참고 다음 프라이 머를 사용 하 여 16S rRNA 유전자¹³의 하이퍼 V3-V4 영역의 확대를 위한.:
   5 '-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'
   5 '-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3'
2. 튜브에 대 한 프로그래밍 thermocycler 이동: 95 ° c 3 분;에 대 한 초기 변성 30 대 1) 95 ° C의 25 주기 s, 30 ° C 2) 57 s, 30 대 3) 72 ° C s; 5 분; 72 ° C에서 최종 확장 그리고 10 ° c.에 최종 보류
3. PCR 완료 되 면, 4-6 μ/샘플 1.5 %agarose 젤에 로드 하 여 PCR 제품을 시각화. 460에서 밴드를 찾고 증폭을 확인 하는 혈압.
   참고: Amplicon PCR 제품 보이지 않을 수 있습니다 젤에 샘플 농도 너무 낮은 경우 (< 10 ng). 뇌관 이합체 존재 낮은 농도 샘플에서 일반적 이다. 다른 비 목표 밴드 경우 어 닐 링 온도 조정 하거나 사이클의 수를 감소 합니다.
4. 정화, 즉시 진행 4 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우

4. 16 Amplicon 정화

1. 각 샘플에 대 한 새로운 PCR 튜브를 사용 하 여, 케이블의 PCR 제품을 ddH₂O 총 60 μ를에 결합. 낮은 DNA 농도와 샘플에 대 한 증폭 바이어스를 줄이고 집중 샘플 수영장을 3 중 amplicon PCR을 수행 합니다.
2. 실내 온도 소용돌이 그들 사용 하기 전에 잘 상자성 구슬가지고.
3. 샘플의 60 μ에 상자성 구슬의 48 μ를 추가 하 고 5 분 장소 솔루션은 때까지 5 분에 대 한 자석 선반에 튜브 취소에 대 한 품 어. 제거는 상쾌한.
   참고:이 구슬 농도 뇌관 이합체 (< 60 bp)의 제거 대상. 필요한 경우, 다른 일반적인 밴딩을 제거 하 비드 농도 조정 합니다.
4. 마그네틱 랙 튜브, 추가 갓 80%의 500 μ EtOH. 모든 튜브에 EtOH를 추가한 후 즉시 액체 밖으로 플라스틱. 비즈를 제거 하지 마십시오. EtOH 추가 및 제거 한 번 더 반복 합니다.
5. 5 분, 또는 작은 균열 구슬에 표시 됩니다 때까지 자석 선반에 튜브를 열어두고 여 초과 EtOH를 제거 하는 예제 건조
6. TE 버퍼의 20 μ를 추가 하 고 5-10 분 동안 실내 온도에 자석에서 샘플을 품 어.
7. 자석에 다시 튜브를 놓습니다. 일단 구슬 및 액체 분리, PCR 제품을 청소를 얻으려면 신선한 튜브는 상쾌한 전송.
8. (선택 사항) 4-6 μ/샘플 1.5% 젤에 로드 하 여 성공적인 amplicon 정화를 확인 하려면 제품을 시각화. 460 bp 밴드 표시, 고 아무 뇌관 이합체 이어야 한다.
9. 샘플을 저장 색인 PCR에 즉시 진행 하지, 4 ° c.

