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Resumen

Aquí, describimos un método para microdiálisis en vivo analizar liberación de aspartato y glutamato en el hipocampo ventral de ratas epilépticas y no epilépticas, en combinación con las grabaciones de EEG. Concentraciones extracelulares de aspartato y glutamato pueden ser correlacionadas con las diferentes fases de la enfermedad.

Resumen

Microdiálisis es una técnica bien establecida de la neurociencia que correlaciona los cambios de sustancias neurológicamente activas que difunde en el espacio intersticial del cerebro con el comportamiento o con el resultado específico de una patología (por ejemplo, convulsiones para la epilepsia). Al estudiar la epilepsia, la técnica de microdiálisis se suele combinar con a corto plazo o a largo plazo incluso video-electroencefalografía (EEG de monitoreo para evaluar la frecuencia de las crisis espontáneas, severidad, progresión y agrupamiento). El EEG de microdialysis combinado se basa en el uso de varios métodos e instrumentos. Aquí realizamos la microdiálisis en vivo y vídeo-EEG continuo grabando para monitor salida de glutamato y aspartato en el tiempo, en diferentes fases de la historia natural de la epilepsia en un modelo de rata. Este enfoque combinado permite el emparejamiento de los cambios en la liberación de neurotransmisor con etapas específicas del desarrollo de la enfermedad y progresión. La concentración del aminoácido en el dializado se determinó por cromatografía líquida. Aquí, describimos los métodos y el contorno de las principales medidas cautelares se deben tomar durante la microdiálisis en vivo -EEG, con especial atención a la cirugía estereotáctica, potasio basal y alta estimulación durante microdialysis, profundidad grabación de electrodo EEG y análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento de aspartato y glutamato en el dializado. Este enfoque puede ser adaptado probar una variedad de drogas o enfermedad inducida por cambios de las concentraciones fisiológicas de aspartato y glutamato en el cerebro. Dependiendo de la disponibilidad de un ensayo analítico apropiado, puede utilizarse además para poner a prueba diferentes moléculas solubles al utilizar grabación de EEG al mismo tiempo.

Introducción

Para proporcionar la penetración en la debilitación funcional de mediada por glutamato excitatoria y la neurotransmisión inhibitoria GABAérgica resultando en convulsiones espontáneas en epilepsia de lóbulo temporal (ELT), supervisamos sistemáticamente las concentraciones extracelulares de GABA1 y más adelante los niveles de glutamato y aspartato2 por microdiálisis en el hipocampo ventral de ratas en varios momentos de la enfermedad natural curso, es decir, durante el desarrollo y progresión de la epilepsia. Tomamos ventaja del TLE pilocarpina modelo en ratas, que imita la enfermedad con mucha precisión en términos de cambios conductuales, electrofisiológico e histopatológico3,4 y correlacionamos la concentración del dializado de amino ácidos a sus diferentes fases: la fase aguda tras el insulto epileptogénica, la fase de latencia, el tiempo de la primera convulsión espontánea y la crónica phass5,6,7. Enmarcando las fases de la enfermedad fue habilitado por la supervisión del vídeo-EEG a largo plazo y la precisa EEG y caracterización clínica de las convulsiones espontáneas. Aplicación de la técnica de microdiálisis asociada a monitoreo video-EEG a largo plazo nos permitió proponer hipótesis mecanicistas de neuropatología TLE. En Resumen, la técnica descrita en este manuscrito permite el apareamiento de alteraciones neuroquímicas dentro de un área definida del cerebro con el desarrollo y progresión de la epilepsia en un modelo animal.

Dispositivos emparejados, formados por un electrodo de profundidad yuxtapuesto con una cánula de microdiálisis, a menudo se emplean en estudios de investigación de epilepsia donde cambios en los neurotransmisores y sus metabolitos, sustratos de energía deben ser correlacionados con la actividad neuronal. En la mayoría de los casos, se utiliza en comportarse libremente los animales, pero puede realizarse también de forma similar en los seres humanos, por ejemplo, en pacientes epilépticos fármaco-resistentes sometidos a investigación de electrodos de profundidad antes de la cirugía8. Grabación de EEG y recogida del dializado pueden realizarse por separado (por ejemplo, implantar el electrodo en un hemisferio y la microdiálisis la sonda en el otro hemisferio o incluso realizar el microdialysis en un grupo de animales mientras se realiza el EEG único en otro grupo de animales). Sin embargo, los electrodos de acoplamiento a las sondas puede tener múltiples ventajas: simplifica la cirugía estereotáctica, limita el daño a los tejidos a un sólo hemisferio (dejando la otra intacta, como un control para los estudios histológicos) y homogeneiza los resultados como estos se obtienen de la misma región del cerebro y el mismo animal.

Por otro lado, la preparación del dispositivo juntado microdialysis sonda electrodo requiere habilidades y tiempo si es hecho en casa. Uno podría pasar relativamente altas cantidades de dinero si comprado en el mercado. Por otra parte, cuando sondas de microdiálisis (puntas de prueba son típicamente 200-400 μm de diámetro y 7-12 mm de largo)9y los electrodos de EEG (puntas de los electrodos suelen ser de 300-500 μm de diámetro y el tiempo suficiente para llegar a la estructura cerebral de interés10) son junto, el dispositivo montado representa un objeto relativamente pesado y voluminoso en un lado de la cabeza, que es molesto para los animales y propensa a perder sobre todo cuando está conectado a la bomba de diálisis y el sistema de grabación de EEG de alambre duro. Este aspecto es más relevante en animales epilépticos que son difíciles de manejar y menos adaptables a las sesiones de microdiálisis. Las técnicas quirúrgicas adecuadas y cuidados postoperatorios adecuados pueden resultar en implantes de larga duración que causan mínimas molestias animales y deben ser perseguidos para experimentos de microdiálisis combinatoria-EEG10,11, 12.

