저자
연락처

로그인

JoVE 비디오를 활용하시려면 도서관을 통한 기관 구독이 필요합니다. 전체 비디오를 보시려면 로그인하거나 무료 트라이얼을 시작하세요.

기사 소개

  • 요약
  • 초록
  • 서문
  • 프로토콜
  • 결과
  • 토론
  • 공개
  • 감사의 말
  • 자료
  • 참고문헌
  • 재인쇄 및 허가

요약

여기, vivo에서 microdialysis 뇌 파 기록 함께에서 간 질 및 간 질 비 쥐의 복 부 해 마에 aspartate 및 조미료 자료를 분석 하는 방법을 설명 합니다. Extracellular 농도 aspartate 및 조미료의 질병의 다른 단계와 상관 될 수 있습니다.

초록

Microdialysis은 동작 또는 병리학 (예를 들어, 발작의 특정 결과와 뇌 틈새 공간으로 확산 하는 신경학 활성 물질의 변화를 상관 관계가 확고 신경 과학 기법 대 한 간 질). 간 질을 공부, microdialysis 기술 단기 또는 장기 심지어 비디오-electroencephalography (뇌 파) 자발적인 발작 빈도, 심각도, 진행 및 클러스터링을 평가 하기 위해 모니터링 종종 결합 됩니다. 결합 된 microdialysis 뇌 파 여러 메서드 및 악기의 사용을 기반으로 합니다. 여기, 우리가 쥐 모델에서 간 질의 자연 역사의 여러 단계에서 시간이 지남에 모니터 조미료와 aspartate 유출 녹음 지속적 비디오 뇌 파 vivo에서 microdialysis를 수행. 결합 된 이렇게 페어링 신경 전달 물질 방출에 변화 질병 개발 및 진행의 특정 단계를 수 있습니다. Dialysate는 아미노산 농도 액체 크로마토그래피에 의해 결정 되었다. 여기, 우리가 설명 방법 및 개요 주 예방 조치 한 비보에 microdialysis 동안 해야한다-stereotaxic 수술에 특히 주의 microdialysis, 깊이 중 기저 및 높은 칼륨 자극 뇌 파 전극 뇌 파 기록 및 aspartate 및 조미료는 dialysate에 고성능 액체 크로마토그래피 분석. 이 방법을 적용할 수 있습니다 aspartate 및 두뇌에 조미료의 생리 적 농도의 변화를 유도 하는 약물 이나 질병의 다양 한 테스트. 적절 한 분석 분석 결과의 여부에 따라 그것은 사용할 수 있습니다 더 이상 뇌 파 기록을 동시에 채용 하는 경우 다른 수용 성 분자를 테스트 하.

서문

기능 장애 조미료-중재 흥분 성의 GABAergic 금지 neurotransmission 측 두 엽 간 질 (TLE)에 자발적인 발작의 결과에 대 한 통찰력을 제공 하려면 우리는 체계적으로 extracellular 농도의 모니터링 GABA1 와 나중 자연 질병의 다양 한 시간 포인트에서 쥐의 복 부 해 마에 있는 microdialysis에 의해 조미료와 aspartate2 수준 과정, 즉, 개발 및 간 질의 진행 하는 동안. 우리는 TLE pilocarpine 모델 쥐, 모방 행동, electrophysiological 및 histopathological 변경3,4 면에서 매우 정확 하 게 질병을 이용 했다 그리고 우리 상관의 아미노 dialysate 농도 그것의 다른 단계에 산: epileptogenic 모욕, 대기 시간 단계, 첫 번째 자발적인 발작과 만성 phass5,,67시간 후 급성 단계. 질병 단계 프레임 장기 비디오-뇌 파 모니터링 및 정확한 뇌 파 및 자발적인 발작의 임상 특성에 의해 활성화 되었습니다. Microdialysis 기술에의 응용 프로그램은 장기 비디오-뇌 파 모니터링 TLE neuropathology에 대 한 기계적 가설을 제안 하 연관. 요약 하자면,이 원고에 설명 된 기술을 neurochemical 변경 개발 및 간 질 동물 모델에서의 진행으로 정의 된 뇌 영역 내에서 쌍 수 있습니다.

이점된 장치, microdialysis 정에 juxtaposed 깊이 전극의 구성 종종 간 질 연구 연구 신경 활동에 신경 전달 물질, 그들의 대사 산물, 또는 에너지 기질 변화 한다 상관 하는 어디에서 채택 된다. 대부분의 경우 그것은 자유롭게 행동 하는 동물에서 사용 하지만 그것은 또한 예를 들어, 수술8전에 깊이 전극 조사 수립이 저항 간 질 환자에서 인간의 비슷한 방식으로 지휘 될 수 있다. 뇌 파 기록 및 dialysate 컬렉션은 별도로 수행할 수 있습니다 (예를 들어를 한 반구에는 microdialysis 전극 이식도 수행 하는 동안 동물의 한 그룹에는 microdialysis을 수행 또는 다른 반구에 프로브 유일한 뇌 파 동물의 또 다른 그룹에). 그러나, 프로브를 전극 커플링 여러 장점을 있습니다: stereotaxic 수술을 간소화, 한 반구 조직 손상을 제한 (다른 하면서 조직학 연구에 대 한 제어로 그대로), 그리고이 결과 homogenizes 같은 뇌 영역 고 같은 동물에서 얻을 수 있습니다.

다른 한편으로, 그것은 집에서 만든 경우 기술 및 시간 결합 된 microdialysis 프로브 전극 장치 준비 해야 합니다. 하나는 시장에서 구입한 경우 상대적으로 높은 금액을 보낼 수 있습니다. 또한 때 microdialysis 프로브 (프로브 팁 직경 및 길이가 7-12 mm에서 200-400 µ m는 일반적으로)9및 EEG 전극 (전극 팁은 일반적으로 300-500 µ m의 직경, 및 충분히 관심10의 뇌 구조에 도달) 결합 하 여, 탑재 된 장치는 동물을 위해 번잡 하 고 특히 연결 하면 투 석 펌프 및 하드 와이어 EEG 레코딩 시스템 손실 될 경향이 머리의 한쪽에 크고 상대적으로 무거운 개체를 나타냅니다. 이 측면은 처리 하기 어렵고 덜 microdialysis 세션에 적응형 간 질 동물에 더 적합 합니다. 적절 한 수술 기법 및 적절 한 수술 치료는 최소한의 동물 불편을 일으키는 원인이 되 고 조합 microdialysis-뇌 파 실험10,11, 에 대 한 추구 되어야 오랫동안 임 플 란 트에 발생할 수 있습니다 12.

장점과 한계 microdialysis 기술의 세부 사항에 많은 신경 과학자에 의해 평가 되었습니다. 그것의 주요 장점은 다른 비보에 관류 기법 (예를 들어, 빠른 흐름 푸시 풀 또는 대뇌 피 질의 컵 관류)에 프로브는 관심13,14, 비교적 정확한 면적의 작은 직경 15. 둘째, microdialysis 막 조직과 perfusate; 사이의 물리적 장벽을 만듭니다. 따라서, 높은 분자 무게 물질 교차 하지 않는다 고 분석16,17방해 하지 않습니다. 또한, 조직 perfusate18의 난 류 흐름에서 보호 됩니다. 다른 중요 한 장점은 perfusate에서 분석 농도 극대화 하기 위한 perfusate 흐름 수정 가능성 (즉, microdialysis 과정 잘 수학적으로 정의 될 수 있습니다와 높이를 수정할 수 있습니다 샘플에 있는 분석의 농도)19. 마지막으로, 관심의 조직에 약물 또는 약리학 내용물을 고취 하 고 개입20의 사이트에 그들의 효과 결정 하는 기술을 사용할 수 있습니다. 다른 한편으로, microdialysis는 전기 화학 또는 생물 센서;에 비해 제한 된 해상도 시간이 (일반적으로 이상 샘플 수집에 필요한 시간이 1 분) 그것은 조직 손상; 하는 침략 적 기법 그것은 관심의 실정이 함께 perfusate를 입력 하는 모든 녹는 물질의 지속적인 농도 기온 변화도 때문에 막 주위 공간 내에서 neurochemical 균형 타협. 마지막으로, microdialysis 기술은 높은 분석 기법에는 perfusate9,,2122,23 물질의 정량화에 대 한 고용의 제한에 의해 영향을 . 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 후 조미료와 aspartate 생물 샘플 분석에 대 한 orthophthaldialdehyde와 derivatization 잘 검증된24,,2526 , 27 그리고 그것의 광범위 한 토론이이 원고의 범위 이지만이 메서드를 사용 하 여 생성 하는 데이터를 자세히 설명 합니다.

