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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo per microdialisi in vivo analizzare il rilascio del glutammato e aspartato nell'ippocampo ventrale dei ratti epilettici e non-epilettici, in combinazione con le registrazioni di EEG. Concentrazioni extracellulari di aspartato e glutammato possono essere correlate con le diverse fasi della malattia.

Abstract

Microdialisi sono una tecnica consolidata neuroscienze che correla le modifiche di neurologico attivi diffusione nello spazio interstiziale del cervello con il comportamento e/o con l'esito specifico di una patologia (ad es., crisi epilettiche per l'epilessia). Quando si studia l'epilessia, la tecnica della microdialisi è spesso combinata con a breve termine o addirittura a lungo termine dei video-elettroencefalografia (EEG) di monitoraggio per valutare la frequenza di grippaggio spontaneo, gravità, progressione e clustering. Il microdialysis-EEG combinato si basa sull'uso di diversi metodi e strumenti. Qui, abbiamo effettuato mediante microdialisi in vivo e continuo dei video-EEG registra a monitor di glutammato e aspartato di deflusso nel tempo, nelle diverse fasi della storia naturale dell'epilessia in un modello del ratto. Questo approccio combinato consente l'abbinamento delle modifiche nel rilascio del neurotrasmettitore con specifiche fasi della progressione e lo sviluppo della malattia. La concentrazione dell'amminoacido nel dializzato è stata determinata per cromatografia liquida. Qui, descriviamo il metodi e delineare le principali misure di precauzione uno dovrebbero prendere durante la microdialisi in vivo -EEG, con particolare attenzione alla chirurgia stereotassica, stimolazione basale e alto potassio durante microdialisi, profondità registrazione degli elettrodi EEG e analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni di aspartato e glutammato nel dializzato. Questo approccio può essere adattato per testare una varietà di droga o di malattia ha indotto cambiamenti delle concentrazioni fisiologiche di aspartato e glutammato nel cervello. A seconda della disponibilità di un appropriato test analitico, possono essere ulteriormente utilizzato per testare diverse molecole solubili quando si impiegano registrazione EEG allo stesso tempo.

Introduzione

Per consentono di comprendere il danno funzionale di neurotrasmissione eccitatorio e GABAergic neurotrasmissione inibitoria conseguente crisi epilettiche spontanee nell'epilessia del lobo temporale (TLE), abbiamo monitorato sistematicamente concentrazioni extracellulari di GABA1 e successivamente i livelli di glutammato e aspartato2 mediante microdialisi nell'ippocampo ventrale dei ratti in vari momenti della malattia naturale corso, vale a dire, durante lo sviluppo e la progressione dell'epilessia. Abbiamo approfittato del modello Pilocarpina TLE in ratti, che imita la malattia con estrema precisione in termini di cambiamenti comportamentali, elettrofisiologici e istopatologico3,4 e abbiamo correlato la concentrazione del dializzato di aminoacidi acidi di sue diverse fasi: la fase acuta dopo l'insulto epilettogena, la fase di latenza, tempo del primo grippaggio spontaneo e la phass cronica5,6,7. Inquadrare le fasi di malattia è stato attivato dal controllo del video-EEG a lungo termine e preciso EEG e caratterizzazione clinica di crisi epilettiche spontanee. Applicazione della tecnica del microdialysis connesso con controllo video-EEG a lungo termine ci ha permesso di proporre ipotesi meccanicistiche per neuropatologia TLE. In sintesi, la tecnica descritta in questo manoscritto permette l'abbinamento delle alterazioni neurochimiche all'interno di un'area definita del cervello con lo sviluppo e la progressione dell'epilessia in un modello animale.

Dispositivi associati, costituiti da un elettrodo di profondità giustapposto a una cannula di microdialisi, sono spesso impiegati in studi di ricerca di epilessia dove cambiamenti in neurotrasmettitori, loro metaboliti o substrati di energia dovrebbero essere correlate all'attività neuronale. Nella maggior parte dei casi, viene utilizzato a comportarsi liberamente gli animali, ma può anche essere condotta in modo simile in esseri umani, per esempio, in pazienti epilettici farmaco-resistente in fase di indagine di elettrodo di profondità prima della chirurgia8. Registrazione EEG sia dializzato raccolta può essere eseguita separatamente (ad esempio, impiantare l'elettrodo in un emisfero e la microdialisi della sonda in altro emisfero o anche eseguendo il microdialysis in un gruppo di animali durante l'esecuzione il suola EEG in un altro gruppo di animali). Tuttavia, gli elettrodi di accoppiamento a sonde può avere molteplici vantaggi: esso semplifica la chirurgia stereotassica, limita il danno di tessuto a un solo emisfero (mentre l'altra, lasciando intatti, come un controllo per gli esami istologici) e omogeneizza i risultati come questi sono ottenuti dalla stessa regione del cervello e l'animale stesso.

D'altra parte, la preparazione del dispositivo accoppiato microdialysis sonda elettrodo richiede abilità e il tempo se è fatta in casa. Uno potrebbe spendere quantità relativamente elevate di denaro se acquistato dal mercato. Inoltre, quando la microdialisi sonde (punte della sonda sono in genere 200-400 µm di diametro e 7-12 mm di lunghezza) sono9e gli elettrodi EEG (elettrodi sono solitamente di 300-500 µm di diametro e abbastanza a lungo per raggiungere la struttura del cervello di interesse10) accoppiato, il dispositivo montato rappresenta un oggetto ingombrante e relativamente pesante su un lato della testa, che è fastidioso per gli animali e incline a essere perso specialmente quando è collegato alla pompa dialisi e il sistema di registrazione EEG di filo duro. Questo aspetto è più rilevante negli animali epilettici che sono difficili da gestire e meno adattivo per le sessioni di microdialysis. Tecniche chirurgiche adeguate e appropriate cure post-operatorie possono provocare gli impianti di lunga durata che causano disagio minimo animale e dovrebbero essere perseguiti per esperimenti di microdialisi combinatorio-EEG10,11, 12.