Las ventajas y limitaciones de la técnica de microdiálisis han sido revisados en detalle por muchos neurocientíficos. Su principal ventaja sobre otras en vivo perfusión técnicas (p. ej., flujo rápido de vaivén o perfusión cortical Copa) es un pequeño diámetro de la sonda que cubre un área relativamente preciso de interés13,14, 15. En segundo lugar, la membrana de microdiálisis crea una barrera física entre el tejido y la solución; por lo tanto, sustancias de molecularidad elevada del peso no se cruzan y no interfieren con el análisis de16,17. Por otra parte, el tejido está protegido por el flujo turbulento de la solución18. Otra ventaja importante es la posibilidad de modificar el flujo de la solución para maximizar la concentración de analito en la solución (es decir, el proceso de microdiálisis pueden ser definido matemáticamente y puede ser modificado para alto rendimiento concentraciones del analito en la muestra)19. Por último, la técnica puede usarse para infundir los fármacos o sustancias farmacológicamente activas en los tejidos de interés y determinar su efecto en el sitio de intervención20. Por otro lado, microdiálisis tiene un tiempo de resolución limitada (típicamente más de 1 minuto por el tiempo necesario para recoger muestras) en comparación con los sensores electroquímicos o biológicos; es una técnica invasiva que causa daño a los tejidos; compromete el equilibrio neuroquímico en el espacio alrededor de la membrana debido al gradiente de concentración continua de todas las sustancias solubles que entra en la solución con el analito de interés. Por último, la técnica de microdiálisis está altamente influenciada por los límites de las técnicas analíticas empleadas para la cuantificación de sustancias en la solución9,21,22,23 . La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) después de la derivatización con orthophthaldialdehyde para el análisis de glutamato y aspartato en muestras biológicas ha sido bien validado24,25,26 , 27 y su amplia discusión está fuera del alcance de este manuscrito, pero los datos producidos mediante este método se describirá en detalle.

Cuando se realiza correctamente y sin modificaciones de la composición de la solución, microdialysis puede proporcionar información confiable sobre los niveles basales de la liberación de neurotransmisor. La mayor parte de los niveles básicos es probablemente el resultado del derrame de transmisor de la sinapsis9. Porque en muchos casos el muestreo simple del neurotransmisor en el espacio sináptico extra no es suficiente para perseguir los objetivos de la investigación, la técnica de microdiálisis se puede emplear también para estimular las neuronas o a privarlos de importantes fisiológicos iones como K+ o Ca2 +, con el fin de evocar o evitar la liberación del neurotransmisor.

Alta estimulación de K+ se utiliza a menudo en Neurobiología para estimular la actividad neuronal en animales despiertos, pero también en culturas primarias y organotypic. La exposición de un saludable del sistema nervioso central a las soluciones con altas concentraciones de K+ (40-100 mM) evoca la emanación de neurotransmisores28. Esta capacidad de las neuronas para proporcionar una versión adicional en respuesta a la alta K+ puede verse comprometida en animales epilépticos1 y en otras neurodegenerativas enfermedades29,30. Asimismo, el Ca2 + privación (obtenida por perfundiendo soluciones libres de Ca2 + ) se utiliza para establecer dependiente de calcio liberación de más neurotransmisores medidos por microdiálisis. Generalmente se cree que el comunicado dependiente de Ca2 + es de origen neuronal, mientras que sala independiente de Ca2 + origina de glia, pero muchos estudios levantado controversia sobre el significado de Ca2 +-medidas sensibles de p. ej. glutamato o GABA9: así, si es posible, es recomendable para apoyar estudios de microdiálisis microsensor estudios, ya que estos últimos tienen mayor resolución espacial y los electrodos permite acercarse a las sinapsis31.

Con respecto a los estudios de microdiálisis en animales epilépticos, es importante destacar que los datos obtenidos de la mayoría de ellos dependen de video o video-EEG monitoreo de asimientos, es decir, de la ocurrencia transitoria de signos o síntomas debido a la anormal excesiva o sincrónica actividad neuronal en el cerebro de32. Hay algunos detalles de asimientos electrográficos en animales de pilocarpina tratado que deben considerarse al preparar el experimento. Convulsiones espontáneas son seguidas por la deprimida actividad con frecuentes puntos interictales de EEG3 y ocurren en racimos33,34. Sham operados no epilépticos animales pueden exhibir actividad de asimiento-como35 y por lo tanto los parámetros para la evaluación de las grabaciones de EEG deben ser estandarizado36 y, si es posible, debe ser bien definido el calendario de sesiones de microdiálisis. Por último, le recomendamos siguiendo los principios y normas metodológicas para la supervisión del vídeo-EEG en roedores adultos control descrito por los expertos de la Liga Internacional contra la epilepsia y sociedad americana de la epilepsia en sus recientes informes37 ,38.