5. 샘플 바코드 및 정화

1. 앞으로 또는 반전 뇌관, 또는 상업적으로 사용 가능한 라이브러리 인덱스 키트에서 둘 다를 선택 하 여 각 샘플을 독특한 뇌관 조합을 할당 합니다.
   참고: 고유 라벨 샘플 시퀀싱 후 차별화 수 있습니다. 키트는 일반적으로 충분 한 뇌관 96-384 샘플 시퀀스를 제공 합니다.
2. 듀얼 프라이 머, 또는 인덱스, 각 뇌관 (N7xx 및 S5xx), 12.5 μ 상용 PCR 마스터 믹스, ddH₂O, 5 μ 그리고 청소 amplicon 제품의 2.5 μ의 2.5 μ를 포함 하는 25 μ 반응에서 PCR을 수행 하 여 샘플을 첨부 합니다.
3. 튜브에 대 한 프로그래밍 thermocycler 이동: 95 ° c 3 분;에 대 한 초기 변성 8-14 주기 1) 95 ° C 30에 대 한 s, 30 대 2) 55 ° C s 30 3) 72 ° C s; 5 분; 72 ° C에서 최종 확장 그리고 10 ° c.에 최종 보류
4. PCR 완료 되 면, 4-6 μ/샘플 1.5 %agarose 젤에 로드 하 여 PCR 제품을 시각화. 550에 밴드를 찾고 증폭을 확인 하는 혈압.
   참고: 인덱스 PCR 순환 상태를 시각화 결과 사용 합니다. 일반적인 바인딩 완화 또는 각 샘플에 대 한 보이는 밴드를 사이클 수를 증가 사이클 수를 낮춥니다.
5. 4 단계에서 나열 된 청소 절차를 반복 합니다. 정리 하는 동안 희석을 방지 하려면 중복에서 인덱스 PCR을 수행 하 고 제품 여기 수영장.
6. 즉시 라이브러리 정량화 및 정규화를 진행 4 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우

6. 도서관 정량화 및 정규화

1. 단계는 fluorometer 또는 분 광 광도 계를 사용 하 여 5.5에서 각 순화, 바코드 제품의 농도 추정 (단계 2.2 참조). 오후 1 시 약의 농도를 테 버퍼에서 샘플을 희석.
   참고: 라이브러리 정량화는 시퀀싱 플랫폼에 권장 하는 농도 로딩 하는 샘플을 달성 하는 데 필요한. 도서관 부 량 정량을 통해 이루어집니다 하지만 시 약 및 시간 저장 정량 이전 샘플 농도 추정 합니다. 이 정량화 키트²⁴에서 제공 하는 정량 기준의 평균 농도 1 오후 농도 라이브러리 정량화의 정확도 극대화 하기 위해 좋습니다.
2. (라이브러리 정량화 kit)에서 정량 마스터 믹스, ddH₂O, 2.0 μ 및 샘플 또는 표준의 2.0 μ의 6.0 μ를 포함 하는 10 μ 반응에서 정량 Pcr를 수행 합니다. 각 샘플 및 큰 정확도 정밀도 대 한 3 중에서 표준 실행 합니다. 세 개 이상의 희석 수준에서 각 샘플을 실행 (예., 오후 0 시 1 분, 1 오후, 그리고 10 오후 예상된 시작 농도 대 한) 정확한 정량화를 위해.
   참고: 제공 된 뇌관 및 표준에 대 한 자세한 내용은 정량화 키트 사용에 따라 달라 집니다 및 제품 기술 데이터 시트에서 사용할 수 있습니다. 이 연구에 사용 된 정량화 키트에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
3. 프로그램에 대 한 실시간 PCR 악기를 정량 플레이트 또는 관 이동:; 5 분 동안 95 ° C의 초기 변성 1) 95 ° C의 35 주기 30 s와 45 2) 60 ° C에 대 한 s; 그리고 15 대 1) 95 ° C의 분리 단계 s, 30 대 2) 60 ° C, 및 3) 95 ° C 15에 대 한 s.
4. 시작 하는 농도 정량 결과에서 얻은 부 량 값과 사용 하는 샘플 희석 수준을 사용 하 여 각 샘플에 대 한 평균을 계산 합니다.
   참고: 예를 들어 샘플 희석 1:100,000에 대 한 2pm의 평균 농도 수익률 200의 원래 시작 농도 nM. 부 량 결과; 정확 하지 않을 수 있습니다 주어진된 샘플에 대 한 희석 레벨의 범위 내에 표준 곡선의 경우, 어떤 경우에, 희석 레벨을 조정 하 고 다시 정량 Pcr을 수행.
5. 4 각 순화, 바코드 샘플 희석 단계 7.5에서에서 계산한 평균 농도에 따라 TE 버퍼에 nM.
   참고: 예를 들면, 200의 평균 샘플 농도 nM, 희석 테에 샘플 1시 50분 4 nM 농도 달성 하기 위해 버퍼. 정확한 샘플 농도 시퀀싱 시스템 및 시 약 키트를 사용에 따라 달라 집니다. 권장된 농도 대 한 시퀀싱 시스템 사용자 설명서를 참조 하십시오.
6. 단일 관으로 모든 개별 라이브러리의 동등한 볼륨 (일반적으로 5-10 μ)을 추가 하 여 결합 된 라이브러리를 만듭니다.
   참고: 모든 샘플 4 nM 농도에 있어야 해 서 동일한 볼륨 추가 풀링된 라이브러리에서 모든 샘플의 동등한 농도를 달성 한다.
7. 6.2-6.4 4 nM 농도 확인 하는 결합 된 라이브러리에 단계를 반복 합니다.
8. 결합 된 라이브러리 농도 계산 하 고 희석 또는 다시 4를 달성 하기 위해 필요한 Tris 버퍼를 사용 하 여 최종, 풀링된 라이브러리 구성 nM.
9. 즉시 샘플 로드를 진행-20 ° c.에 샘플을 저장 하지 않을 경우 손실 또는 변경 내용을 저장 하는 동안 DNA 농도 최소화 하기 위해 정량화 직후 실행 시퀀싱을 수행 합니다.