제대로 하 고 perfusate 구성의 수정 없이 수행, microdialysis 신경 전달 물질 방출의 기초 수준에 대 한 신뢰할 수 있는 정보를 제공할 수 있습니다. 기초 수준의 가장 큰 부분이 가능성이9시 냅 스 송신기 넘침의 결과 이다. 많은 경우에 추가 시 냅 스 공간에서 신경 전달 물질의 간단한 샘플링은 조사 목표를 추구 하기에 충분 하지, 때문에 microdialysis 기술을 채택 될 수 있다 또한 뉴런을 자극 하거나 중요 한의 그들을 박탈 하는 것은 K+ 또는 캘리포니아2 +연상 하거나 신경 전달 물질의 방출을 방지 등 생리 이온.

높은 K+ 자극 깨어 동물 뿐만 아니라 기본 및 organotypic 문화에 신경 활동을 자극 하는 신경 생물학에 종종 사용 됩니다. K+ (40-100 m m)의 높은 농도 가진 솔루션 건강 한 중추의 노출 신경 전달 물질28의 경과 끝. 간 질 동물1 과 다른 신경 퇴행 성 질환29,30높은 K+ 에 추가 릴리스를 제공 하는 뉴런의이 능력을 손상 될 수 있습니다. 마찬가지로, 캘리포니아2 + 부족 (Ca2 + 무료 솔루션 perfusing에 의해 얻은) 칼슘 의존을 설정 하는 데는 microdialysis에 의해 측정 하는 대부분 신경 전달 물질의 릴리스. 반면 캘리포니아2 + 독립적인 자료 명과에서 유래 하지만 많은 연구 캘리포니아2 +의 의미 논란 제기 Ca2 + 종속 릴리스 신경 원산지는 일반적으로 믿어진다-민감한 측정의 예 조미료 또는 GABA9: 따라서, 만약에 가능 하다 면, 그것은이 후자는 더 높은 공간적 해상도 전극 시 냅 스31에 가까이 있게 microsensor 연구, microdialysis 연구를 지 원하는 것이 좋습니다.

간 질 동물에 microdialysis 연구에 대 한 그들의 대부분에서 얻은 데이터는 비디오 또는 비디오-뇌 파 모니터링 발작, 즉, 표지판 때문에 비정상적인 증상의 일시적 발생의 의존을 강조 하는 것이 중요 하다 과도 한 또는 동기 신경 활동 두뇌32에서. Pilocarpine 치료 동물 실험을 준비할 때 고려해 야 하는 electrographic 발작의 몇 가지 특성을 확인 하 고 있습니다. 자발적인 발작 뒤에 자주 뇌 파 interictal 스파이크3 우울된 활동 하 고 클러스터33,34에서 발생. 가짜 운영된 비 간 질 동물 발작 같은 활동35 전시 수 있습니다 따라서 뇌 파 기록 평가 대 한 매개 변수는 표준된36 여야 고, 만약에 가능 하다 면, microdialysis 세션의 타이밍 잘 정의 되어야 합니다. 마지막으로, 우리는 매우 좋습니다 전문가의 국제 리그 간 질 반대와 미국 간 질 학회 그들의 아주 최근 보고서37에 의해 제시 된 원리와 방법론 표준 비디오-뇌 파 모니터링 제어 성인 설치류에 대 한 ,38.

여기, 우리 microdialysis 조미료 및 간 질 동물에서 장기 비디오-뇌 파 기록 및 그들의 분석에서 dialysate HPLC에 의해 동시에 aspartate의 설명. 우리 하나 최상의 결과 위해 처리 해야 하는 프로토콜의 중요 한 단계를 강조 합니다.

프로토콜

페라라 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해와 이탈리아 보건부에 의해 모든 실험 절차 승인 (승인: D.M. 246/2012-B) 유럽 공동체에 설명 된 지침에 따라 1986 년 11 월 24 일 (86/609/EEC)의 위원회 지시문입니다. 이 프로토콜은 특히 쥐 뇌 dialysates microdialysis 세션 간 질 및 간 질 비 쥐의 뇌 파 제어에서 얻은에 조미료와 aspartate 결정에 대 한 조정 됩니다. 여기는 자료의 많은 수 있습니다 쉽게 대체 뇌 파 기록 또는 microdialysis에 대 한 그의 실험실에서 사용 하는 그.

1. Microdialysis 프로브-전극 장치 조립

  1. 3-채널 2 트위스트 전극 (등록 전극의 길이 잘라 적어도 20 m m와 긴 전극 접지 10 cm) 사용 하 고 장치를 준비 하는 가이드 정 커플. 3-채널 전극과 가이드 정 투 그림 1A에대 한 예제를 참조 하십시오-1B.
  2. (그림 1C)을 제거 하 고 동물에 microdialysis 프로브에 대 한 그것의 스위치의 순간에 (그림 1D) 몇 번의 제거를 쉽게 하기 위해서는 사용 전에 더미 플라스틱 캐 뉼 러에 금속 가이드 cannula를 삽입.
  3. 등록 전극 두 번 꼬인된 와이어 벤드 (그림 1E-1 층) 가이드의 더미 정으로 와이어를 정렬 하 고 전극 팁 (그림 1G) 0.5 m m 가이드 정 (그림의 끝 보다 긴 것을 잘라 1 H) 디지털 캘리퍼스를 사용 하 여.
  4. 1mm 긴 실리콘 고리를 준비 (마약과 2 m m, 두께 0.3 m m; 그림 1I) 그리고 가이드 정의 팁과 트위스트 전극의 팁 핀셋 (그림 1J)를 사용 하 여 실리콘 고리에 삽입. 그것을 수정 가이드의 발에 정 받침대 급속 한 행동 또는 수 지 (그림 1 K)의 폴리머 접착제. 그림 1 L 와 그림 2A에서 완성 된 장치의 예를 참조 하십시오.
  5. 소독 살 균 자외선 아래 장치 4 h. 회전 장치를 통해 그렇게 각 측면의 4 배를 1 시간에 대 한 빛에 노출.
    참고: 많은 집에서 만든 전극 및 microdialysis 프로브는 비슷한 방식으로 조립 될 수 있습니다. 쥐에 대 한 설명된 임 플 란 트 위에 머리에 다음 크기는: x 발가락; 받침대 위에서 10 m m 길이 7 m m 폭 x 5 m m 깊이 임 플 란 트 팁 직경에서 600 µ m 및 모든 장치 무게 약 330-360 밀리 그램 약 11 m m, 이다. 장치 수 있습니다 다시 사용할 2 ~ 3 번 접지 전극의 (i) 충분 한 길이 남아 있는 경우 두개골에 다음 사용 하 고 수술 하는 동안 (ii) 때 동물을 살해 하 고 치과 시멘트 아세톤에 남아 함께 복구 된 장치 overnigh t, 등을 시멘트 기계적 disaggregated 수 있습니다, 장치 세척 하 고 다시 소독.