Aquí, describimos la microdiálisis de glutamato y aspartato en paralelo con las grabaciones de vídeo-EEG a largo plazo en animales epilépticos y su análisis en el dializado por HPLC. Haremos hincapié en los pasos críticos del protocolo que se debe cuidar para mejor resultado.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales han sido aprobados por la Universidad de Ferrara institucional Animal Care y Comité de uso y por el Ministerio italiano de salud (autorización: D.M. 246/2012-B) según las directrices esbozadas en las comunidades europeas Directiva del Consejo de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE). Este protocolo está ajustado específicamente para la determinación de glutamato y aspartato en cerebro de rata dialysates obtenido bajo control EEG de microdialysis sesiones en ratas epilépticas y no epilépticas. Muchos de los materiales aquí descritos pueden reemplazarse fácilmente por las que uno utiliza en su laboratorio para las grabaciones de EEG o microdiálisis.

1. montaje del dispositivo de electrodos sonda de microdiálisis

  1. Utilizar un electrodo de 3 canales retorcidos de dos (con al menos un 20 mm corte largo del electrodo de registro y un 10 cm de largo de tierra electrodo) y acoplarla a una cánula guía para preparar el dispositivo. Ver ejemplos de cánula guía y electrodo de 3 canales para diálisis en figura 1A-1B.
  2. Quitar (figura 1) e introducir (figura 1) la cánula guía de metal en la cánula de plástico simulada un par de veces antes del uso para facilitar su remoción en el momento de su interruptor para sonda de microdiálisis en el animal.
  3. Doblar los cables trenzados de registrar electrodo dos veces (Figura 1E-1F) con el fin de alinear los cables con la cánula de maniquí de la guía y corte la punta del electrodo (figura 1) a ser 0,5 mm más largo que la punta de la cánula de la guía (figura 1 H) utilizando la pinza digital.
  4. Tenga a mano el anillo de silicona largo 1 mm (diámetro 2 m m, grueso de 0.3 mm; Figura 1I) e inserte la punta de la cánula de la guía y la punta de los electrodos torcidos en el anillo de silicona con las pinzas (Figura 1J). Arreglarlo en el pie de la guía de pedestal de cánula con adhesivo de polímero de resina (figura 1 K) o de acción rápida. Vea el ejemplo de los dispositivos terminados en 1 L de la figura y figura 2A.
  5. Esterilizar el dispositivo bajo la luz UV germicida para 4 h. vuelta el dispositivo cuatro veces así como cada uno de sus lados está expuesto a la luz durante 1 hora.
    Nota: Muchas sondas electrodos y microdiálisis caseros pueden ensamblarse en una manera similar. La cabeza de arriba descrito implantes para las ratas tiene las siguientes dimensiones: ancho 7 mm x 5 mm profundidad x 10 mm de longitud de la tapa al pedestal del dedo del pie; la punta del implante es aproximadamente 11 mm de largo, 600 μm de diámetro y el dispositivo pesa unos 330-360 mg. El dispositivo puede ser reutilizado dos o tres veces si (i) una suficiente longitud del electrodo de tierra se deja en el cráneo durante la cirugía para el siguiente uso y (ii) cuando el animal es sacrificado, y el dispositivo recuperado junto con el cemento dental se deja en acetona overnigh t, tal que el cemento puede desglosarse mecánicamente, y el dispositivo de lavado y esterilizado nuevamente.

2. cirugía estereotáctica

  1. Utilice un estereotáxicas aparatos y sonda clip soporte (figura 2B) para la implantación de dispositivo siguiendo los estándares contemporáneos para cirugías asépticas y sin dolor39,40,41.
    1. Anestesiar el ratas Sprague-Dawley adultas con mezcla de ketamina/xilacina (43 mg/kg y 7 mg/kg, i.p.) y fijarla en el chasis estereotáxicas. Añadir anestesia isoflurano (1,4% en aire; 1,2 mL/min) a inyección de ketamina/xilacina inicial ya que permite controlar la profundidad de la anestesia en tiempo. Afeitar el pelo en la cabeza del animal.
  2. Torunda la superficie de la piel cabeza por solución de yodo seguido de etanol al 70% para prepararse para la cirugía aséptica39.
    1. Implante el dispositivo de electrodos cánula guía preparado en precedencia (1.1 – 1.5) en el hipocampo ventral derecho utilizando las coordenadas siguientes: barra de nariz + 5,0 mm, A-3,4 mm, L 4,5 mm, P + 6,5 mm a bregma1,2. Siga las técnicas estándar para cirugías estereotáxicas10,11,12.
    2. Asegúrese de que no cubre los tornillos de anclajes. Al montar en el aparato estereotáxicas, sujete el dispositivo para la cabeza de la cánula guía como esto puede alinear fácilmente con el porta sondas.
  3. Anclar el aparato a la calavera con al menos cuatro tornillos de acero inoxidable en el hueso del cráneo (1 tornillo en el tornillo izquierdo y 1 en las placas del hueso frontal derecho, 1 tornillo en el parietal izquierdo y 1 tornillo en las placas de hueso interparietal). Añadir una gota de pegamento de tejido más fijar los tornillos en el hueso del cráneo.
    1. Cubrir la mitad de la rosca con el cemento de metacrilato. Promover a la Unión del cemento haciendo surcos poco profundos en el hueso para aumentar la adherencia.
  4. Una vez que la punta del dispositivo se coloca en el tejido cerebral, tuerza el alambre del electrodo de tierra de alrededor de 3 tornillos de anclaje. Cubre tornillos todo montados y el dispositivo con el cemento dental12,42,43.
  5. Monitorear los animales durante la cirugía y durante aproximadamente 1 hora después de eso hasta en posición vertical y moviéndose alrededor de la jaula. Mantenerlos en una cubierta térmica de colchón para evitar la hipotermia. Permitir que las ratas recuperar por lo menos 7 días después de la implantación del dispositivo.
  6. Monitorear los animales al menos una vez al día durante 3 días después de la cirugía para detectar signos de dolor o angustia. Proporcionan los animales con la crema antibiótica (gentamicina 0,1%) cerca del sitio Incisa para prevenir la infección y un analgésico (tramadol 5 mg/kg, i.p.) por 3 días prevenir el dolor post-surgical.