Vantaggi e limiti della tecnica microdialysis sono stati esaminati in dettaglio da molti neuroscienziati. Il suo vantaggio primario rispetto ad altre in vivo aspersione tecniche (ad es., flusso rapido push-pull o aspersione corticale tazza) è un piccolo diametro della sonda che copre una zona relativamente precisa di interesse13,14, 15. In secondo luogo, la membrana di microdialysis crea una barriera fisica tra il tessuto e il perfusato; Pertanto, sostanze di alto peso molecolare non attraversano e non interferire con le analisi16,17. Inoltre, il tessuto è protetta dal flusso turbolento del perfusato18. Un altro importante vantaggio è la possibilità di modificare il flusso di perfusato per massimizzare la concentrazione dell'analita nel perfusato (cioè, il processo di microdialysis può ben essere definito matematicamente e può essere modificato per alto rendimento concentrazione dell'analita nel campione)19. Infine, la tecnica può essere utilizzata per infondere i farmaci o sostanze farmacologicamente attive nel tessuto di interesse e determinare il loro effetto presso il sito di intervento20. D'altra parte, microdialisi ha un tempo di risoluzione limitata (in genere più di 1 min a causa del tempo necessario per la raccolta di campioni) rispetto ai sensori elettrochimici o biologici; è una tecnica invasiva che provoca danni ai tessuti; compromette l'equilibrio neurochimico all'interno dello spazio intorno alla membrana dovuto la pendenza di concentrazione continua di tutte le sostanze solubili che entra il perfusato insieme con l'analita di interesse. Infine, la tecnica della microdialisi è fortemente influenzata dai limiti delle tecniche analitiche utilizzate per la quantificazione di sostanze del perfusato9,21,22,23 . La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) dopo derivatizzazione con orthophthaldialdehyde per l'analisi di glutammato e aspartato in campioni biologici è stato convalidato ben24,25,26 , 27 e la sua vasta discussione è fuori della portata di questo manoscritto, ma i dati prodotti con questo metodo verranno descritti in dettaglio.

Quando eseguita correttamente e senza modifiche della composizione di perfusato, microdialisi è in grado di fornire informazioni attendibili circa i livelli basali del rilascio di neurotrasmettitore. La maggior parte dei livelli basali è probabilmente il risultato di spillover trasmettitore da sinapsi9. Perché in molti casi il campionamento semplice del neurotrasmettitore nello spazio sinaptico extra non è sufficiente a perseguire gli obiettivi di un'inchiesta, la tecnica della microdialisi può essere impiegata anche per stimolare i neuroni o di privarli di importanti ioni fisiologici come K+ o Ca2 +, al fine di evocare o impedire il rilascio del neurotrasmettitore.

Alta K+ stimolazione viene spesso utilizzata in neurobiologia per stimolare l'attività neuronale non solo negli animali svegli, ma anche nelle colture primarie e organotipiche. L'esposizione di un sano sistema nervoso centrale a soluzioni con alte concentrazioni di K+ (40-100 mM) evoca l'efflusso di neurotrasmettitori28. Questa capacità dei neuroni di fornire una versione aggiuntiva in risposta ad alta K+ può essere compromessa in animali epilettici1 e in altre malattie di neurodegenerative29,30. Allo stesso modo, il Ca2 + privazione (ottenuta irrorando soluzioni Ca2 + libera) viene utilizzata per stabilire calcio-dipendente rilascio di neurotrasmettitori più misurati dal microdialysis. Si ritiene generalmente che il Ca2 + dipendente rilascio è di origine neuronale, considerando che il rilascio di Ca2 + indipendente proviene da cellule gliali, ma molti studi sollevato polemiche sopra il significato di Ca2 +-misure sensibili di es. glutammato o GABA9: così, se possibile, si consiglia di sostenere gli studi di microdialisi con microsensor studi, come questi ultimi hanno una più alta risoluzione spaziale e gli elettrodi consente di avvicinarsi alla sinapsi31.

Per quanto riguarda gli studi di microdialisi in animali epilettici, è importante sottolineare che i dati ottenuti dalla maggior parte di essi si basano su video o video-EEG monitoraggio dei grippaggi, cioè, dell'occorrenza transitoria di segni e/o i sintomi dovuto anormale sincrone o eccessiva attività neuronale nel cervello32. Ci sono alcune specifiche dei grippaggi elettrografici negli animali trattato Pilocarpina che dovrebbero essere considerati quando si prepara l'esperimento. Crisi epilettiche spontanee sono seguiti da attività depressa con frequenti punti interictal di EEG3 e si verificano in cluster33,34. Sham azionati non-epilettici animali possono esibire grippaggio-come attività35 e pertanto i parametri per la valutazione di registrazioni EEG dovrebbero essere standardizzato36 e, se possibile, i tempi di microdialysis sessioni dovrebbero essere ben definito. Infine, ti raccomandiamo vivamente di seguire i principi e le norme metodologiche per controllo del video-EEG in roditori adulti controllo delineato dagli esperti della International League Against Epilepsy e società americana di epilessia nei loro rapporti molto recenti37 ,38.