2. stereotaxic 수술

  1. Stereotaxic 장치 및 프로브 클립 홀더 (그림 2B)를 사용 하 여 다음과 같은 무 균 하 고 통증 없는 수술39,,4041현대 표준 장치 주입에 대 한.
    1. 케 타 민/xylazine 혼합 (43 mg/kg 및 7 mg/kg, i.p.) 성인 Sprague-Dawley 쥐 anesthetize 고 stereotaxic 프레임에 그것을 해결. 그것은 시간에 마 취의 깊이 제어할 수로 초기 케 타 민/xylazine 주입에 isoflurane 마 취 (공기에서 1.4%, 1.2 mL/min)를 추가 합니다. 동물의 머리에 모피를 면도.
  2. 무 균 수술39에 대 한 준비를 70% 에탄올 뒤 요오드 기반 솔루션으로 머리 피부 표면 면봉.
    1. 다음 좌표를 사용 하 여 오른쪽 복 부 해 마에 우선 (1.1-1.5)에 준비 가이드 정 전극 장치 임 플 란 트: 코 바 + 5.0 m m,-3.4 m m, L + 4.5 m m, P + 6.5 m m bregma1,2. 따라 stereotaxic 수술10,,1112에 대 한 표준 기술.
    2. 그것은 고정 나사를 커버 하지 않습니다 확인 합니다. Stereotaxic 장치에 장착,이 프로브 홀더를 쉽게 정렬 될 수 있습니다으로 가이드 정 머리에 대 한 장치를 파악.
  3. 두개골 뼈 (오른쪽 정면 뼈 격판덮개, 정수 리 왼쪽으로 1 나사 및 interparietal 뼈 격판덮개로 1 개의 스크류로 왼쪽과 1 나사에 1 나사)에 그들을 속이 고 적어도 4 개의 스테인리스 나사를 가진 두개골에 장치를 앵커. 추가 수정 두개골 뼈에 각 나사를 조직 접착제의 방울을 추가 합니다.
    1. 스크류 스레드 酸 시멘트의 절반을 커버. 시멘트의 바인딩 부착을 증가 뼈에 얕은 홈을 만들어 홍보.
  4. 일단 장치의 뇌 조직에, 위치 고정 나사 3 지상 전극의 와이어 트위스트. 모든 탑재 된 나사와 치과 시멘트12,,4243장치 커버.
  5. 직 립 및 감 금 소의 이동까지 그 후 동물을 수술 하는 동안 고 약 1 시간에 대 한 모니터링 합니다. 저체온증을 피하기 위해 온난 패드에 그들을 유지. 쥐 장치 이식 후 적어도 7 일 동안 복구를 허용 합니다.
  6. 통증이 나 고통의 흔적에 대 한 수술 후 3 일 동안 적어도 한 번 매일 동물을 모니터링 합니다. 감염 및 진통제를 방지 하기 위해 베인 가까운 항생제 크림 (gentamycin 0.1%)와 동물에 게 (tramadol 5 mg/kg, i.p.) 수술 후 통증을 방지 하기 위해 3 일 동안.

3. 측 두 엽 간 질 유도 Pilocarpine 및 동물 실험 그룹의 할당

  1. 수술 후 회복의 일주일 후 동물 임의로 그룹에 할당: (i) 제어 동물 차량 및 (ii) 간 질 동물 pilocarpine 수신할 수신. 동물의 비례 높은 수를 사용 하 여 모든는 pilocarpine 투여 쥐 이후 간 질 그룹에 대 한 질병을 개발할 것입니다.
  2. Pilocarpine (350 mg/kg, i.p.) 상태 epilepticus (SE) 유도에 한 주입 후 methylscopolamine (1 mg/kg, 사우스 캐롤라이나) 및 30 분 복용량을 주사. Methylscopolamine 및 차량 (염 분) 제어 쥐에 주사. 1 mL 주사기를 사용 하 여 모든 i.p. 행정에 대 한 25 G 바늘.
    1. 동물 행동 발작 (vibrissa 사지를 복제 하는 머리를 끄 덕 5 분 이내 이동)을가지고 시작을 시각적으로 확인 하 고 지속적으로 모든 신체 (SE)을 25 분 이내.
  3. 다이아 제 팜 (20 mg/kg, i.p.)의 행정에 의해 약 25% 사망률과 약 10 일의 평균 잠 기간을 발병 후 h SE 2를 체포. 관찰 및 pilocarpine 주사 직후 발작 동작 시작 어떤을 기록 하 고 그 후 적어도 6 h에 대 한 계속.
  4. 주고 동물 식 염 수 (1 mL, i.p.) 25g 바늘과 자당 솔루션 (1 mL, 사서함) 1 mL 주사기를 사용 하 여를 사용 하 여 1 mL 주사기와 유연한 먹이 17 G 바늘 SE 후 2-3 일 동안 몸 무게 감량의 회복을 촉진.
    1. Pilocarpine SE 연구 (SE, 몸 무게 후속 불가능 하지 후 24 h를 죽인 급성 그룹) 제외 후 첫 주 내 초기 몸 무게를 달성 하지 않는 동물을 제외 합니다.
  5. 게시물-SE 동물을 임의로 다른 실험 그룹 (그림 3) 할당: 급성 단계 (여기서는 microdialysis 일어난 24 시간 SE 후), 대기 (SE 후 7-9 일), 첫 번째 자발적인 발작 (약 11 일 이후 SE), 및 만성 기간 ( SE, 즉 약 10 일 후에 첫 번째 발작 후 약 22-24 일 시작). 자발적인 발작의 발생에 대 한 동물을 모니터링 합니다.
    참고: 간 질 쥐 추가 실험에 대 한 다음 포함/제외 기준을 사용 하 여: pilocarpine 관리; 후 1 시간 이내 경련의 개발 무게는 SE 및 microdialysis 프로브 및 전극의 올바른 위치 후 첫 주에 얻을.