3. Lóbulo Temporal epilepsia inducción por pilocarpina y cesión de animales a los grupos experimentales

  1. Después de una semana de recuperación post-quirúrgica, asignar al azar los animales a grupos: (i) control animales recibiendo vehículo y (ii) epilépticos animales que recibirán pilocarpina. Uso un número proporcionalmente mayor de animales epilépticos Grupo puesto que no todos los de la pilocarpina administraron a ratas desarrollarán la enfermedad.
  2. Inyectar una dosis de methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) y 30 minutos después, una sola inyección de pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) para inducir el estado epiléptico (SE). Inyectar methylscopolamine y el vehículo (solución salina) a las ratas control. Utilice jeringa de 1 mL con aguja 25G para todas las administraciones de i.p..
    1. Comprobar visualmente los animales para comenzar a tener convulsiones conductuales (vibrisas dentro de 5 min, asintiendo con la cabeza, las extremidades de la clonación en movimiento) y dentro de 25 min para clonar continuamente todo el cuerpo (SE).
  3. Detener la SE 2 h después del inicio que tienen una mortalidad alrededor del 25% y un período de latencia promedio de aproximadamente 10 días por la administración de diazepam (20 mg/kg, i.p.). Observar y registrar cualquier principio de comportamiento de ataque inmediatamente después de la inyección de pilocarpina y continuar durante al menos 6 h después de eso.
  4. Dan la animales una solución salina (1 mL, i.p.) con jeringa de 1 mL de solución con aguja y sacarosa de 25G (1 mL, p.o.) usando jeringa de 1 mL y aguja de 17G alimentación flexible para 2-3 días después SE para promover la recuperación de la pérdida de peso corporal.
    1. Excluir a los animales que no alcanzan el peso inicial en la primera semana después de pilocarpina SE del estudio (excepto el grupo aguda matado a 24 h después de SE, donde no es posible el peso corporal de seguimiento).
  5. Asignar animales post-SE al azar a diferentes grupos experimentales (figura 3): aguda fase (donde el microdialysis ocurre 24 horas después de SE), latencia (7-9 días después de SE), primera crisis espontánea (aproximadamente 11 días después de SE) y crónica (período se inicia cerca de 22 a 24 días después de SE, es decir, 10 días después de la primera crisis convulsiva). Seguimiento de los animales para la ocurrencia de convulsiones espontáneas.
    Nota: Utilice los siguientes criterios de inclusión y exclusión para otros experimentos en ratas epilépticas: desarrollo de Convulsivo dentro de 1 h después de la administración de pilocarpina; el aumento de peso en la primera semana después de la SE y la correcta posición de la sonda de microdiálisis y electrodo.