Qui, descriviamo il microdialysis del glutammato e aspartato in parallelo con le registrazioni video-EEG a lungo termine negli animali epilettici e la loro analisi nel dializzato da HPLC. Ci metterà in risalto i passaggi critici del protocollo che uno dovrebbe prendersi cura di per il miglior risultato.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Università di Ferrara istituzionale Animal Care e uso Comitato e dal Ministero italiano della salute (autorizzazione: D.M. 246/2012-B) in conformità con le linee guida delineate nelle Comunità europee Direttiva del Consiglio del 24 novembre 1986 (86/609/CEE). Questo protocollo è specificamente regolato per la determinazione del glutammato e aspartato in dializzato di cervello di ratto ottenuti sotto controllo EEG delle sessioni di microdialisi in ratti epilettici e non-epilettici. Molti dei materiali descritti qui può essere facilmente sostituiti con quelli che si utilizza nel suo laboratorio per le registrazioni di EEG o microdialysis.

1. montaggio del dispositivo Microdialysis sonda elettrodo

  1. Utilizzare un elettrodo ritorto due 3 canali (con almeno un 20 mm lunghezza dell'elettrodo registrazione di taglio e un 10 cm lungo elettrodo di messa a terra) e abbinarlo a una cannula di guida per preparare il dispositivo. Vedere esempi della cannula elettrodo e guida a 3 canali per dialisi in Figura 1A-1B.
  2. Rimuovere (Figura 1) e inserire (Figura 1), la cannula di metallo guida nella cannula di plastica fittizia un paio di volte prima l'utilizzo al fine di facilitare la sua rimozione nel momento del suo interruttore per sonda per microdialisi in animale.
  3. Piegare i fili intrecciati di registrazione elettrodo due volte (Figura 1E-1F) al fine di allineare i fili con la cannula fittizio della guida e tagliare la punta dell'elettrodo (Figura 1) per essere 0,5 mm più la punta della cannula guida (Figura 1 H) utilizzando il calibro a corsoio digitale.
  4. Avere pronto il cerchietto di silicone lungo 1 mm (diametro esterno 2 mm, spessore 0,3 mm; Figura 1I) e inserire la punta della cannula guida e la punta degli elettrodi contorti del cerchietto di silicio con le pinzette (Figura 1J). Risolvere il problema sul piede della Guida piedistallo cannula con colla di polimero di resina (Figura 1 K) o un'azione rapida. Vedere l'esempio dei dispositivi completati nella Figura 1 L e Figura 2A.
  5. Sterilizzare il dispositivo sotto luce UV germicida per 4 h. Capovolgere il dispositivo quattro volte così come ciascuno dei suoi lati è esposto alla luce per 1 h.
    Nota: Molte sonde elettrodi e microdialisi fatti in casa possono essere montate in modo simile. La testa di sopra descritto impianto per ratti ha le seguenti dimensioni: larghezza 7 mm x 5 mm profondità x lunghezza 10 mm dall'alto verso il piedistallo punta; la punta dell'impianto è di circa 11 mm di lunghezza, 600 µm di diametro e tutto il dispositivo pesa circa 330-360 mg. Il dispositivo può essere riutilizzato due o tre volte se (i) una lunghezza sufficiente di elettrodo di terra è lasciata sul cranio durante la chirurgia per il successivo utilizzo e (ii) quando l'animale viene ucciso, e il dispositivo recuperato insieme con il cemento dentale è lasciato in acetone estaurate t, tale che il cemento può essere meccanicamente disaggregato, e il dispositivo lavati e sterilizzati nuovamente.

2. stereotassica chirurgia

  1. Utilizzare un stereotassiche apparato e sonda clip porta (Figura 2B) per l'impianto del dispositivo seguendo gli standard contemporanei per ambulatori asettica e indolore39,40,41.
    1. Anestetizzare i ratti Sprague-Dawley adulti con miscela di chetamina/xilazina (43 mg/kg e 7 mg/kg, i.p.) e fissarlo sul telaio stereotassica. Aggiungere anestesia isoflurano (1,4% nell'aria; 1,2 mL/min) a iniezione iniziale di chetamina/xilazina e permette di controllare la profondità dell'anestesia in tempo. Radere il pelo sulla testa dell'animale.
  2. Tampone di superficie della pelle di testa di soluzione a base di iodio seguita da etanolo al 70% per prepararla per chirurgia asettica39.
    1. Impiantare il dispositivo di cannula-elettrodo guida preparato in precedenza (1.1-1.5) nell'ippocampo ventrale destra utilizzando le seguenti coordinate: naso bar + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm a bregma1,2. Seguire le tecniche standard per interventi di chirurgia stereotassica10,11,12.
    2. Assicurarsi che non copre le viti di ancoraggio. Quando montarlo sul apparato stereotassica, afferrare il dispositivo per la testa della cannula guida come questo può essere facilmente allineato al titolare della sonda.
  3. Ancorare il dispositivo al cranio con almeno quattro viti inox avvitandoli nell'osso del cranio (1 vite nella vite di sinistra e 1 nelle piastre di osso frontale destro, 1 vite in parietale sinistra e 1 vite nelle piastre dell'osso interparietale). Aggiungere una goccia di colla del tessuto per fissare ulteriormente ogni vite all'osso del cranio.
    1. Coprire metà della filettatura della vite con cemento metacrilico. Promuovere l'associazione del cemento facendo scanalature poco profonde nell'osso per aumentare l'aderenza.
  4. Una volta che la punta del dispositivo viene posizionata nel tessuto cerebrale, torcere il filo dell'elettrodo di terra intorno alle 3 viti di ancoraggio. Coprire tutto montate, le viti e il dispositivo con il cemento dentale12,42,43.
  5. Monitorare gli animali durante l'intervento chirurgico e per circa 1 h da allora in poi fino al montante e lo spostamento intorno alla gabbia. Tenerli su un tappetino riscaldante per evitare l'ipotermia. Consentire i ratti a recuperare per almeno 7 giorni dopo l'impianto del dispositivo.
  6. Monitorare gli animali almeno una volta al giorno per 3 giorni dopo l'intervento chirurgico per i segni di dolore o angoscia. Dare agli animali con la crema antibiotica (gentamicina 0,1%) vicino al sito inciso per prevenire l'infezione e un analgesico (tramadol 5 mg/kg, i.p.) per 3 giorni evitare il dolore post-operatorio.

