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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Methode zur in Vivo Mikrodialyse Aspartat- und Glutamat Freisetzung im ventralen Hippocampus von epileptischen und nicht-epileptischen Ratten, in Kombination mit EEG-Ableitungen zu analysieren. Extrazelluläre Konzentrationen von Aspartat- und Glutamat können mit den verschiedenen Phasen der Erkrankung korreliert werden.

Zusammenfassung

Mikrodialyse ist eine gut etablierte Neurowissenschaften-Technik, die die Veränderungen der neurologisch Wirkstoffe diffundieren in das Gehirn zwischenräumlichen Raum mit dem Verhalten und/oder mit das konkrete Ergebnis der Pathologie (z. B. Anfälle korreliert für Epilepsie). Bei Epilepsie zu studieren, ist die Mikrodialyse-Technik oft mit kurzfristige oder auch langfristige Video-Elektroenzephalographie (EEG Überwachung zur Beurteilung von spontanen Anfall Frequenz, Schweregrad, Verlauf und clustering) kombiniert. Das kombinierte Mikrodialyse-EEG basiert auf der Verwendung von mehreren Methoden und Instrumenten. Hier führten wir in Vivo Mikrodialyse und kontinuierlichen Video-EEG-Aufzeichnung auf Monitor Glutamat und Aspartat-Abfluss im Laufe der Zeit in verschiedenen Phasen des natürlichen Verlaufs der Epilepsie in einem Rattenmodell. Dieser kombinierte Ansatz ermöglicht es, die Paarung von Änderungen in der Neurotransmitter-Freisetzung mit bestimmten Phasen der Krankheitsentwicklung und Fortschreiten. Die Aminosäure-Konzentration in das Dialysat wurde durch flüssige Chromatographie bestimmt. Hier beschreiben wir die Methoden und die Gliederung der wichtigsten eins während in Vivo Mikrodialyse Vorsichtsmaßnahmen sollten-EEG, mit besonderem Augenmerk auf der stereotaktischen Operation, basale und hohe Kalium Stimulation während der Mikrodialyse, Tiefe Elektrode EEG-Aufzeichnung und Analyse der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie Aspartat-und Glutamat in das Dialysat. Dieser Ansatz kann angepasst werden, eine Vielzahl von Drogen oder Krankheit testen induzierte Veränderungen der physiologischen Konzentrationen von Aspartat- und Glutamat im Gehirn. Abhängig von der Verfügbarkeit eines geeigneten analytischen Assay kann es weiter verwendet werden, verschiedene lösliche Moleküle zu testen, bei der EEG-Aufzeichnung zur gleichen Zeit beschäftigen.

Einleitung

Um Einblick in die Funktionsbeeinträchtigung der Glutamat-vermittelte exzitatorischen und GABAergen inhibitorischen Neurotransmission spontane Anfälle im Temporallappen-Epilepsie (TLE) wodurch überwacht wir systematisch extrazelluläre Konzentrationen von GABA1 und später die Ebenen von Glutamat und Aspartat-2 durch Mikrodialyse im ventralen Hippocampus von Ratten zu verschiedenen Zeitpunkten der natürlichen Krankheit Kurs, d.h.während der Entstehung und Progression von Epilepsie. Wir nutzten die TLE Pilocarpin Modell bei Ratten, das die Krankheit sehr genau in Bezug auf Verhalten, elektrophysiologische und histopathologische Veränderungen3,4 imitiert und wir korreliert die Dialysat Konzentration von amino Säuren, die verschiedenen Phasen: die akute Phase nach der epileptogenen Beleidigung, die Latenz-Phase, die Zeit der ersten spontanen Anfall und die chronische Phass5,6,7. Gestaltung der Phasen der Krankheit wurde durch Langzeit-Video-EEG-monitoring und die präzise EEG und klinische Charakterisierung von spontaner Anfälle ermöglicht. Anwendung der Mikrodialyse Technik im Zusammenhang mit Langzeit Video-EEG-monitoring erlaubt uns, mechanistische Hypothesen für TLE Neuropathologie vorzuschlagen. Zusammenfassend lässt sich sagen ermöglicht die Technik beschrieben in dieser Handschrift die Paarung von neurochemischen Veränderungen innerhalb einer definierten Gehirnregion mit der Entstehung und Progression von Epilepsie im Tiermodell.