4. epilepsia comportamiento monitoreo y análisis

  1. Monitoreo a largo plazo del comportamiento epiléptico
    1. Aproximadamente 6 h después de la administración de pilocarpina (es decir, al final de la observación directa de los investigadores), colocar los animales en las jaulas limpieza hogar y empezar la videovigilancia 24 h.
    2. Seguir el video 24 h seguimiento hasta el día 5, mediante un sistema de videovigilancia.
    3. Empezando por el día 5, conectar las ratas en sus casa jaulas rectangulares al sistema de grabación de EEG atada y continuar la videovigilancia 24 h.
    4. Conjunto de los parámetros del amplificador colocado fuera de la jaula de Faraday (factor de ajuste de la amplificación en cada canal de acuerdo a la especificidad de la señal EEG de cada animal individual) y la adquisición de inicio el EEG observar la señal de EEG producidos por cables. Uso el muestreo tasa de 200 Hz y baja pasar filtros de 0,5 Hz.
    5. Conectar el animal cables sosteniendo la cabeza de un animal entre dos dedos se extendía de un lado y atornillar abajo los conectores en el pedestal del electrodo con la otra mano libre. Empezar la adquisición.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la señal está libre de artefactos. Artefactos comunes son los picos muy superior a la escala.
    6. Un día antes de las microdiálisis experimentan, transferir los animales en el sistema EEG tethered equipado con cilindros de plexiglás de microdiálisis. Desconecte los animales del EEG tethering sistema en jaula casa atornillar para arriba de los conectores de los electrodos sin refrenar el animal. Coloque el animal en los cilindros de plexiglás alta.
  2. Monitoreo del comportamiento epiléptico un día antes y durante la sesión de microdiálisis
    1. Encienda el amplificador colocado fuera de la jaula de Faraday. Abra el software de EEG. Iniciar la adquisición de EEG observar la señal de EEG producida por cables no conectados.
    2. Conectar el animal con el sistema de grabación de EEG atado sosteniendo la cabeza de un animal entre dos dedos se extendía de un lado y atornillar abajo los conectores en el pedestal del electrodo con la otra mano libre. Establecer un factor de amplificación (ganancia) en cada canal de amplificador según la señal del electrodo de animal solo para que la señal de EEG es a escala. Deje que el animal explora la nueva jaula (cilindro) al menos 1 h bajo la observación directa del investigador.
    3. Nota: 24 h antes de la microdiálisis experimento, las ratas son brevemente anestesiadas con isoflurano para el cambio de cánulas guía con sonda de microdiálisis. Aprovechar el momento cuando están anestesiados para conectar el sistema de grabación de EEG.
    4. Acortar o prolongar cable pendular según la materia del animal. Asegúrese de que los cables no interfieran con los movimientos del animal y la postura de mentira.
    5. Compruebe que la estructura de la imagen correcta de las cámaras de vídeo. Iniciar la grabación de vídeo-EEG.
  3. Identificación de la actividad EEG y convulsiones
    1. Utilice un reproductor de software para ver los videos. Desplazarse la película 8 veces más rápido que el tiempo real jugando e individualiza las convulsiones generalizadas (véase animal hacia atrás con clonus del miembro anterior o animal cría y caer con clonus del miembro anterior). Ralentizar el video y anote la hora exacta del inicio y del final de la incautación de comportamiento.
    2. Proceso los datos contando el número de convulsiones generalizadas en 24 h de videos registros y expresarlos en términos de frecuencia de las crisis y la duración media de todas las convulsiones observadas en 24 h.
    3. Definir las convulsiones EEG como los períodos de actividad paroxística de alta frecuencia (> 5 Hz) caracterizado por un > 3-fold incremento de amplitud en referencia con la progresión de la frecuencia de pico que dura un mínimo de 3 s2,44 o similares28. Utilizar software de EEG para procesar el crudo grabaciones de EEG. Los rastros de EEG se dividió en fracciones de 1 h. Copiar las fracciones de trazo de EEG para software de análisis de punto automática.
    4. Analizar los datos de actividad EEG utilizando software de EEG y parámetros predefinidos (4.3.3.). Llevar a cabo todos los análisis de videos en dos investigadores independientes que son ciegos para el grupo de los animales analizados. En caso de divergencia, hacer que vuelva a examinar los datos para llegar a un consenso45.