3. induzione di epilessia del lobo temporale di pilocarpina e assegnazione degli animali ai gruppi sperimentali

  1. Dopo una settimana di recupero post-chirurgico, assegnare gli animali casualmente ai gruppi: (i) controllo animali che ricevono gli animali veicolo e (ii) epilessia che riceveranno la pilocarpina. Uso un numero proporzionalmente superiore di animali per gruppo epilettico dal momento che non tutti la pilocarpina amministrato ratti svilupperà la malattia.
  2. Iniettare una dose di methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) e 30 minuti dopo, una singola iniezione di pilocarpina (350 mg/kg, i.p.) per indurre il epilepticus di condizione (SE). Iniettare methylscopolamine e il veicolo (salino) per i ratti di controllo. Utilizzare siringa da 1 mL con ago da 25G per tutte le amministrazioni di i.p..
    1. Controllare visivamente gli animali per iniziare ad avere crisi epilettiche comportamentale (vibrissa entro 5 min, annuendo testa, clonazione degli arti in movimento) e a 25 min da duplicare continuamente tutto il corpo (SE).
  3. Arrestare il SE 2 h dopo l'inizio per avere una mortalità di circa il 25% e un periodo latente medio di circa 10 giorni dalla somministrazione di diazepam (20 mg/kg, i.p.). Osservare e registrare qualsiasi sequestro comportamento inizio immediatamente dopo l'iniezione di pilocarpina e continuare per almeno 6 ore da allora in poi.
  4. Dare le saline di animali (1ml, i.p.) usando la siringa da 1 mL con soluzione di ago e saccarosio 25G (1 mL, p.o.) utilizzando la siringa da 1 mL e ago 17G alimentazione flessibile per 2-3 giorni dopo SE per promuovere il recupero della perdita di peso corporeo.
    1. Escludere gli animali che non raggiungono il peso corporeo iniziale entro la prima settimana dopo Pilocarpina SE dallo studio (tranne che per il gruppo acuto ucciso 24 h dopo SE, dove il corpo peso follow-up non è possibile).
  5. Assegnare post-SE gli animali in modo casuale a diversi gruppi sperimentali (Figura 3): acuta di fase (dove il microdialysis avviene 24 ore dopo SE), latenza (7-9 giorni dopo SE), primo grippaggio spontaneo (circa 11 giorni dopo SE) e cronica (periodo inizia circa 22-24 giorni dopo SE, vale a dire circa 10 giorni dopo il primo sequestro). Monitorare gli animali per il verificarsi di crisi epilettiche spontanee.
    Nota: Utilizzare i seguenti criteri di inclusione/esclusione per ulteriori esperimenti in ratti epilettici: sviluppo di convulsiva SE entro 1 h dopo la somministrazione di Pilocarpina; aumento di peso nella prima settimana dopo il SE e il corretto posizionamento della sonda per microdialisi ed elettrodo.