Gekoppelte Geräte, bestehend aus einer Tiefe Elektrode an eine Kanüle Mikrodialyse gegenübergestellt werden oft an Epilepsie Forschungsstudien eingesetzt wo Veränderungen der Neurotransmitter, ihrer Metaboliten oder Energie-Substrate mit neuronaler Aktivität korreliert werden sollte. In der überwiegenden Mehrheit der Fälle es ist in frei Verhalten Tiere verwendet, aber es kann auch in ähnlicher Weise in den Menschen, z. B.bei Pharmaco-resistente epileptischen Patienten Tiefe Elektrode Untersuchung vor der Operation8durchgeführt werden. EEG-Aufzeichnung sowohl Dialysat Sammlung kann separat durchgeführt werden (z. B.Implantation der Elektrode in einer Hemisphäre und der Mikrodialyse Sonden in die andere Hemisphäre oder sogar der Mikrodialyse in einer Gruppe von Tieren während der Durchführung das alleinige EEG in eine andere Gruppe von Tieren). Kopplung der Elektroden, Sonden müssen jedoch mehrere Vorteile: es vereinfacht stereotaktischen Chirurgie, Gewebeschäden, nur eine Hemisphäre beschränkt (wobei andererseits intakt, wie ein Steuerelement für histologische Untersuchungen), und die Ergebnisse wie diese homogenisiert ergeben sich aus der gleichen Region des Gehirns und das gleiche Tier.

Auf der anderen Seite erfordert die Vorbereitung des gekoppelten Mikrodialyse Sonde Elektrode Geräts Fähigkeiten und Zeit wenn es hausgemacht ist. Man konnte relativ hohe Mengen an Geld ausgeben, wenn vom Markt gekauft. Darüber hinaus Wenn Mikrodialyse Sonden (Prüfspitzen sind in der Regel 200-400 µm im Durchmesser und 7 bis 12 mm lang) sind9und EEG-Elektroden (Elektrodenspitzen sind in der Regel von 300-500 µm im Durchmesser, und lang genug um die Gehirnstruktur von Interesse10zu erreichen) gekoppelt, stellt das montierte Gerät ein sperriges und relativ schweres Objekt auf einer Seite des Kopfes, die ist für Tiere lästig und fehleranfällig, verloren zu werden, vor allem, wenn es an die Dialyse-Pumpe und die harten Draht EEG Recording-System angeschlossen ist. Dieser Aspekt ist in epileptische Tiere, die schwierig zu handhaben und weniger anpassungsfähig an die Mikrodialyse-Sitzungen sind relevanter. Richtige Operationstechniken und angemessene Nachsorge können dauerhafte Implantate, die minimale Tier Unbehagen verursachen und sollte verfolgt werden, für kombinatorische Mikrodialyse-EEG10,11, Experimente führen 12.

Die Vorzüge und Grenzen der Mikrodialyse Technik wurden durch viele Neurowissenschaftler im Detail überprüft. Der primäre Vorteil gegenüber anderen in Vivo Perfusion Techniken (z.B., Push-Pull-schnelle Strömung oder kortikale Tasse Perfusion) ist eine kleine Durchmesser der Sonde, die eine relativ genaue Fläche von Interesse13,14, 15. Zweitens schafft die Mikrodialyse Membran eine physische Barriere zwischen dem Gewebe und dem Perfusat; Daher hochmolekularen Gewicht Substanzen nicht überqueren und nicht stören die Analyse16,17. Darüber hinaus wird das Gewebe von der turbulenten Strömung Perfusat18geschützt. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist die Möglichkeit, Perfusat Fluss zur Maximierung der Analyt-Konzentration in der Perfusat ändern (d. h., der Prozess der Mikrodialyse können mathematisch wohldefinierte und können geändert werden, um hohe Ausbeute Konzentration des Analyten in der Probe)19. Schließlich kann die Technik, Drogen oder pharmakologisch wirksamer Substanzen in das Gewebe von Interesse zu ziehen und ihre Wirkung am Ort der Intervention20bestimmen verwendet werden. Auf der anderen Seite hat Mikrodialyse zeitlich begrenzte Auflösung (in der Regel mehr als 1 min aufgrund des Zeitaufwands für Probenahmen) im Vergleich zu elektrochemischen oder biologischen Sensoren; Es ist eine invasive Technik, die Gewebeschäden verursacht; Es beeinträchtigt die neurochemische Gleichgewicht in den Raum um die Membran durch die kontinuierliche Konzentration Steigung von allen löslichen Substanzen tritt die Perfusat zusammen mit den Analyten von Interesse. Zu guter Letzt ist die Mikrodialyse-Technik stark beeinflusst durch die Grenzen der analytischen Techniken für die Quantifizierung von Substanzen im Perfusat9,21,22,23 . Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) nach Derivatisierung mit Orthophthaldialdehyde für Glutamat und Aspartat-Analyse in biologischen Proben gut validierte24,25,26 wurde , 27 und seine umfangreiche Diskussion ist außerhalb des Bereichs dieser Handschrift, aber die Daten, die mit dieser Methode werden im Detail beschrieben werden.