5. Microdialysis

  1. Recuperación de punta de prueba in vitro
    1. Preparar la sonda para su primer uso según las instrucciones del fabricante, manejo en su funda protectora.
    2. Ejecutar el experimento por triplicado: preparar tres tubos de ensayo 1.5 mL carga con 1 mL de solución de Ringer, que contiene la mezcla de estándares (2,5 μm de glutamato) y 2,5 μm de aspartato. Poner tres tubos de ensayo de carga de 1,5 mL en el sistema de bloque calentador de 37 ° C y colocar en el agitador.
      Nota: Utilizar las mismas soluciones estándar para calibración de cromatografía.
    3. Sello de las probetas de 1,5 mL con la película de parafina y puntura por pinzas afiladas para hacer un agujero de aproximadamente 1 mm de diámetro.
    4. Tome la sonda y en el orificio hecho en la película de parafina. Sumergir la membrana en menos de 2 mm bajo el nivel de solución. Más fijar la sonda al tubo de ensayo 1.5 mL por la película de parafina.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la punta no toque las paredes del tubo de prueba de 1,5 mL.
    5. Conecte la entrada de la sonda con la jeringa montada en la bomba de infusión usando los adaptadores de la tubería de FEP y tubo. Opcionalmente, uso fino diámetro tubería de polietileno de 0,28 mm ID y 0,61 mm OD y adaptadores de tubo color (adaptadores de tubo rojo y azul) para las conexiones.
    6. Arrancar la bomba a 2 μl/min y deje que el líquido la punta del enchufe. Conecte la salida de la sonda a los 0,2 mL tubo de prueba usando los adaptadores de la tubería de FEP y tubo de recogida.
      Nota: Use tubería de FEP para todas las conexiones. Corte la longitud deseada de tubería mediante el uso de una cuchilla de afeitar. Utilizar adaptadores de tubería de diferente color para entrada y salida de la sonda. Deje que la bomba funcione durante 60 minutos Compruebe si hay fugas y burbujas de aire. Estos no deben estar presentes.
    7. Ajustar la bomba a la tasa 2 μl/min de flujo y comienzan a recolectar las muestras a la salida de la tubería.
    8. Recoger tres muestras de fluido para perfusión de 30 minutos y tres muestras de igual volumen de la solución en el tubo de prueba de 1,5 mL. Tomar las muestras de igual volumen de la probeta de 1.5 mL cada 30 minutos con la microjeringa inmerso en la solución estándar en el tubo de prueba de 1,5 mL.
    9. Repita el experimento (5.1.1-5.1.8) configuración de la bomba al flujo tipo 3 μl/minuto (5.1.7) para tener una comparación de recuperación de la sonda cuando se utiliza dos tipos de flujo de perfusión diferentes.
    10. Cuando termine, apague la bomba y enjuague el tubo con agua destilada, etanol al 70% y empuje el aire. Guarde la sonda en un frasco llenado de agua destilada. Enjuague la sonda por perfundiendo a 2 μl/min de agua destilada previo al almacenamiento.
    11. Analizar la concentración del glutamato y aspartato en las muestras por cromatografía (ver detalles abajo; 6.3).
    12. Calcular la recuperación mediante la siguiente ecuación:
      Recuperación (%) = (Csolución /Cdiálisis debido a solución) x 100.
  2. Sesiones de microdialysis en mover libremente las ratas
    1. Procedimientos preparatorias: inserción de la sonda y pruebas, infusión de ajuste de la bomba y comenzar
      1. Preparar las sondas de microdiálisis para el primer uso según las instrucciones del fabricante y rellenarlas con solución de Ringer. Cortar unos 10 cm. largo de la tubería de FEP y unirlos con cánulas de entrada y salida de la sonda con los adaptadores de tubería de diferentes colores.
      2. Asegúrese de que el tubo toque los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones.
      3. 5.2.1.3. 24 h antes del experimento de microdiálisis, anestesiar brevemente al animal con isoflurano (5% en aire) en una cámara de inducción hasta reclinada. Retire la cánula ficticia de su guía de uso de las pinzas y sujeta firmemente la cabeza del animal. Inserte la sonda de microdiálisis, dotada de una membrana de diálisis, en la cánula de guía y empresa más las cánulas de microdialysis insertadas en su guía de modelado en arcilla.
        PRECAUCIÓN: No permita que la sonda toque las paredes de la funda protectora sonda extracción.
      4. Poner el animal en el cilindro de plexiglás y se deja explorar el nuevo ambiente. Conectar el animal para el sistema de grabación de EEG anclado como se describió anteriormente (siga los puntos 4.2.2 y 4.2.3).
      5. Siga la despierto y moviéndose libremente movimientos de rata y conecte la entrada de la sonda con la jeringa de 2,5 mL con aguja de 22G blunted con solución de Ringer usando los adaptadores de la tubería. Empujar la solución de Ringer en la sonda de expulsión 1 mL de solución de Ringer en 10 s continuamente empujando el émbolo de la jeringa de 2,5 mL. Busque la gota de líquido que aparecen en la salida. La sonda está ahora lista para su uso.
      6. Llene las jeringas de 2,5 mL conectadas a la tubería de FEP por adaptadores de tubería con solución de Ringer y montarlos en la bomba de infusión. Arrancar la bomba a 2 μl/min. Déjela funcionar durante la noche.
        Nota: Utilizar la longitud deseada de tubería de FEP todo pero calcular el volumen muerto de la tubería para saber cuándo se debe iniciar la alta estimulación K+ y correlacionar los datos de cuantificación con cambios neuroquímicos en el cerebro animal. Utilice la burbuja de aire en la tubería bajo el flujo de trabajo para calcular este tiempo.
    2. Recogida de muestras durante la grabación y potasio la estimulación del EEG
      1. Verificar la ausencia de convulsiones en lo 3 h previo al inicio de la recogida de muestras (las grabaciones de video-EEG) y seguir vigilando la actividad de asimiento durante microdialysis.
      2. Parar la bomba con las jeringas de FEP-tubería canulada llenadas con solución de Ringer. Montaje en el otro juego de jeringas de 2,5 mL de la bomba conectado a tubería de FEP con adaptadores de llenado con la solución de un timbre modificado que contiene 100 mM de la tubería K+ solución.
      3. Arrancar la bomba a 2 μl/min y deje que se ejecute. Para llenado más rápido de la tubería, coloque la bomba en 5 μl/min para el tiempo de llenado. Comprobar la ausencia de burbujas de aire en el sistema. Asegúrese de que el tubo toque los adaptadores sin espacio muerto en todas las conexiones.
      4. Prueba de la sonda si listo para su uso en animales como se describe anteriormente (5.2.1.5).
        Nota: Si por alguna razón la sonda no funciona, cámbialo. Para estos casos, mantener unos sondas de microdiálisis preparado listas para su uso cerca de la estación de trabajo de microdiálisis-EEG. Desconecte el animal de cables EEG y anestesiar brevemente con isoflurano si es necesario realizar el cambio.
      5. Conecte la tubería de FEP de jeringas de llenado con solución de Ringer a la cánula de entrada de la sonda en cada animal y esperar la aparición de la gota del líquido en la punta de la salida.
      6. Conecte la salida de la sonda en la tubería de FEP, que conduce a la colección en el tubo de ensayo. Inserte la tubería de FEP en el tubo de ensayo 0,2 mL cerrados con un tapón perforado. Asegúrese de que el tubo permanece en el lugar mediante la fijación con un pedazo de arcilla de modelado.
      7. Continuar a funcionar la bomba a 2 μl/min durante 60 min sin recoger muestras para equilibrar el sistema (cero muestra).
      8. Recoger las 5 muestras consecutivos 30 min del dializado (volumen respectivo de 60 μL) bajo las condiciones iniciales (perfusión con solución de Ringer normal). Almacenar las muestras en hielo.
      9. Calcular el tiempo que toma líquido para pasar de la bomba en la cabeza del animal (depende de volumen muerto de la tubería, es decir, tiempo de la burbuja de aire) y cambiar la tubería de FEP que va desde las jeringas con solución de Ringer normal a las jeringas que contienen modificado solución de Ringer (100 mM K+) en este momento sin detener la bomba. Comprobar la ausencia de las burbujas de aire en el sistema. Deje que la bomba funcione durante 10 minutos.
        PRECAUCIÓN: En 10 minutos de alta estimulación de K+ , los animales tienden a moverse frenéticamente y suelen presentar un gran número de perro mojado batidos (control de animales de cluster de incautación) o convulsiones conductuales (animales epilépticos), así que listos para intervenir a Proteja los tubos y los cables de torsión.
      10. Después de 10 minutos, cambiar el tubo de la jeringa que contiene 100 mM K+ Ringer solución a solución de Ringer normal y deje que la bomba funcione. No apague la bomba durante los cambios de la solución para que exista una gota del líquido en el extremo de la tubería a conectar en línea.
      11. Desde el momento en el que el dializado contiene potasio alto, es decir, después de la colección del Quinta tras conseguir el equilibrio del dializado, se recogerán las fracciones del dializado cada 10 minutos (20 μl) para las muestras del dializado de 1 h. 3 recoger de 30 min adicionales y detener la bomba. Almacenar las muestras en hielo.
      12. Almacenar las muestras a-80 ° C después del experimento hasta el análisis de HPLC.
      13. Repita el que experimentan de las microdiálisis durante 3 días consecutivos, excepción de la aguda (24 h) y el primer grupo de ataque, en que sola microdialysis sesión ocurre 24 horas después SE o dentro de 24 h después de la primera convulsión espontánea (figura 3).
      14. Al finalizar cada experimento, eutanasia al animal con una sobredosis de anestésico y quitar el cerebro para la verificación de la colocación de la sonda y el electrodo.
  3. Procedimientos post-microdialysis
    1. Enjuague las sondas de microdiálisis usado con agua destilada y guardar en un frasco llenado con agua destilada hasta el próximo uso.
      Nota: Las membranas reutilizadas pueden presentar una mayor permeabilidad; Compruebe que la recuperación de la sonda antes de su uso repetido.
    2. Enjuague el microdialysis todo configurado (tubería, conectores y jeringas) con agua destilada, seguido de etanol al 70%. Sustituir el etanol por aire y acumular el conjunto en un ambiente estéril.
    3. Dividir las muestras de dializado basals en 20 fracciones μl y fracción de solo 20 μl para análisis de la concentración basal de aminoácidos. Almacenar el volumen restante de la muestra para el análisis confirmatorio o más a-80 ° C.
    4. Fijar los cerebros en formol al 10% y preservarlos por inclusión en parafina1. Coronal, sección los cerebros en rodajas y tinción con hematoxilina y eosina. Examinar el cerebro para la sonda correcta y electrodo colocación1,2.
      Nota: Fijar los cerebros de 2-Metilbutano enfriado y almacenar a-80 ° C. Utilizar cualquier otra coloración probada en las secciones de tejido nervioso que permite visualizar la zona de punta de prueba y el electrodo.