4. analisi e monitoraggio del comportamento epilettico

  1. Monitoraggio a lungo termine del comportamento epilettico
    1. Circa 6 h dopo la somministrazione di pilocarpina (vale a dire, alla fine di osservazione diretta dai ricercatori), posizionare gli animali nelle gabbie casa pulita e avviare il monitoraggio video 24 h.
    2. Continuare il video 24h monitoraggio fino al giorno 5, utilizzando un sistema di videosorveglianza digitale.
    3. All'inizio della giornata 5, connettersi i ratti nelle loro gabbie rettangolari casa cablata sistema di registrazione EEG e continuare la sorveglianza video 24 h.
    4. Set di parametri dell'amplificatore, posizionato all'esterno la gabbia di Faraday (fattore di amplificazione impostato su ogni canale secondo la specificità del segnale EEG di ogni singolo animale) e l'acquisizione di inizio EEG osservando i segnali EEG generati dalla non connesso cavi. Uso campionamento frequenza 200 Hz e passa-basso filtro impostato a 0,5 Hz.
    5. Collegare l'animale ai cavi che tiene la testa di un animale tra allungate due dita di una mano e avvitamento verso il basso i connettori al piedistallo elettrodo con l'altra mano libera. Avviare l'acquisizione.
      Attenzione: Assicurarsi che il segnale sia privo di artefatti. Gli elementi comuni sono le punte che superano notevolmente la scala.
    6. Un giorno prima di sperimentano la microdialisi, trasferire gli animali nel sistema EEG tethered equipaggiato con cilindri in plexiglass per microdialisi. Scollegare gli animali da EEG tethering sistema in gabbia a casa strizzando i connettori dall'elettrodo senza frenare l'animale. Metti l'animale nei cilindri plexiglass alto.
  2. Monitoraggio del comportamento epilettico un giorno prima e durante la sessione di microdialisi
    1. Accendere l'amplificatore, posizionato all'esterno della gabbia di Faraday. Aprire il software di EEG. Avvia l'acquisizione di EEG osservando i segnali EEG prodotto da cavi non connessi.
    2. Collegare l'animale per il sistema di registrazione EEG tethered che tiene la testa di un animale tra allungate due dita di una mano e avvitamento verso il basso i connettori al piedistallo elettrodo con l'altra mano libera. Impostare un fattore di amplificazione (guadagno) su ogni canale dell'amplificatore secondo segnale elettrodo del singolo animale, quindi il segnale EEG è in scala. Lasciate che l'animale Esplora la nuova gabbia (cilindro) per almeno 1 h sotto l'osservazione diretta del ricercatore.
    3. Nota: 24 ore prima la microdialisi esperimento, i ratti sono brevemente anestetizzati con isoflurano per l'interruttore di cannule di guida alla sonda per microdialisi. Approfitta del momento quando essi sono anestetizzati per collegarli al sistema di registrazione EEG.
    4. Accorciare o prolungare il cavo pendulo secondo delle materie prime dell'animale. Assicurarsi che i cavi non interferiscano con i movimenti e la postura menzogne dell'animale.
    5. Controllare l'inquadratura corretta immagine delle telecamere. Avviare la registrazione video-EEG.
  3. Identificazione dei grippaggi e attività EEG
    1. Utilizzare un player software per guardare i video. Scorrere il film 8 volte più veloce rispetto al tempo reale giocando e individuare i grippaggi generalizzati (Vedi animale parte posteriore con il clonus arto anteriore o animale allevamento e cadere con il clonus zampa anteriore). Rallentare il video e annotare l'ora precisa dell'inizio e della fine del sequestro del comportamento.
    2. Processo i dati contando il numero dei grippaggi generalizzati osservato nella 24 ore di registrazioni video e di esprimere in termini di frequenza delle crisi e la durata come valori medi di tutti i sequestri osservati in 24h.
    3. Definire i grippaggi di EEG come i periodi di attività parossistica di alta frequenza (> 5 Hz) caratterizzata da un > incremento di ampiezza 3 volte rispetto al basale con la progressione della frequenza spike che dura da un minimo di 3 s2,44 o simile a28. Utilizzare software di EEG per elaborare le registrazioni di EEG grezze. Dividere le tracce di EEG in frazioni di 1 h. Copiare le frazioni di tracciato EEG per il file per l'analisi di software automatico spike.
    4. Analizzare i dati di attività EEG utilizzando software di EEG e parametri predefiniti (4.3.3.). Effettuare tutte le analisi dei video in due ricercatori indipendenti che sono ciechi per il gruppo di animali analizzati. In caso di divergenza, li rendono di riesaminare i dati insieme per raggiungere un consenso45.