7. 도서관 변성 및 희석, 고 시퀀싱 실행 (같은 날에 수행)

1. NaOH와 단계 6.9에서에서 4 nM 결합된 라이브러리 변성
   주: 각 시퀀싱 시스템에 대 한 최종 라이브러리 준비 단계 다. 보다 상세 하 고 업데이트 된 프로토콜에 대 한 시퀀싱 시스템 사용자 가이드를 참조 하십시오. 새로운 사용자가 가능성이 시퀀싱 플랫폼의 사용에 훈련 될 필요가 있을 것 이다 또는 그들의 라이브러리 코어 시퀀싱 시설에 보낼 수 있습니다.
2. 시퀀싱 시 약 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 버퍼를 사용 하 여 원하는 로드 농도에 변성된 라이브러리를 희석.
   참고: 최적의 로드 농도 시퀀싱 시스템 및 일반적으로 1-250 오후²⁵범위에서 다릅니다.
3. 변성 고 시퀀싱 제어를 희석.
   참고: 낮은 다양성 라이브러리에서 발생 하는 시퀀싱 문제에 대 한 수정 시퀀싱 제어를 추가 합니다. NaOH를 사용 하 여 시퀀싱 제어를 변성 하 고 도서관으로 동일한 농도에 희석.
4. 라이브러리 및 시퀀싱 제어를 결합 한다.
   참고: 결합 된 라이브러리를 시퀀싱 제어의 비율 라이브러리 성과 시퀀싱 시스템 사용에 따라 달라 집니다 하지만 일반적으로 1:1²⁶.
5. 결합 된 라이브러리 및 시퀀싱 흐름 셀에 시퀀싱 제어 혼합물을 로드 합니다.