6. Análisis de cromatografía de glutamato y aspartato

  1. Preparación de derivatizando agente
    1. Mezclar los volúmenes respectivos 20:1 (v/v) de reactivo de orthophthaldialdehyde (OPA) y 2-Mercaptoetanol (5-ME) en el frasco. Cerrar la cubeta con el tabique estrecha tapa y el aire.
      PRECAUCIÓN: Trabajar debajo de la campana química.
    2. Vórtice de la solución preparada y ponerlo en el inyector automático en la posición para derivatizando agente.
  2. Preparación de muestras de dializado
    1. Poner el inserto de vidrio con el resorte inferior en el frasco muestreador automático marrón de 2 mL. Preparar los frascos para las muestras en un lote.
    2. Tomar las muestras de diálisis 20 μl del congelador de-80 ° C y dejarlos derretir. Retirar 1 μl de la solución y añadir 1 μl de estándar interno (IS) L-Homoserina (50 μm) a 19 μl de la muestra, por lo tanto la muestra contiene 2.5 μm de es. Pipetear 20 μl de la muestra de diálisis en el inserto de vidrio en el frasco y sellarlo con un tabique hermético.
    3. Coloque los frascos que contienen las muestras en el muestreador automático, usando el software cromatográfico para etiquetar las muestras en sus posiciones.
  3. Análisis cromatográfico de las muestras para determinar la concentración de glutamato y aspartato
    1. Ejecutar los análisis en el sistema de cromatografía líquida con detección spectrofluorometric. Detectar los aminoácidos después de 2 min columna previa derivatización con 20 μL de orthophthaldialdehyde/5-mercaptoetanol 20:1 (v/v) agregado a 20 μL de muestra.
    2. Preparar el sistema para análisis de aminoácidos. Conecte el inyector automático, la bomba, el desgasificador, el detector y unidad de control junto con la computadora.
    3. Sumerja los sifones en las botellas que contienen la fase móvil y limpiar los canales de la bomba cromatográfica para el análisis.
    4. Empieza a aumentar el flujo de la fase móvil de control de la presión en la columna (por ejemplo, empezar a 0,2 mL/min y aumentar el flujo adicional 0,2 mL/min cada 5 min hasta alcanzar el flujo de trabajo). Deje el sistema en funcionamiento flujo de 0.8 mL/min durante al menos 1 h equilibrar la columna.
      PRECAUCIÓN: Presión inestable indica la presencia de aire en el sistema. La presión no debe exceder 25 MPa.
    5. Ajustar la ganancia, alta sensibilidad y las longitudes de onda de excitación y emisión en el detector a 345/455 nm respectivamente. Restablecer la señal del detector (AUTOZERO).
    6. Utilizando el software cromatográfico, envíe el método para el instrumento. Ahora, el cromatógrafo debe ser listo para medir.
    7. Separar las muestras de dializado, estándar tacon muestras de dializado como normas (0.25 μm – 2,5 μm aspartato y glutamato en solución de Ringer) en la columna cromatográfica apropiada. Calibrar el método cromatográfico y establecer los límites de detección y cuantificación antes de cualquier análisis de las muestras de la diálisis.
    8. Activar el análisis individual o crear la secuencia de las muestras a ser analizadas mediante el software de cromatografía y ejecutar la secuencia.
      PRECAUCIÓN: Ejecutar más de una muestra en blanco y diferentes muestras estándar dentro de la secuencia de muestras de dializado para controlar la exactitud del método.
    9. Una vez que se adquieren los cromatogramas, analizarlas con el software de cromatografía. Verificar la integración de los picos de interés en la trama de la calibración. Utilizar pico alto o pico para la cuantificación.
    10. Una vez terminada la grabación muestra llene la columna y el sistema con un disolvente orgánico (por ejemplo, 50% acetonitrilo en agua ultrapura) para evitar su envejecimiento y molde crecimiento en él.
    11. Apagar el sistema.