5. microdialisi

  1. In vitro recupero sonda
    1. Preparare la sonda per il primo utilizzo secondo le istruzioni del produttore, la gestione in sua custodia protettiva.
    2. Eseguire l'esperimento in triplice copia: preparare tre provette da 1,5 mL caricarli con 1 mL di soluzione di Ringer contenente la miscela di standard (2,5 µM di glutammato) e 2,5 µM di aspartato. Mettere tre caricato 1,5 mL provette nel blocco riscaldatore set a 37 ° C e posizionarlo sull'agitatore.
      Nota: Utilizzare le stesse soluzioni standard per tarature di cromatografia.
    3. Sigillare le provette da 1,5 mL con la pellicola di paraffina e perforarla di pinzette taglienti per fare un buco di circa 1 mm di diametro.
    4. Prendere la sonda e inserirlo nel foro fatto nel film di paraffina. Immergere la membrana almeno 2 mm sotto il livello della soluzione. Difficoltà ulteriormente la sonda a 1,5 mL provetta da film di paraffina.
      Attenzione: Assicurarsi che la punta non tocchi le pareti della provetta da 1,5 mL.
    5. Collegare l'entrata della sonda alla siringa montata la pompa di infusione utilizzando adattatori FEP-tubi e tubazioni. Facoltativamente, utilizzare bene foro tubi politene di 0,28 mm ID e 0,61 mm OD e adattatori tubi colorati (rosso e blu della tubazione adattatori) per le connessioni.
    6. Avviare la pompa a 2 µ l/min e lasciare che il fluido appaiono all'estremità di uscita. Collegare l'uscita di sonda con 0,2 mL provetta usando adattatori FEP-tubi e tubi di raccolta.
      Nota: Utilizzare tubazione di FEP per tutte le connessioni. Tagliare alla lunghezza desiderata del tubo utilizzando una lama di rasoio. Utilizzare schede di tubi di diverso colore per ingresso e uscita della sonda. Lasciare la pompa esegue per 60 min. Check per perdite e bolle d'aria. Questi non dovrebbero essere presenti.
    7. Impostare la pompa per il portata 2 µ l/min e iniziare a raccogliere i campioni sul lato di uscita del tubo.
    8. Raccogliere tre campioni di perfusato 30 min e tre campioni di uguale volume della soluzione nella provetta da 1,5 mL. Prelevare i campioni di volume uguale dalla provetta da 1,5 mL ogni 30 min utilizzando la microsiringa immerso nella soluzione standard nella provetta da 1,5 mL.
    9. Ripetere l'esperimento (5.1.1-5.1.8) impostazione della pompa per la portata 3 µ l/min (5.1.7) per avere un confronto di recupero sonda quando si utilizzano due portate diverse di aspersione.
    10. Al termine, arrestare la pompa e sciacquare il tubo con acqua distillata, etanolo al 70% e spingere l'aria in esso. Conservare la sonda in un flacone riempito con acqua distillata. Sciacquare la sonda irrorando a 2 µ l/min di acqua distillata prima del deposito.
    11. Analizzare la concentrazione del glutammato e aspartato nei campioni di cromatografia (vedere i dettagli qui sotto; 6,3).
    12. Calcolare il recupero utilizzando la seguente equazione:
      Recupero (%) = (Cperfusato /Cdializzati soluzione) x 100.
  2. Sessioni di microdialisi in ratti liberi di muoversi
    1. Preparative procedure: inserimento della sonda e verifica, infusione pompa impostazione e avviare
      1. Preparare le sonde di microdialysis per il primo utilizzo secondo le istruzione del produttore e riempirli con soluzione di Ringer. Tagliare circa 10cm lunghi pezzi di FEP-tubazione e collegarle alle cannule di aspirazione e mandata della sonda utilizzando gli adattatori di tubi di colori diversi.
      2. Assicurarsi che il tubo tocca le schede senza spazio morto in tutte le connessioni.
      3. 5.2.1.3. 24 h prima dell'esperimento di microdialisi, brevemente anestetizzare l'animale con isoflurano (5% in aria) in una camera di induzione fino a recumbent. Rimuovere la cannula fittizia dalla sua guida con le pinzette e tenendo saldamente la testa dell'animale. Inserire la sonda per microdialisi, dotata di una membrana dialyzing, nella cannula guida e ditta ulteriormente le cannule di microdialysis inserite nella loro guida da argilla di modellistica.
        Attenzione: La sonda non devono toccare le pareti del manicotto protettivo sonda durante l'estrazione.
      4. Mettere l'animale nel cilindro in plexiglass e lasciarlo a esplorare il nuovo ambiente. Connettersi al sistema di registrazione EEG legato l'animale come descritto sopra (seguire i punti 4.2.2 e 4.2.3).
      5. Seguire la sveglio e liberi di muoversi movimenti di ratto e connettere l'ingresso della sonda alla siringa 2,5 mL con ago 22G blunted contenente soluzione di Ringer utilizzando gli adattatori di tubi. Spingere il lattato Ringer all'interno della sonda espulsione 1 mL di soluzione di Ringer in 10 s continuamente spingendo il pistone della siringa da 2,5 mL. Verifica per la goccia di liquido che appaiono sulla presa. La sonda è ora pronta per l'uso.
      6. Riempire le siringhe di 2,5 mL collegate alla tubazione di FEP da adattatori di tubi con soluzione di Ringer e montarli sulla pompa di infusione. Avviare la pompa a 2 µ l/min. Lasciar correre tutta la notte.
        Nota: Utilizzare la lunghezza desiderata del FEP-tubazione di tutto ma calcolare il volume morto della tubazione di sapere quando deve essere avviata la stimolazione di K+ alta e di correlare i dati di quantificazione con cambiamenti neurochimici nel cervello degli animali. Utilizzare la bolla d'aria creata nel tubo sotto il flusso di lavoro per calcolare questa volta.
    2. Raccolta dei campioni durante la stimolazione di potassio e registrazione EEG
      1. Verificare l'assenza di grippaggi in 3 ore che precedono l'inizio della raccolta del campione (registrazioni video-EEG) e continuare a monitorare l'attività di sequestro durante microdialysis.
      2. Fermare la pompa che trasportano le siringhe di FEP-tubazione cannulata riempite con soluzione di Ringer. Montare sulla pompa un altro set di siringhe da 2,5 mL collegato alla tubazione di FEP con tubi adattatori riempiti con soluzione di Ringer un modificato contenente 100 mM K+ soluzione.
      3. Avviare la pompa a 2 µ l/min e lasciar correre. Per il più rapido riempimento della tubazione, è necessario impostare la pompa a 5 µ l/min per il tempo di riempimento. Verificare l'assenza di bolle d'aria nel sistema. Assicurarsi che il tubo tocca le schede senza spazio morto in tutte le connessioni.
      4. La sonda di prova se pronto per l'uso in animali come descritto sopra (5.2.1.5).
        Nota: Se per qualche motivo la sonda non funziona, è necessario modificarlo. Per questi casi, mantenere alcuni preparati microdialysis sonde pronti per l'uso vicino alla workstation di microdialysis-EEG. Scollegare l'animale da EEG cavi e anestetizzare brevemente con isoflurano se necessario per realizzare il cambiamento.
      5. Collegare la tubazione di FEP di siringhe riempito con soluzione di Ringer per la cannula di aspirazione della sonda in ogni animale e attendere la comparsa della goccia del liquida sulla punta della presa.
      6. Collegare l'uscita della sonda con la tubazione di FEP, che conduce alla raccolta nella provetta. Inserire la tubazione di FEP nella provetta 0,2 mL chiuso con un tappo forato. Assicurarsi che il tubo rimanga nel posto di fissaggio con un pezzo di argilla di modellistica.
      7. Continuare a far funzionare la pompa a 2 µ l/min per 60 min senza raccogliere campioni per equilibrare il sistema (campione di zero).
      8. Raccogliere 5 campioni di dializzato consecutivi 30 min (60 µ l di rispettivi) sotto condizioni di base (perfusione con soluzione di Ringer lattato normale). Conservare i campioni su ghiaccio.
      9. Calcolare il tempo che necessario liquido per passare dalla pompa nella testa dell'animale (dipende dal volume morto di tubazione, vale a dire, tempo di bolla di aria) e passare la tubazione di FEP che va dalle siringhe contenenti la soluzione di Ringer lattato normale per siringhe contenenti modificato lattato (100 mM K+) Ringer in questo momento senza fermare la pompa. Verificare l'assenza di bolle d'aria nel sistema. Lasciare la pompa per 10 min.
        Attenzione: In 10 min di alta K+ stimolazione, gli animali tendono a muoversi se stessi freneticamente e di solito presentano un gran numero di cane bagnato scuote (controllo e fuori gli animali sequestro cluster) o comportamentali sequestri (animali epilettici), in modo da essere pronti ad intervenire per proteggere i tubi e i cavi da torsione.
      10. Dopo 10 minuti, passare il tubo dalle siringhe contenenti 100 mM K+ Ringer soluzione alla soluzione di Ringer lattato normale e far funzionare la pompa. Non spegnere la pompa durante i cambiamenti di soluzione affinché che ci sarà una goccia di liquido all'estremità del tubo per essere collegati in linea.
      11. Dal momento in cui il dialisato contiene alto potassio, vale a dire, dopo la raccolta del quinto post-equilibrazione del dializzato, raccogliere le frazioni del dializzato ogni 10 min (20 µ l) per i campioni del dializzato di 1 h. 3 raccogliere ulteriori 30 min e interrompere la pompa. Conservare i campioni su ghiaccio.
      12. Conservare i campioni a-80 ° C dopo l'esperimento fino all'analisi HPLC.
      13. Ripetere che il microdialysis sperimentare per 3 giorni consecutivi, ad eccezione del acuta (24h) e il primo gruppo di sequestro, in cui sola microdialysis sessione avviene 24h dopo SE o all'interno di 24 h dopo il primo grippaggio spontaneo (Figura 3).
      14. Al termine di ogni esperimento, eutanasia animale con un'overdose di anestetica e rimuovere il cervello per la verifica del posizionamento sonda e l'elettrodo.
  3. Procedure post-microdialisi
    1. Sciacquare le sonde usate microdialisi con acqua distillata e memorizzarli in un flacone riempito con acqua distillata fino all'utilizzo successivo.
      Nota: Le membrane riutilizzate possono avere maggior permeabilità; Verifica per il recupero della sonda prima dell'uso ripetuto.
    2. Sciacquare il microdialysis intero set up (tubi, connettori e siringhe) con acqua distillata seguita da etanolo al 70%. Sostituire etanolo con aria e archiviare il set di in un ambiente sterile.
    3. I campioni di dializzato basali si divise in 20 µ l e utilizzare un solo 20 µ l frazione per analisi concentrazione basale dell'amminoacido. Memorizzare il volume restante del campione per analisi ulteriore o di conferma a-80 ° C.
    4. Difficoltà i cervelli in formalina al 10% e preservarli dall'inclusione in paraffina1. Coronalmente sezione i cervelli a fette e li macchia con ematossilina ed eosina. Esaminare il cervello per sonda corretta e posizionamento elettrodo1,2.
      Nota: Difficoltà i cervelli in raffreddato 2-metilbutano e conservarli a-80 ° C. Utilizzare altri macchiatura provata sulle sezioni di tessuto nervoso che permette di visualizzare il tratto di sonda ed elettrodo.