4. 간 질 동작 모니터링 및 분석

  1. 간 질 행동의 장기 모니터링
    1. Pilocarpine 관리 (즉, 연구원에 의해 직접 관찰의 끝에), 후에 대략 6 h는 동물 깨끗 한 집 새 장 놓고 24 시간 비디오 모니터링을 시작 합니다.
    2. 24 시간 비디오 5 일까 모니터링, 디지털 비디오 감시 시스템을 사용 하 여 계속 합니다.
    3. 5 일에 시작, 속박 되 뇌 파 기록 시스템을 그들의 가정 직사각형 장에 쥐를 연결 하 고 24 시간 비디오 모니터링을 계속.
    4. 연결 되지 않은 제작한 앰프 패러데이 케이지 (각 단일 동물의 뇌 파 신호의 특이성에 따라 각 채널에 설정된 증폭 요인)와 뇌 파 신호를 관찰 하는 시작 뇌 파 인수 이외의 위치에 매개 변수 설정 케이블입니다. 사용 하 여 샘플링 200 Hz 속도 그리고 낮은 0.5 hz 필터 집합을 전달 합니다.
    5. 케이블 들고 한 손을 뻗어 손가락 두 개 사이 동물의 머리와 다른 자유 재량을 사용 하 여 전극 받침대 커넥터 아래로 속이 고 동물을 연결 합니다. 인수를 시작 합니다.
      주의: 신호 유물의 무료 인지 확인 합니다. 일반적인 아티팩트는 크게 규모를 초과 하는 스파이크.
    6. 하루 전에 microdialysis 실험, microdialysis에 대 한 플 렉 시 유리 실린더 장착 속박 되 뇌 파 시스템으로 동물을 전송 합니다. 동물 동물 제 지 없이 전극에서 커넥터를 속이 고 집 안의 시스템을 tethering 뇌 파에서 분리 합니다. 높은 플 렉 시 유리 실린더에 동물을 놓습니다.
  2. 하루 전에, microdialysis 세션 중 간 질 동작의 모니터링
    1. 패러데이 새 장 밖에 위치 하는 증폭기에 스위치. 뇌 파 소프트웨어를 엽니다. 연결 되지 않은 케이블 제작한 뇌 파 신호를 관찰 하는 EEG 수집 시작 합니다.
    2. 한 손을 뻗어 손가락 두 개 사이 동물의 머리를 들고와 다른 자유 재량을 사용 하 여 전극 받침대 커넥터 아래로 속이 고 속박 되 뇌 파 기록 시스템에 동물을 연결 합니다. 규모에 뇌 파 신호는 증폭 요인 (이득) 단일 동물의 전극 신호에 따라 앰프의 각 채널에 설정. 연구원의 직접 관찰에서 적어도 1 시간에 대 한 새로운 케이지 (실린더)을 탐험 하는 동물을 보자.
    3. 참고: 전에 microdialysis h 24 실험, 쥐 짧게 isoflurane microdialysis 프로브를 가이드 뉼의 스위치와 마 취. 때 그들은 뇌 파 기록 시스템에 그들을 연결 하 취는 순간의 활용.
    4. 단축 또는 동물의 필수품에 매달린 케이블을 연장. 케이블 동물의 움직임과 거짓말 자세와 함께 방해 하지 않습니다 다는 것을 확인 하십시오.
    5. 비디오 카메라의 올바른 이미지 프레임에 대 한 확인 하십시오. 비디오-뇌 파 녹음을 시작 합니다.
  3. 발작과 뇌 파 활동의 id
    1. 소프트웨어 플레이어를 사용 하 여 동영상을 보고. 동영상 8 번 실시간 재생 보다 빠르게 스크롤한 일반화 된 발작 (forelimb clonus와 뒤쪽으로 동물 또는 동물 양육 forelimb clonus 떨어지고 참조) individuate. 비디오 느려집니다 고 행동 발작의 끝의 처음의 정확한 시간 합니다.
    2. 프로세스 일반화 된 발작의 수를 계산 하 여 데이터 비디오 레코드의 24 시간에서 관찰 하 고 발작 빈도와 기간 24 시간 관찰 하는 모든 발작의 값을 의미 들을 표현.
    3. 높은 주파수의 발작 활동 기간으로 뇌 파 발작을 정의 (> 5 Hz) 특징으로 > 3 s2,44 의 최소 지속 스파이크 주파수의 진행 초기에 3 진폭 증가 또는 유사한28. 뇌 파 소프트웨어를 사용 하 여 원시 뇌 파 기록 처리. 뇌 파 추적 1 h 조각으로 분할. 뇌 파 추적 분수 소프트웨어 자동 스파이크 분석에 대 한 파일을 복사 합니다.
    4. 뇌 파 소프트웨어 및 미리 정의 된 매개 변수 (4.3.3)를 사용 하 여 뇌 파 활동 데이터를 분석 합니다. 두 개의 독립적인 조사 분석 된 동물의 그룹에 대 한 눈 먼 사람에 모든 비디오 분석을 수행 합니다. 발산, 경우 다시 함께 합의45에 연결할 데이터를 검토 있도록.