Wenn richtig und ohne Änderungen der Zusammensetzung Perfusat durchgeführt, bieten Mikrodialyse verlässlichen Informationen über den basalen Ebenen der Freisetzung von Neurotransmittern. Der größte Teil der basalen Ebenen ist wahrscheinlich das Ergebnis Sender Spillover aus den Synapsen-9. Da die einfache Probenahme des Neurotransmitters im extra synaptischen Raum in vielen Fällen nicht ausreichen, um die Ziele einer Untersuchung zu verfolgen ist, kann die Mikrodialyse-Technik auch Neuronen stimulieren oder für sie wichtige berauben eingesetzt werden physiologischen Ionen wie K+ oder Ca2 +, um hervorrufen oder verhindern die Freisetzung des Neurotransmitters.

Hohe K+ -Stimulation ist oft in Neurobiologie zur neuronalen Aktivität nicht nur wach Tiere, sondern auch in Grund- und organotypischen Kulturen zu fördern. Die Belichtung ein gesundes zentrales Nervensystem zu Lösungen mit hohen Konzentrationen von K+ (40-100 mM) erinnert an die Fluth von Neurotransmittern28. Diese Fähigkeit von Nervenzellen, eine zusätzliche Freisetzung als Reaktion auf hohe K+ möglicherweise epileptische Tiere1 und in anderen neurodegenerativen Krankheiten29,30gefährdet. Ebenso die Ca2 + Entzug (durch Vorrichtung Ca2 + kostenlose Lösungen erhalten) verwendet wird, um Kalzium-abhängige zu etablieren-release von die meisten Neurotransmitter Mikrodialyse gemessen. Es wird allgemein angenommen, dass Ca2 + abhängige Release neuronalen Ursprungs, während Ca2 + unabhängige Freisetzung aus Glia stammt, aber viele Studien Kontroverse über die Bedeutung von Ca2 hoben +-empfindliche Messungen von z.B. Glutamat oder GABA9: also, wenn möglich, es empfiehlt sich, Mikrodialyse Studien mit Reinstraum Studien zu unterstützen, da diese letztere haben eine höhere räumliche Auflösung und die Elektroden näher an Synapsen31.

Bei epileptischen Mikrodialyse Tierstudien ist es wichtig zu betonen, dass die meisten von ihnen gewonnenen Daten verlassen sich auf video oder Video-EEG Überwachung der Anfälle, d. h., das vorübergehende Auftreten von Anzeichen oder Symptome durch abnorme übermäßige oder synchrone neuronaler Aktivität im Gehirn32. Es gibt einige Besonderheiten der elektrographischen Anfälle bei Tieren Pilocarpin behandelt, die berücksichtigt werden sollten, wenn Sie das Experiment vorbereiten. Spontane Anfälle treten in Clustern33,34und deprimiert Tätigkeit mit häufigen EEG korreliert Spitzen3 folgt. Schein operierten nicht-epileptische Tiere Beschlagnahme-ähnliche Aktivität35 aufweisen können sollte und daher die Parameter für EEG-Aufnahmen Bewertung standardisierte36 und, wenn möglich, sollte das Timing der Mikrodialyse Sitzungen gut definiert werden. Zu guter Letzt empfehlen wir nach den Prinzipien und methodische Standards zur Video-EEG Überwachung bei Erwachsenen Nagetieren Kontrolle von Experten der internationalen Liga gegen Epilepsie und amerikanischen Epilepsie Gesellschaft in ihren jüngsten Berichten37 beschrieben. ,38.