6. gascromatografica di glutammato e aspartato

  1. Preparazione del derivatizzante agente
    1. Mescolare i rispettivi volumi 20:1 (v/v) di reagente orthophthaldialdehyde (OPA) e 2-mercaptoetanolo (5-ME) nel flaconcino. Chiudere la fiala utilizzando il setto stretto tappo e aria.
      Attenzione: Lavorare sotto cappa chimica.
    2. Vortice la soluzione preparata e metterla nell'autocampionatore nella posizione per derivatizzante agente.
  2. Preparazione dei campioni del dializzato
    1. Mettere l'inserto di vetro con molla inferiore nel flacone marrone autosampler 2 mL. Preparare i flaconi per tutti i campioni misurati in un unico batch.
    2. Prendere il 20 campioni di dialisi µ l dal congelatore a-80 ° C e farli sciogliere. Rimuovere 1 µ l della soluzione e aggiungere 1 µ l di standard interno (IS) L-omoserina (50 µM) a 19 µ l del campione, così il campione contiene 2,5 µM di IS. Pipettare 20 µ l del campione dialisi nell'inserto in flaconcino di vetro e sigillare con un setto di tenuta d'aria.
    3. Posizionare le fiale contenenti i campioni nell'autocampionatore utilizzando il software cromatografico per etichettare i campioni nelle loro posizioni.
  3. Analisi cromatografica dei campioni per determinare la concentrazione di glutammato e aspartato
    1. Eseguire le analisi sul sistema cromatografo liquido con rilevazione di spectrofluorometric. Rilevare gli aminoacidi dopo 2 min pre-colonna derivatizzazione con 20 μL di orthophthaldialdehyde/5-mercaptoetanolo 20:1 (v/v) aggiunto al 20 μL di campione.
    2. Preparare il sistema per l'analisi di amminoacidi. Accendere l'autocampionatore, la pompa, il degassificatore, il rilevatore e unità di controllo insieme al computer.
    3. Immergere i sifoni delle bottiglie contenenti la fase mobile e i canali della pompa deve essere utilizzato per l'analisi cromatografica di spurgo.
    4. Iniziare ad aumentare il flusso della fase mobile controllando la pressione sulla colonna (ad esempio, iniziare a 0,2 mL/min e aumentare il flusso per ulteriori 0,2 mL/min ogni 5 min fino a raggiungere il flusso di lavoro). Lasciate che il sistema corre al lavoro flusso 0,8 mL/min per almeno 1 h equilibrare la colonna.
      Attenzione: Pressione instabile indica la presenza di aria nel sistema. La pressione non deve superare 25 MPa.
    5. Impostare il guadagno, alta sensibilità e le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione sul rilevatore di 345/455 nm rispettivamente. Reimpostare il segnale del rivelatore (AUTOZERO).
    6. Utilizzando il software cromatografico, il metodo send allo strumento. Ora, il cromatografo dovrebbe essere pronto a misurare.
    7. Separare i campioni del dializzato, standard a spillo campioni di dializzato, nonché standard (0,25 µM – 2,5 µM aspartato e glutammato in soluzione di Ringer) sulla colonna cromatografica appropriata. Calibrare il metodo cromatografico e stabilire i limiti di rilevazione e quantificazione prima di qualsiasi analisi di campioni di dialisi.
    8. Attivare l'analisi singola o creare la sequenza dei campioni da analizzare utilizzando il software di cromatografia ed eseguire la sequenza.
      Attenzione: Eseguire più di un campione in bianco e diversi campioni standard all'interno della sequenza di campioni del dializzato al fine di controllare l'accuratezza del metodo.
    9. Una volta acquisiti i cromatogrammi, analizzarli con il software di cromatografia. Verifica l'integrazione dei picchi dell'interesse la trama di calibrazione. Utilizzare area di altezza o picco picco per la quantificazione.
    10. Una volta terminata la registrazione di esempio riempire la colonna e il sistema con un solvente organico (ad es., 50% acetonitrile in acqua ultrapura) per prevenire l'invecchiamento e muffa nella crescita in esso.
    11. Arrestare il sistema.