5입니다. Microdialysis

  1. 체 외에서 조사 복구
    1. 그 보호 슬리브에서 처리 제조업체의 지침에 따라 최초의 사용에 대 한 조사를 준비 합니다.
    2. 3 중에서 실험을 실행: 준비 3 1.5 mL 시험관 1 mL의 표준 (조미료의 2.5 µ M)과 aspartate의 2.5 µ M의 혼합물을 포함 하는 벨의 솔루션으로 그들을 로드. 37 ° C에 블록 히터 세트로 3 로드 1.5 mL 테스트 튜브를 넣고는 활동가에 위치.
      참고: 크로마토그래피 교정에 대 한 동일한 표준 솔루션을 사용 합니다.
    3. 파라핀 영화 테스트 튜브 1.5 mL를 봉인 하 고 직경에서 약 1 m m의 구멍을 만들기 위하여 날카로운 핀셋으로 펑크.
    4. 프로브를가지고 하 고 파라핀 필름에서 만든 구멍에 삽입 합니다. 솔루션 수준에서 2 mm 이상 막 담가. 파라핀 필름에 의해 더 프로브 테스트 튜브 1.5 mL를 수정.
      주의: 팁 1.5 mL 시험관의 벽에는 영향을 만지지 않는다 있는지 확인 합니다.
    5. 프로브 입구 FEP 튜브 및 배관 어댑터를 사용 하 여 주입 펌프에 주사기를 연결 합니다. 필요에 따라 사용 잘 연결 0.28 m m ID와 0.61 m m OD 및 컬러 튜브 어댑터 (빨간색과 파란색 튜브 어댑터)의 폴 리 에틸렌 튜브를 낳았다.
    6. 2 µ L/min에서 펌프를 시작 하 고 액체 출구 끝에 표시를 하자. FEP 튜브 및 배관 어댑터를 사용 하 여 테스트 튜브를 수집 0.2 mL를 프로브 콘센트를 연결 합니다.
      참고: FEP 튜브를 사용 하 여 모든 연결에 대 한. 면도날을 사용 하 여 원하는 길이의 튜브를 잘라. 다른 색상의 튜브 어댑터를 사용 하 여 입구와 출구 조사에 대 한. 누수에 대 일 분 확인에 대 한 실행 하 고 기포 펌프를 하자. 이 존재 해서는 안됩니다.
    7. 흐름 속도 2 µ L/분에 펌프를 설정 하 고 배관의 출구 쪽에 샘플을 수집 하기 시작.
    8. 3 30 분 perfusate 샘플 및 1.5 mL 테스트 튜브에 있는 솔루션의 3 개의 동등한 볼륨 샘플을 수집 합니다. 1.5 mL 테스트 튜브 1.5 mL 테스트 튜브에서 표준 솔루션으로 포장 하는 microsyringe를 사용 하 여 매일 30 분에서에서 동일한 볼륨 샘플을 가져가 라.
    9. 반복 실험 (5.1.1-5.1.8) 두 개의 다른 관류 흐름 율을 사용 하는 경우 프로브 복구 비교를 펌프 흐름 율 3 µ L/min (5.1.7)를 설정 합니다.
    10. 완료 되 면 펌프를 중지와 증류수, 70% 에탄올으로 튜브를 헹 구 고 그것으로 공기를 밀어. 깨끗 한 증류수로 가득 유리병에 프로브를 저장 합니다. 저장 전에 증류수로 2 µ L/분에 perfusing에 의해 조사를 철저 하 게 린스.
    11. 크로마토그래피에 의해 조미료와 샘플에 aspartate의 농도 분석 (세부 사항 참조 아래; 6.3).
    12. 다음 수식을 사용 하 여 복구를 계산.
      복구 (%) = (Cperfusate /C솔루션 dialysed) x 100.
  2. 자유롭게 이동 하는 쥐에 Microdialysis 세션
    1. 대리점 절차: 삽입 프로브 및 테스트 주입 펌프 설정 및 시작
      1. 제조 업체의 설명서에 따라 첫 번째 사용에 대 한 microdialysis 프로브를 준비 하 고 벨의 솔루션 그들을 채우십시오. 약 10 cm FEP 튜브의 긴 조각을 잘라내어 다른 색상의 튜브 어댑터를 사용 하 여 프로브의 입구 및 출구 뉼 연결.
      2. 튜브 어댑터에서 모든 연결 없는 죽은 공간을 지 다는 것을 확인 하십시오.
      3. 5.2.1.3 24 h microdialysis 실험 하기 전에 잠시 휴식 때까지 유도 실에서 isoflurane (공기에 5%)와 동물 anesthetize. 핀셋을 사용 하 고 동물의 머리를 단단히 잡고 그것의 가이드에서 더미 정을 제거 합니다. Dialyzing 막 가이드 정으로 부여 microdialysis 프로브를 삽입 하 고 회사 더 microdialysis 뉼 클레이 모델링 함으로써 그들의 가이드에 삽입.
        주의: 프로브를 추출할 때 보호 프로브 소매의 벽을 터치 하지 마십시오.
      4. 플 렉 시 유리 실린더에 동물을 넣고 새로운 분위기를 탐험 하자. 위에서 설명한 대로 속박 되 뇌 파 기록 시스템에 동물을 연결 (4.2.2 및 4.2.3 포인트에 따라).
      5. 깨어 따라 쥐의 움직임을 자유롭게 이동 하 고 무딘 22 G 바늘 튜브 어댑터를 사용 하 여 벨의 솔루션을 포함 하는 프로브의 입구 2.5 mL 주사기를 연결. 10에서 벨의 솔루션의 1 mL를 꺼내기 프로브 내부 벨의 솔루션을 밀어 2.5 mL 주사기의 피스톤을 지속적으로 추진 하는 s. 콘센트에 액체의 하락에 대 한 확인 하십시오. 프로브는 이제 사용할 준비가 되었습니다.
      6. 벨의 솔루션 튜브 어댑터 FEP 튜브에 연결 하는 2.5 mL 주사기를 작성 하 고 주입 펌프에 탑재. 2 µ L/min에서 펌프를 시작 합니다. 밤새 실행 하자.
        참고: 모든 FEP 튜브의 원하는 길이 사용 하지만 튜브 죽은 볼륨 높은 K+ 자극 시작할 때 알아야 하 고 동물성 두뇌에 있는 neurochemical 변화 정량화 데이터 상관 관계를 계산 합니다. 작업 흐름에서 튜브에서 만든 공기 거품을 사용 하 여이 시간을 계산.
    2. 뇌 파 기록 및 칼륨 자극 중의 샘플 수집
      1. 3 h 샘플 컬렉션 (비디오-뇌 파 기록)의 앞에서 발작의 부재를 확인 하 고 계속 microdialysis 동안 발작 활동을 모니터링.
      2. 벨의 솔루션으로 채워 cannulated FEP 튜브 주사기를 들고 펌프를 중지 합니다. 다른 세트 2.5 mL 주사기 펌프에 마운트에 연결 FEP 튜브 100mm를 포함 하는 수정된 벨의 솔루션과 채워 어댑터 튜브와 K+ 솔루션.
      3. 2 µ L/min에서 펌프를 시작 하 고 그것을 실행 하자. 튜브의 더 빠른 작성을 위한 충전의 시간에 대 한 펌프 5 µ L/min에서 설정 합니다. 시스템에서 공기 방울의 부재를 확인 합니다. 튜브 어댑터에서 모든 연결 없는 죽은 공간 접촉 확인 합니다.
      4. 동물 (5.2.1.5) 위에서 설명한 대로 조사 사용 하기 위해 준비 하는 경우 테스트 합니다.
        참고: 어떤 이유로 프로브 작동 하지 않으면, 그것을 변경 합니다. 이러한 경우에 대 한 몇 가지 준비 microdialysis 프로브 microdialysis-뇌 파 워크 스테이션 근처 사용할 준비가 유지. 동물 뇌 파 케이블에서 분리 하 고 anesthetize 그것 짧게 isoflurane와 변화를 실현 하기 위해 필요한 경우.
      5. 벨의 솔루션의 각 동물에는 콘센트의 끝에 액체 방울의 모양에 대 한 대기 프로브 입구 정을 채워 주사기의 FEP 튜브를 연결 합니다.
      6. FEP-튜브, 테스트 튜브에 수집에 이르게에 탐사선의 콘센트를 연결 합니다. 구멍이 모자와 함께 닫힌된 0.2 mL 테스트 튜브에 FEP 튜브를 삽입 합니다. 튜브 숙박 장소에 모델링 찰 흙의 조각으로 고정 하 여 확인 합니다.
      7. 60 분 2 µ L/분에 equilibrate 시스템 (영 샘플) 샘플을 수집 하지 않고 실행 하는 펌프를 계속 합니다.
      8. 초기 조건 (일반 벨소리 솔루션 관류)에서 5 연속 30 분 dialysate 샘플 (60 µ L 각각 볼륨)를 수집 합니다. 얼음에 샘플을 저장 합니다.
      9. 액체 펌프에서 동물의 머리 (죽은 양의 튜브, 즉, 공기 거품 시간 의존)에 전달 하는 시간을 계산 하 고 포함 된 주사기를 정상적인 벨의 솔루션을 포함 하는 주사기가는 FEP 튜브 전환 펌프를 중지 하지 않고이 시간에 (100 m m K+) 벨의 솔루션을 수정. 시스템에서 공기 방울의 부재를 확인 합니다. 펌프 10 분 동안 실행 하자.
        주의: 높은 K+ 자극의 10 분, 동물 frenetically 자신을 이동 하 고 일반적으로 쉐이크 젖은 강아지의 큰 번호를 제시 하는 경향이 (제어 및 발작 클러스터 동물에서) 행동 발작 (간 질 동물), 그래서 개입 하 게 준비 되어 있을 또는 트위스트에서 튜브 및 케이블을 보호 합니다.
      10. 10 분 후 정상적인 벨소리 솔루션 100 m m K+ 벨 솔루션을 포함 하는 주사기에서 튜브를 전환 그리고 실행 하는 펌프. 설정 하지 마십시오 펌프 솔루션 변경 시를 그 라인에 연결 되어 있어야 튜브의 끝에 액체의 하락 있을 것입니다.
      11. dialysate 포함 높은 칼륨, 즉, 다섯 번째 후 평형 dialysate의 수집 후 순간부터 1 h. 수집 3 추가 30 분 dialysate 샘플 dialysate 분수 마다 10 분 (20 µ L)을 수집 하 고 중지는 펌프입니다. 얼음에는 샘플을 저장 합니다.
      12. HPLC 분석까지-80 ° C에서 샘플 실험 후 저장 합니다.
      13. microdialysis 급성 (24 시간) 및 첫 번째 발작 그룹, 있는 하나의 microdialysis 세션 후에 일어난다 24 시간 SE 후 또는 24 시간 이내 첫 번째 자발적인 발작 (그림 3)를 제외한 3 일 연속에 대 한 실험을 반복 합니다.
      14. 각 실험의 완료, 마 취 과다와 동물을 안락사 하 고 프로브 및 전극 배치의 두뇌를 제거 합니다.
  3. 포스트 microdialysis 절차
    1. 증류수를 사용된 microdialysis 프로브를 헹 구 고 깨끗 한 증류수 다음 사용까지 가득 유리병에 보관.
      참고: 재사용된 막 침투성; 증가 할 수 있습니다. 프로브 복구의 반복된 사용 하기 전에 확인 하십시오.
    2. (튜브, 커넥터 및 주사기) 70% 에탄올 다음 증류수와 설정 전체 microdialysis 린스. 공기와 에탄올을 대체 하 고 메 마른 환경에서 집합을 저장.
    3. 기저 dialysate 샘플 20 µ L 조각으로 분할 하 고 아미노산 기저 농도 분석에 대 한 하나의 20 µ L 분수를 사용 합니다. 추가 또는 확실 한 분석-80 ° c.에 대 한 나머지 샘플 볼륨을 저장
    4. 10% 포 르 말린에 머리를 해결 하 고 파라핀 포함1그들을 보존. Coronally 조각으로 두뇌를 섹션 하 고 오신 hematoxylin와 그들을 얼룩. 정확한 조사 및 전극 배치1,2두뇌를 검사 합니다.
      참고: 두뇌 냉각된 2-methylbutane에서 수정 하 고-80 ° c.에서 그들을 저장합니다 어떤 다른 검증 된 얼룩 프로브 및 전극으로 시각화를 허용 하는 신경 조직 섹션에 사용 합니다.