Hier beschreiben wir Mikrodialyse Glutamat und Aspartat-parallel mit der langfristigen Video-EEG-Ableitungen epileptische Tiere und deren Analyse in das Dialysat durch HPLC. Wir werden die entscheidenden Schritte des Protokolls zu betonen, die man für das beste Ergebnis kümmern sollte.

Protokoll

Alle experimentelle Verfahren von der University of Ferrara institutionelle Animal Care and Use Committee und vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigt worden (Autorisierung: d.m. 246/2012-B) im Einklang mit den Richtlinien der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des 24. November 1986 (86/609/EWG). Dieses Protokoll ist speziell für Glutamat und Aspartat-Bestimmung in Ratte Gehirn Dialysates gemäß EEG Kontrolle der Mikrodialyse Sitzungen bei epileptischen und nicht-epileptischen Ratten erhaltenen angepasst. Viele der hier beschriebenen Materialien können leicht mit denen ersetzt werden, die man in seinem Labor für EEG-Ableitungen oder Mikrodialyse verwendet.

1. Montage des Gerätes Mikrodialyse Sonde-Elektrode

  1. Verwenden Sie eine 3-Kanal zwei verdreht Elektrode (mit mindestens 20 mm Schnittlänge der registrierenden Elektrode und eine 10 cm lange Elektrode Erdung) und an einem Leitfaden Kanüle, bereiten Sie das Gerät koppeln. Siehe Beispiele für 3-Kanal-Elektrode und Guide Kanüle für die Dialyse in Abbildung 1A-1 b.
  2. Entfernen Sie (Abbildung 1) und (Abbildung 1) die Metallführung Kanüle in den dummy Kunststoff Kanüle ein paar Mal vor der Verwendung um ihre Entfernung zu erleichtern im Moment seine Schalter für Mikrodialyse Sonde in Tier.
  3. Biegen Sie die verdrillten Leitungen Elektrode zweimal zu registrieren (Abb. 1E-1F) um die Drähte mit der Dummy-Kanüle des Leitfadens richten und schneiden Sie die Elektrodenspitze (Abbildung 1) zu 0,5 mm länger als die Spitze der Führer Kanüle (Abbildung 1 H) mit der digitalen Bremssattel.
  4. 1 mm lange Silizium reif bereit (Außendurchmesser 2 mm, Stärke 0,3 mm; Abbildung 1I) und stecken Sie die Spitze der Kanüle Führer und die Spitze der verdrehten Elektroden in der Silizium-reif mit der Pinzette (Abbildung 1J). Befestigen Sie es auf den Fuß des Leitfadens Kanüle Sockel mit Polymer Kleber rasches Handeln oder Harz (Abbildung 1 K). Siehe das Beispiel der fertige Geräte in Abbildung 1 L und Figur 2A.
  5. Sterilisieren Sie das Gerät unter keimtötende UV-Licht, für 4 Std. umdrehen das Gerät vier Mal, so dass jeder seiner Seiten für 1 Stunde das Licht ausgesetzt ist.
    Hinweis: Viele hausgemachte Elektroden und Mikrodialyse Sonden können in ähnlicher Weise montiert werden. Der Leiter der oben beschriebenen Implantat für Ratten hat folgenden Abmessungen: 7 mm Breite X Tiefe 5 mm x 10 mm Länge von der Spitze bis Zeh; Sockel die Implantat-Spitze ist ca. 11 mm lang, 600 µm im Durchmesser und das Gerät wiegt ca. 330-360 mg. Das Gerät kann zwei oder drei Mal wiederverwendet werden, wenn (i) eine ausreichende Länge der Masseelektrode auf den Schädel während der Operation für den nächsten Einsatz und bleibt (Ii) wenn das Tier getötet, und das Gerät zusammen mit der dental Zement verließ er in Aceton ist erholt overnigh t, solche, die der Zement kann mechanisch aufgeschlüsselt, und das Gerät gewaschen und erneut sterilisiert.