Risultati

Recupero della sonda

Il recupero medio (cioè, il contenuto medio dell'amminoacido nel perfusato come percentuale del contenuto in un volume uguale di soluzione flaconcino) era 15.49 ± 0,42% ad una portata di 2 μL/min e 6.32 ± 0,64 a 3 μL/min per il glutammato e 14.89 ± 0,36% ad una portata di 2 ΜL/min e 10.13 ± 0.51 a 3 μL/min per aspartato quando si utilizza la sonda di membrana cuprophane. Se si utilizza la son...

Discussione

In questo lavoro, vi mostriamo come una registrazione video-EEG continua accoppiata con microdialisi può essere eseguita in un modello sperimentale di TLE. Vengono utilizzate tecniche di registrazione video-EEG per diagnosticare correttamente le diverse fasi di progressione della malattia negli animali e la tecnica della microdialisi è usata per descrivere i cambiamenti nel rilascio di glutammato che si verificano nel tempo (i cambiamenti non sono stati trovati per aspartato in un studio precedentemente pubblicato

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare Anna Binaschi, Paolo Roncon ed Eleonora Palma per il loro contributo ai manoscritti pubblicati in precedenza.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
3-channel two-twisted electrodeInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPCMaterial
guide cannulaAgn Tho's, Lindigö, SwedenMAB 4.15.ICMaterial
Resin KK2 PlastikElettra Sport, Lecco, ItalyKK2Material
Super Attack gel LoctiteHenkel Italia Srl, Milano, Italy2047420_71941Material
Imalgene-KetamineMerial, Toulouse, France221300288 (AIC)Solution
XylazineSigma, Milano, ItalyX1251Material
Isoflurane-VetMerial, Toulouse, France103120022 (AIC)Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadolFormevet, Milano, Italy103703017 (AIC)Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycineMSD Italia, Roma, Italy20891077 (AIC)Material
simplex rapid dental cementKemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United KingdomACR811Material
GlasIonomer CX-Plus CementShofu, Kyoto, JapanPN1167Material
probe clip holderAgn Tho's, Lindigö, Swedenp/n 100 5001Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin AdhesiveTissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USATS1050044FPMaterial
Valium 10 mg/2 ml - diazepamRoche, Monza, Italy019995063 (AIC)Material
1 mL syringe with 25G needleVetrotecnica, Padova, Italy11.3500.05Material
rat flexible feeding needle 17GAgn Tho's, Lindigö Sweden7206Material
Grass Technology apparatusGrass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USAM665G08Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150Biopac, Goleta, California, USAMP150WSWEquipment
digital video surveillance systemAverMedia Technologies, Fremont, California, USAV4.7.0041FDEquipment
microdialysis probeAgn Tho's, Lindigö SwedenMAB 4.15.1.CuMaterial
microdialysis probeSynaptech, Colorado Springs, Colorado, USAS-8010Material
block heaterGrant Instruments, Cambridge, EnglandQBD2Equipment
stirrerCecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy711Equipment
infusion pumpUniventor, Zejtun, Malta864Equipment
fine bore polythene tubingSmiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA800/100/100/100Material
blue tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1002Material
red tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1003Material
2.5 mL syringe with 22G needleChemil, Padova, ItalyS02G22Material
vial capCronus, Labicom, Olomouc, Czech RepublicVCA-1004TB-100Material
septumThermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USANational C4013-60 8 mm TEF/SIL septumMaterial
glass insert with bottom springSupelco, Sigma, Milano, Italy27400-UMaterial
autosampler vialNational Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, ItalyC4013-2Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unitKnauer, Berlin, GermanyV7602Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pumpKnauer, Berlin, GermanyV7603Equipment
spectrofluorometric detectorShimadzu, Kyoto, JapanRF-551Equipment
chromatogrphic columnKnauer, Berlin, Germany25EK181EBJMaterial
chromatogrphic pre-columnKnauer, Berlin, GermanyP5DK181EBJMaterial
mobile phase solution A0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0Solution
mobile phase solution B40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5Solution
Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
modified Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
saline0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0Solution
sucrose solution10% sucrose in distilled waterSolution

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