6. 조미료와 Aspartate의 컬럼에 분석

  1. Derivatizing 에이전트의 준비
    1. 각 20:1 (v/v)의 볼륨 orthophthaldialdehyde 시 약 (OPA)와 2-mercaptoethanol (5-ME) 유리병에 혼합. 유리병 뚜껑 및 공기 꽉 심장을 사용 하 여 닫습니다.
      주의: 화학 후드 작동 합니다.
    2. 회오리 준비 솔루션 autosampler derivatizing 에이전트에 대 한 위치에 넣어.
  2. Dialysate 샘플의 준비
    1. 하단 봄 유리 삽입을 2 mL 갈색 autosampler 유리병에 넣습니다. 하나의 일괄 처리에서 측정 하는 모든 샘플에 대 한 튜브를 준비 합니다.
    2. -80 ° C 냉장고에서 20 µ L 투 석 샘플을 받아 고 녹여 그들. 솔루션의 1 µ L을 제거 하 고 1 µ L 내부 표준 (IS)의 추가 L Homoserine (50 µ M) 19 µ L의 샘플, 따라서 샘플 포함 IS의 2.5 µ M. 유리병에 유리 삽입으로 투 석 샘플의 20 µ L 플라스틱 그것을 봉인 한 공기가 꽉 심장으로.
    3. 컬럼에 소프트웨어를 사용 하 여 그들의 위치에서 샘플을 autosampler에 샘플을 포함 하는 튜브를 놓습니다.
  3. 조미료와 aspartate 농도 결정 하는 샘플의 컬럼에 분석
    1. Spectrofluorometric 검출 액체 크로마 토 그래프 시스템에서 분석을 실행 합니다. 2 분 전 열 derivatization 20 μ와 orthophthaldialdehyde/5-mercaptoethanol 20: 1의 (v/v) 샘플의 20 μ에 추가 후 아미노산을 감지 합니다.
    2. 아미노산 분석을 위한 시스템을 준비 합니다. autosampler, 펌프는 degasser, 검출기와 함께 컴퓨터 제어 장치에 스위치.
    3. 모바일 단계를 포함 하는 병으로는 siphons를 담가 그리고 분석에 사용할 컬럼에 펌프의 채널을 제거.
    4. 열에 대 한 압력을 확인 하는 모바일 위상의 흐름을 증가 시작 (예를 들어, 0.2 mL/min에서 시작 하 고 작업 흐름을 달성까지 추가 0.2 mL/min 마다 5 분에 대 한 흐름을 증가). 하자 작업에서 실행 하는 시스템에는 적어도 1 h 열을 equilibrate를 위한 0.8 mL/min 흐름.
      주의: 불안정 압력 시스템의 공기의 존재를 나타냅니다. 압력 25 MPa를 초과 하지 않아야 합니다.
    5. 345/455에 검출기에는 이득, 높은 감도 여기 및 방출 파장을 설정 nm 각각. 검출기 신호 (오토)를 다시 설정 합니다.
    6. 컬럼에 소프트웨어를 사용 하 여 악기를 메서드를 보냅니다. 이제는 크로마 토 그래프 측정 준비 되어야 합니다.
    7. 분리 dialysate 샘플, 표준 아군 dialysate 샘플 뿐만 아니라 적절 한 컬럼에 열에 표준 (0.25 µ M-2.5 µ M aspartate 및 벨의 솔루션에 조미료). 컬럼에 메서드를 보정 하 고 투 석 샘플 분석 하기 전에 탐지 및 정량화 한계를 설정.
    8. 단일 분석 활성화 또는 크로마토그래피 소프트웨어를 사용 하 여 분석할 샘플 시퀀스 만들고 시퀀스를 실행 합니다.
      주의: 방법은 정확도 제어 하기 위해 하나 이상의 빈 샘플 및 dialysate 샘플의 시퀀스 내에서 다른 표준 샘플을 실행 합니다.
    9. chromatograms 획득 되 면 착 색 인쇄기 소프트웨어와 함께 그들을 분석 합니다. 교정 줄거리로 관심의 봉우리의 통합을 확인 하십시오. 정량화에 대 한 피크 높이 또는 피크 영역을 사용 합니다.
    10. 샘플 녹음 완료 되 면 채울 열 및 시스템 (예를 들어, 초순에 50% 이기) 유기 용 매에 노화 및 금형의 성장을 방지 하기 위해.
    11. 시스템을 종료 합니다.

결과

프로브 복구

평균 복구 (즉, 유리병 솔루션의 동일 볼륨에 콘텐츠의 perfusate에 평균 아미노산 콘텐츠) 되었고 2 μ/min와 조미료 3 μ/분 6.32 ± 0.64의 유량에서 15.49 ± 0.42 %14.89 ± 0.36 %2의 흐름 율에 Μ/분 고 10.13 ± 0.51 aspartate cuprophane 막 프로브를 사용 하는 경우에 대 한 3 μ/분. 평균 복구 조미료 3 μ/분 6.55 ± 1.07의 2 μ/min 흐름 ?...

토론

이 작품에서는, 우리는 TLE의 실험 모델에서 연속 비디오-뇌 파 기록 microdialysis와 결합을 수행 하는 방법을 보여줍니다. 비디오-뇌 파 기록 기법 올바르게 다른 동물에 있는 질병의 진행 단계를 진단 하는 데 사용 됩니다 및 microdialysis 기술 (변경 되었습니다 발견에 대 한 시간에 발생 하는 조미료 릴리스의 변경 사항을 설명 하는 이전에 게시 연구2에 aspartate). 좋습니다는 단일 장?...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자 안 나 Binaschi, 파올로 Roncon 우선 출판 원고에 그들의 공헌에 대 한 엘 레 노어 팔 마를 감사 하 고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
3-channel two-twisted electrodeInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPCMaterial
guide cannulaAgn Tho's, Lindigö, SwedenMAB 4.15.ICMaterial
Resin KK2 PlastikElettra Sport, Lecco, ItalyKK2Material
Super Attack gel LoctiteHenkel Italia Srl, Milano, Italy2047420_71941Material
Imalgene-KetamineMerial, Toulouse, France221300288 (AIC)Solution
XylazineSigma, Milano, ItalyX1251Material
Isoflurane-VetMerial, Toulouse, France103120022 (AIC)Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadolFormevet, Milano, Italy103703017 (AIC)Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycineMSD Italia, Roma, Italy20891077 (AIC)Material
simplex rapid dental cementKemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United KingdomACR811Material
GlasIonomer CX-Plus CementShofu, Kyoto, JapanPN1167Material
probe clip holderAgn Tho's, Lindigö, Swedenp/n 100 5001Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin AdhesiveTissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USATS1050044FPMaterial
Valium 10 mg/2 ml - diazepamRoche, Monza, Italy019995063 (AIC)Material
1 mL syringe with 25G needleVetrotecnica, Padova, Italy11.3500.05Material
rat flexible feeding needle 17GAgn Tho's, Lindigö Sweden7206Material
Grass Technology apparatusGrass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USAM665G08Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150Biopac, Goleta, California, USAMP150WSWEquipment
digital video surveillance systemAverMedia Technologies, Fremont, California, USAV4.7.0041FDEquipment
microdialysis probeAgn Tho's, Lindigö SwedenMAB 4.15.1.CuMaterial
microdialysis probeSynaptech, Colorado Springs, Colorado, USAS-8010Material
block heaterGrant Instruments, Cambridge, EnglandQBD2Equipment
stirrerCecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy711Equipment
infusion pumpUniventor, Zejtun, Malta864Equipment
fine bore polythene tubingSmiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA800/100/100/100Material
blue tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1002Material
red tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1003Material
2.5 mL syringe with 22G needleChemil, Padova, ItalyS02G22Material
vial capCronus, Labicom, Olomouc, Czech RepublicVCA-1004TB-100Material
septumThermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USANational C4013-60 8 mm TEF/SIL septumMaterial
glass insert with bottom springSupelco, Sigma, Milano, Italy27400-UMaterial
autosampler vialNational Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, ItalyC4013-2Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unitKnauer, Berlin, GermanyV7602Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pumpKnauer, Berlin, GermanyV7603Equipment
spectrofluorometric detectorShimadzu, Kyoto, JapanRF-551Equipment
chromatogrphic columnKnauer, Berlin, Germany25EK181EBJMaterial
chromatogrphic pre-columnKnauer, Berlin, GermanyP5DK181EBJMaterial
mobile phase solution A0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0Solution
mobile phase solution B40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5Solution
Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
modified Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
saline0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0Solution
sucrose solution10% sucrose in distilled waterSolution