Resultados

Recuperación de la sonda

La recuperación media (es decir, el contenido medio del aminoácido en la solución como un porcentaje del contenido en un volumen igual de la solución vial) era 15.49 ± 0,42% a un caudal de 2 μL/min y 6.32 ± 0,64 a 3 μL/min para glutamato y 14.89 ± 0,36% a un caudal de 2 ΜL/min y 10.13 ± 0,51 a 3 μL/min para aspartato cuando se usa la sonda de membrana cuprophane. Si se utiliza la sond...

Discusión

En este trabajo mostramos cómo se puede realizar una grabación continua de vídeo-EEG juntada con microdiálisis en un modelo experimental de ELT. Técnicas de grabación de vídeo-EEG se utilizan para diagnosticar correctamente las distintas fases de la progresión de la enfermedad en los animales y la técnica de microdiálisis se utiliza para describir los cambios en la liberación de glutamato que ocurren en el tiempo (no hay cambios se han encontrado para aspartato en un estudio previamente publicado

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Anna Binaschi, Paolo Roncon y Eleonora Palma por su contribución a manuscritos publicados en precedencia.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
3-channel two-twisted electrodeInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPCMaterial
guide cannulaAgn Tho's, Lindigö, SwedenMAB 4.15.ICMaterial
Resin KK2 PlastikElettra Sport, Lecco, ItalyKK2Material
Super Attack gel LoctiteHenkel Italia Srl, Milano, Italy2047420_71941Material
Imalgene-KetamineMerial, Toulouse, France221300288 (AIC)Solution
XylazineSigma, Milano, ItalyX1251Material
Isoflurane-VetMerial, Toulouse, France103120022 (AIC)Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadolFormevet, Milano, Italy103703017 (AIC)Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycineMSD Italia, Roma, Italy20891077 (AIC)Material
simplex rapid dental cementKemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United KingdomACR811Material
GlasIonomer CX-Plus CementShofu, Kyoto, JapanPN1167Material
probe clip holderAgn Tho's, Lindigö, Swedenp/n 100 5001Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin AdhesiveTissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USATS1050044FPMaterial
Valium 10 mg/2 ml - diazepamRoche, Monza, Italy019995063 (AIC)Material
1 mL syringe with 25G needleVetrotecnica, Padova, Italy11.3500.05Material
rat flexible feeding needle 17GAgn Tho's, Lindigö Sweden7206Material
Grass Technology apparatusGrass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USAM665G08Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150Biopac, Goleta, California, USAMP150WSWEquipment
digital video surveillance systemAverMedia Technologies, Fremont, California, USAV4.7.0041FDEquipment
microdialysis probeAgn Tho's, Lindigö SwedenMAB 4.15.1.CuMaterial
microdialysis probeSynaptech, Colorado Springs, Colorado, USAS-8010Material
block heaterGrant Instruments, Cambridge, EnglandQBD2Equipment
stirrerCecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy711Equipment
infusion pumpUniventor, Zejtun, Malta864Equipment
fine bore polythene tubingSmiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA800/100/100/100Material
blue tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1002Material
red tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1003Material
2.5 mL syringe with 22G needleChemil, Padova, ItalyS02G22Material
vial capCronus, Labicom, Olomouc, Czech RepublicVCA-1004TB-100Material
septumThermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USANational C4013-60 8 mm TEF/SIL septumMaterial
glass insert with bottom springSupelco, Sigma, Milano, Italy27400-UMaterial
autosampler vialNational Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, ItalyC4013-2Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unitKnauer, Berlin, GermanyV7602Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pumpKnauer, Berlin, GermanyV7603Equipment
spectrofluorometric detectorShimadzu, Kyoto, JapanRF-551Equipment
chromatogrphic columnKnauer, Berlin, Germany25EK181EBJMaterial
chromatogrphic pre-columnKnauer, Berlin, GermanyP5DK181EBJMaterial
mobile phase solution A0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0Solution
mobile phase solution B40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5Solution
Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
modified Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
saline0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0Solution
sucrose solution10% sucrose in distilled waterSolution

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