8. Amplicon 시퀀스 분석

1. 해당 시퀀싱 시스템 사용 하는 클라우드 컴퓨팅 환경에 실행된 통계를 검사 하 여 실행의 전반적인 성공을 평가 합니다.
   참고: 연속 읽기 수 등 실행된 통계 시퀀싱 플랫폼 및 시 약 키트 사용에 따라 달라 집니다. 일반적인 시퀀싱 시스템에 대 한 목표 값은 표 1에 나열 됩니다.
2. 원시 시퀀싱 데이터를 다운로드 하 고 원하는 생물 정보학 오픈 소스 소프트웨어, 양적 통찰력 미생물 생태학 (QIIME)²⁷ 또는 Mothur²⁸.
   참고: 둘 다 QIIME와 Mothur는 오픈 소스 무료 다운로드. 이러한 프로그램을 사용 하 여 자세한 내용은 온라인 찾을 수 있습니다와 처음 사용자를 위한 상세한 충분히 있습니다. 다음 단계는 QIIME에서 실시 하는 생물 정보학 파이프라인에 대 한 광범위 한 개요를 제공 합니다. Python 친숙 하지만 필요 하지 않습니다 다음 스크립트의 구현을 용이 하 게 한다
3. 만들고 QIIME에 "validate_mapping_file.py" 스크립트를 사용 하 여 매핑 파일의 유효성을 검사 합니다.
   참고: 매핑 파일 샘플 ID, amplicon 뇌관 시퀀스 및 샘플 설명을 포함 한 데이터 분석을 수행 하는 데 필요한 모든 메타 데이터를 포함 합니다. 유효성 검사 단계를 적절 한 형식에 필요한 모든 데이터가 입력 되었습니다 확인 합니다.
4. Demultiplex 고 "split_libraries.py" 스크립트 (그림 1)를 사용 하 여 시퀀스를 필터링 합니다.
   참고:이 스크립트 샘플 인덱스 뇌관 조합에 따라 바코드 읽기를 할당 하 고 샘플 Id 매핑 파일에서 입력. 그것은 또한 여러 품질 필터링 단계 오류 기반으로 사용자 정의 최소 품질 평가 점수, 시퀀스 길이, 및 최종-트리밍 컷 오프 시퀀싱에 대 한 제어를 수행 합니다.
5. "Pick_open_references_otus.py" 스크립트를 사용 하 여 시퀀스에 조작 상 분류학 단위 (OTUs)를 할당 합니다.
   참고:이 단계에서 시퀀스 id (일반적으로 97%)의 임계값에 따라 참조 시퀀스 컬렉션에 대 한 클러스터링 됩니다. 참조 시퀀스 컬렉션을 일치 하지 않는 읽기는 서로 대 한 클러스터링 됩니다. 드 노 보 및 폐쇄 기준 OTU 따기 옵션은 또한 사용할 수, 하지만 오픈 참조 따기 QIIME 개발자에 의해 권장 합니다.
6. "Alpha_rarefaction.py" 또는 "normalize_table.py" 스크립트를 사용 하 여 OTU 테이블 정규화.
   참고:이 단계는 열 합계에는 변형에 대 한 수정 또는 전체 순서 현대 시퀀싱 기술에서 발생 하는 샘플 당 읽습니다. 정규화는 전통적인 진공을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 누적 합계 스케일링 등 다른 방법을 통해.
7. 여러 알파-, 베타-다양성, 다양 성과 분류학 구성 다양성 분석 "core_diversity_analysis.py" 스크립트를 사용 하 여 한 번에 수행 합니다.
   참고: 또는, 이러한 분석 실행할 수 있습니다 별도로 개별 스크립트를 사용 하 여 (예를 들어, "alpha_diversity.py").

결과

총 3 개의 별도 달걀에서 42 틱 클러치 및 두 환경 노출 기간, 0과 토양, 2 주 미생물 시퀀싱에 대 한 처리 했다. 각 치료 그룹, 6-8 틱 샘플 복제를 포함 한 단일 클러치와 노출 시간으로 간주 됩니다. 이러한 처리 진드기 추출 물 다음-세대 시퀀서에 로드 된 하 고 필터를 통과 하는 12,885,713 쌍 간 읽기를 굴복. 이 실행에 포함 211,214 읽기 (이전 수에 포함)의 총 저조한 추출 단계?...

토론

16S rRNA의 다음-세대 시퀀싱와 벡터 microbiomes 병원 체 전송에 미치는 영향의 연구 활성화 미생물 식별을 위한 표준 접근 되고있다. 여기에 설명 된 프로토콜 세부 I. pacificus, 라임 병;에 대 한 벡터 종에에서 미생물 커뮤니티 어셈블리를 조사 하기 위해이 메서드를 사용 하 여 그러나, 그것은 쉽게 다른 틱 종 또는 arthropod 벡터 종 연구에 적용할 수 있습니다.

실제로, 16S rRNA ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item	Name of Material/Equipment	Company	Catalog #
1	DNeasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504
2	Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q3326
3	NanoDrop 8000 Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
4	2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems	KK2501
5	AMPure XP beads	Agen Court	A63880
6	Magnetic Rack	ThermoFisher Scientific	MR02
6	TE buffer	Teknova	T0223
7	Nextera Index Kit	Illumina	FC-121-1011
8	KAPA Library Quantification Kit	Roche	KK4824
9	MiSeq System	Illumina	SY-410-1003
10	MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001
11	10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20	Teknova	T7724