참고문헌

  1. Soukupova, M., et al. Impairment of GABA release in the hippocampus at the time of the first spontaneous seizure in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Experimental Neurology. 257, 39-49 (2014).
  2. Soukupova, M., et al. Increased extracellular levels of glutamate in the hippocampus of chronically epileptic rats. Neuroscience. 301, 246-253 (2015).
  3. Curia, G., Longo, D., Biagini, G., Jones, R. S., Avoli, M. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 172 (2), 143-157 (2008).
  4. Scorza, F. A., et al. The pilocarpine model of epilepsy: what have we learned?. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 81 (3), 345-365 (2009).
  5. Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. The Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
  6. Pitkanen, A., Lukasiuk, K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets. The Lancet Neurology. 10 (2), 173-186 (2011).
  7. Reddy, D. S. Role of hormones and neurosteroids in epileptogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7 (115), (2013).
  8. Engel, J. Research on the human brain in an epilepsy surgery setting. Epilepsy Research. 32 (1-2), 1-11 (1998).
  9. Watson, C. J., Venton, B. J., Kennedy, R. T. In vivo measurements of neurotransmitters by microdialysis sampling. Analytical Chemistry. 78 (5), 1391-1399 (2006).
  10. Jeffrey, M., et al. A reliable method for intracranial electrode implantation and chronic electrical stimulation in the mouse brain. BMC Neuroscience. 14, 82 (2013).
  11. Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Chapter 2. Surgical techniques for chronic implantation of microwire arrays in rodents and primates. Methods for Neural Ensemble Recordings. , (2008).
  12. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3528 (2012).
  13. Horn, T. F., Engelmann, M. In vivo microdialysis for nonapeptides in rat brain--a practical guide. Methods. 23 (1), 41-53 (2001).
  14. Kennedy, R. T., Thompson, J. E., Vickroy, T. W. In vivo monitoring of amino acids by direct sampling of brain extracellular fluid at ultralow flow rates and capillary electrophoresis. Journal of Neuroscience Methods. 114 (1), 39-49 (2002).
  15. Renno, W. M., Mullet, M. A., Williams, F. G., Beitz, A. J. Construction of 1 mm microdialysis probe for amino acids dialysis in rats. Journal of Neuroscience Methods. 79 (2), 217-228 (1998).
  16. Nirogi, R., et al. Approach to reduce the non-specific binding in microdialysis. Journal of Neuroscience Methods. 209 (2), 379-387 (2012).
  17. Zhou, Y., Wong, J. M., Mabrouk, O. S., Kennedy, R. T. Reducing adsorption to improve recovery and in vivo detection of neuropeptides by microdialysis with LC-MS. Analytical Chemistry. 87 (19), 9802-9809 (2015).
  18. Wisniewski, N., Torto, N. Optimisation of microdialysis sampling recovery by varying inner cannula geometry. Analyst. 127 (8), 1129-1134 (2002).
  19. Morrison, P. F., et al. Quantitative microdialysis: analysis of transients and application to pharmacokinetics in brain. Journal of Neurochemistry. 57 (1), 103-119 (1991).
  20. Westerink, B. H., De Vries, J. B. A method to evaluate the diffusion rate of drugs from a microdialysis probe through brain tissue. Journal of Neuroscience Methods. 109 (1), 53-58 (2001).
  21. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neurosciences. , (2009).
  22. Westerink, B. H. Brain microdialysis and its application for the study of animal behaviour. Behavioural Brain Research. 70 (2), 103-124 (1995).
  23. Zhang, M. Y., Beyer, C. E. Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography-mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 40 (3), 492-499 (2006).
  24. Allison, L. A., Mayer, G. S., Shoup, R. E. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry. Analytical Chemistry. 56 (7), 1089-1096 (1984).
  25. Boyd, B. W., Witowski, S. R., Kennedy, R. T. Trace-level amino acid analysis by capillary liquid chromatography and application to in vivo microdialysis sampling with 10-s temporal resolution. Analytical Chemistry. 72 (4), 865-871 (2000).
  26. Hanczko, R., Jambor, A., Perl, A., Molnar-Perl, I. Advances in the o-phthalaldehyde derivatizations. Comeback to the o-phthalaldehyde-ethanethiol reagent. Journal of Chromatography A. 1163 (1-2), 25-42 (2007).
  27. Molnar-Perl, I. Quantitation of amino acids and amines in the same matrix by high-performance liquid chromatography, either simultaneously or separately. Journal of Chromatography A. 987 (1-2), 291-309 (2003).
  28. Solis, J. M., et al. Variation of potassium ion concentrations in the rat hippocampus specifically affects extracellular taurine levels. Neuroscience Letters. 66 (3), 263-268 (1986).
  29. Boatell, M. L., Bendahan, G., Mahy, N. Time-related cortical amino acid changes after basal forebrain lesion: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 64 (1), 285-291 (1995).
  30. Sutton, A. C., et al. Elevated potassium provides an ionic mechanism for deep brain stimulation in the hemiparkinsonian rat. The European Journal of Neuroscience. 37 (2), 231-241 (2013).
  31. Hascup, K. N., Hascup, E. R. Electrochemical techniques for subsecond neurotransmitter detection in live rodents. Comparative Medicine. 64 (4), 249-255 (2014).
  32. Fisher, R. S., et al. Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 46 (4), 470-472 (2005).
  33. Goffin, K., Nissinen, J., Van Laere, K., Pitkanen, A. Cyclicity of spontaneous recurrent seizures in pilocarpine model of temporal lobe epilepsy in rat. Experimental Neurology. 205 (2), 501-505 (2007).
  34. Pitsch, J., et al. Circadian clustering of spontaneous epileptic seizures emerges after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 58 (7), 1159-1171 (2017).
  35. Pearce, P. S., et al. Spike-wave discharges in adult Sprague-Dawley rats and their implications for animal models of temporal lobe epilepsy. Epilepsy and Behavior. 32, 121-131 (2014).
  36. Twele, F., Tollner, K., Bankstahl, M., Loscher, W. The effects of carbamazepine in the intrahippocampal kainate model of temporal lobe epilepsy depend on seizure definition and mouse strain. Epilepsia Open. 1 (1-2), 45-60 (2016).
  37. Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents. A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, 10-27 (2017).
  38. Hernan, A. E., et al. Methodological standards and functional correlates of depth in vivo electrophysiological recordings in control rodents. A TASK1-WG3 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58, 28-39 (2017).
  39. Bernal, J., et al. Guidelines for rodent survival surgery. Journal of Investigative Surgery: the official journal of the Academy of Surgical Research. 22 (6), 445-451 (2009).
  40. Flecknell, P. Rodent analgesia: Assessment and therapeutics. Veterinary Journal. , 70-77 (2018).
  41. Miller, A. L., Richardson, C. A. Rodent analgesia. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 14 (1), 81-92 (2011).
  42. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), (2008).
  43. Gardiner, T. W., Toth, L. A. Stereotactic Surgery and Long-Term Maintenance of Cranial Implants in Research Animals. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 38 (1), 56-63 (1999).
  44. Williams, P. A., et al. Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The official journal of the Society for Neuroscience. 29 (7), 2103-2112 (2009).
  45. Paradiso, B., et al. Localized overexpression of FGF-2 and BDNF in hippocampus reduces mossy fiber sprouting and spontaneous seizures up to 4 weeks after pilocarpine-induced status epilepticus. Epilepsia. 52 (3), 572-578 (2011).
  46. Kanamori, K. Faster flux of neurotransmitter glutamate during seizure - Evidence from 13C-enrichment of extracellular glutamate in kainate rat model. PLoS One. 12 (4), e0174845 (2017).
  47. Kanamori, K., Ross, B. D. Chronic electrographic seizure reduces glutamine and elevates glutamate in the extracellular fluid of rat brain. Brain Research. 1371, 180-191 (2011).
  48. Kanamori, K., Ross, B. D. Electrographic seizures are significantly reduced by in vivo inhibition of neuronal uptake of extracellular glutamine in rat hippocampus. Epilepsy Research. 107 (1-2), 20-36 (2013).
  49. Luna-Munguia, H., Meneses, A., Pena-Ortega, F., Gaona, A., Rocha, L. Effects of hippocampal high-frequency electrical stimulation in memory formation and their association with amino acid tissue content and release in normal rats. Hippocampus. 22 (1), 98-105 (2012).
  50. Mazzuferi, M., Binaschi, A., Rodi, D., Mantovani, S., Simonato, M. Induction of B1 bradykinin receptors in the kindled hippocampus increases extracellular glutamate levels: a microdialysis study. Neuroscience. 135 (3), 979-986 (2005).
  51. Meurs, A., Clinckers, R., Ebinger, G., Michotte, Y., Smolders, I. Seizure activity and changes in hippocampal extracellular glutamate, GABA, dopamine and serotonin. Epilepsy Research. 78 (1), 50-59 (2008).
  52. Ueda, Y., et al. Collapse of extracellular glutamate regulation during epileptogenesis: down-regulation and functional failure of glutamate transporter function in rats with chronic seizures induced by kainic acid. Journal of Neurochemistry. 76 (3), 892-900 (2001).
  53. Wilson, C. L., et al. Comparison of seizure related amino acid release in human epileptic hippocampus versus a chronic, kainate rat model of hippocampal epilepsy. Epilepsy Research. 26 (1), 245-254 (1996).
  54. Lidster, K., et al. Opportunities for improving animal welfare in rodent models of epilepsy and seizures. Journal of Neuroscience Methods. 260, 2-25 (2016).
  55. Parrot, S., et al. High temporal resolution for in vivo monitoring of neurotransmitters in awake epileptic rats using brain microdialysis and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Neuroscience Methods. 140 (1-2), 29-38 (2004).
  56. Kennedy, R. T., Watson, C. J., Haskins, W. E., Powell, D. H., Strecker, R. E. In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations. Current Opinion in Chemical Biology. 6 (5), 659-665 (2002).
  57. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
  58. Ferry, B., Gifu, E. P., Sandu, I., Denoroy, L., Parrot, S. Analysis of microdialysate monoamines, including noradrenaline, dopamine and serotonin, using capillary ultra-high performance liquid chromatography and electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 951, 52-57 (2014).
  59. Jung, M. C., Shi, G., Borland, L., Michael, A. C., Weber, S. G. Simultaneous determination of biogenic monoamines in rat brain dialysates using capillary high-performance liquid chromatography with photoluminescence following electron transfer. Analytical Chemistry. 78 (6), 1755-1760 (2006).
  60. Parrot, S., Lambas-Senas, L., Sentenac, S., Denoroy, L., Renaud, B. Highly sensitive assay for the measurement of serotonin in microdialysates using capillary high-performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 850 (1-2), 303-309 (2007).
  61. Hershey, N. D., Kennedy, R. T. In vivo calibration of microdialysis using infusion of stable-isotope labeled neurotransmitters. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 729-736 (2013).
  62. Vander Weele, C. M., et al. Rapid dopamine transmission within the nucleus accumbens: dramatic difference between morphine and oxycodone delivery. The European Journal of Neuroscience. 40 (7), 3041-3054 (2014).
  63. Zestos, A. G., Kennedy, R. T. Microdialysis Coupled with LC-MS/MS for In Vivo Neurochemical Monitoring. The AAPS journal. 19 (5), 1284-1293 (2017).
  64. Benturquia, N., Parrot, S., Sauvinet, V., Renaud, B., Denoroy, L. Simultaneous determination of vigabatrin and amino acid neurotransmitters in brain microdialysates by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection. Journal of Chromatography B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 806 (2), 237-244 (2004).
  65. Chefer, V., et al. Repeated exposure to moderate doses of ethanol augments hippocampal glutamate neurotransmission by increasing release. Addiction Biology. 16 (2), 229-237 (2011).
  66. Morales-Villagran, A., Pardo-Pena, K., Medina-Ceja, L., Lopez-Perez, S. A microdialysis and enzymatic reactor sensing procedure for the simultaneous registration of online glutamate measurements at high temporal resolution during epileptiform activity. Journal of Neurochemistry. 139 (5), 886-896 (2016).
  67. Petit-Pierre, G., et al. In vivo neurochemical measurements in cerebral tissues using a droplet-based monitoring system. Nature Communication. 8 (1), 1239 (2017).
  68. Renaud, P., Su, C. K., Hsia, S. C., Sun, Y. C. A high-throughput microdialysis-parallel solid phase extraction-inductively coupled plasma mass spectrometry hyphenated system for continuous monitoring of extracellular metal ions in living rat brain. Nature Communication. 1326, 73-79 (2014).
  69. Zilkha, E., Obrenovitch, T. P., Koshy, A., Kusakabe, H., Bennetto, H. P. Extracellular glutamate: on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. Journal of Neuroscience Methods. 60 (1-2), 1-9 (1995).
  70. Ngernsutivorakul, T., White, T. S., Kennedy, R. T. Microfabricated Probes for Studying Brain Chemistry: A Review. Chemphyschem: a Eurepean journal of chemical physics and physical chemistry. 19 (10), 1128-1142 (2018).
  71. Mirzaei, M., Sawan, M. Microelectronics-based biosensors dedicated to the detection of neurotransmitters: a review. Sensors. 14 (10), 17981-18008 (2014).

재인쇄 및 허가

JoVE'article의 텍스트 или 그림을 다시 사용하시려면 허가 살펴보기

허가 살펴보기

더 많은 기사 탐색

141microdialysisaspartatepilocarpinestereotaxicelectroencephalography

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

개인 정보 보호

이용 약관

정책

연락처

사서에게 추천하기

JoVE 뉴스레터

연구

교육

저자

사서

JoVE 소개

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. 판권 소유