(2) stereotaktischen Chirurgie

  1. Verwenden einer stereotaktischen Gerät und Sonde Clip-Halters (Abb. 2 b) für das Gerät-Implantation nach den heutigen Standards für aseptische und schmerzfreie Operationen39,40,41.
    1. Die Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten mit Ketamin/Xylazin-Mischung (43 mg/kg und 7 mg/kg, i.p.) zu betäuben und auf der stereotaktischen Rahmen befestigen. Anfängliche Ketamin/Xylazin-Injektion fügen Sie Isofluran-Narkose (1,4 % in Luft; 1,2 mL/min hinzu) da es erlaubt, um die Tiefe der Narkose rechtzeitig zu kontrollieren. Das Fell am Kopf des Tieres zu rasieren.
  2. Tupfer der Kopfhaut Oberfläche durch Jod-basierte Lösung gefolgt von 70 % igem Ethanol für aseptische Chirurgie39vorzubereiten.
    1. Implantat die Führungseinrichtung Kanüle-Elektrode vorbereitet in der Rangfolge (1,1 – 1,5) in der rechten ventralen Hippocampus unter Verwendung der folgenden Koordinaten: Nase Bar + 5,0 mm, A – 3,4 mm, L + 4,5 mm, P + 6,5 mm Bregma1,2. Folgen Sie Standardtechniken für stereotaktischen Operationen10,11,12.
    2. Stellen Sie sicher, dass es nicht die Verankerung Schrauben abdeckt. Bei der Montage auf der stereotaktischen Apparat, begreifen Sie das Gerät für den Führer Kanüle Kopf wie dies leicht an Sondenhalter ausgerichtet werden kann.
  3. Verankern Sie das Gerät an den Schädel mit mindestens vier Edelstahlschrauben Schrauben in den Schädelknochen (1 Schraube in der linken und 1 Schraube in den rechten Stirnbein Platten, 1 Schraube in das linke parietalen und 1 Schraube in den interparietal Knochenplatten). Geben Sie einen Tropfen Gewebekleber, jede Schraube, die Schädelknochen weiter zu beheben.
    1. Decken Sie die Hälfte der Gewinde mit Methacrylat-Zement. Fördern Sie die Bindung des Zements durch eine flache Rillen in den Knochen um die Einhaltung zu erhöhen.
  4. Sobald die Spitze des Gerätes in das Hirngewebe positioniert ist, drehen Sie den Draht von der Masseelektrode rund 3 Schrauben verankern. Decken Sie alle montierten Schrauben und das Gerät mit der dental Zement12,42,43.
  5. Überwachen Sie die Tiere während der Operation und für ca. 1 h danach bis aufrecht und bewegen des Käfigs. Halten Sie sie auf eine Erwärmung Pad, um Unterkühlung zu vermeiden. Lassen Sie die Ratten für mindestens 7 Tage nach der Implantation Gerät wiederherstellen.
  6. Beobachten Sie die Tiere mindestens einmal täglich für 3 Tage nach der Operation auf Anzeichen von Schmerzen oder Stress. Geben Sie den Tieren mit der antibiotische Creme (Gentamycin 0,1 %) nah an den eingeschnittenen zur Verhinderung der Infektion und ein Schmerzmittel (Tramadol 5 mg/kg, i.p.) für 3 Tage, die Schmerzen nach der Operation zu verhindern.

3. Temporallappen-Epilepsie-Induktion durch Pilocarpin und Zuordnung von Tieren zur experimentellen Gruppen

  1. Nach einer Woche der postoperativen Erholung der Tiere nach dem Zufallsprinzip Gruppen zuweisen: (i) Kontrolltieren empfangen von Fahrzeug und (Ii) epileptische Tiere, die Pilocarpin erhalten. Verwendung eine proportional höhere Anzahl von Tieren für epileptische Gruppe, da nicht alle die Pilocarpin Ratten verabreicht wird die Krankheit zu entwickeln.
  2. Eine Dosis von Methylscopolamine (1 mg/kg, s.c.) und 30 min nach einer einzelnen Injektion von Pilocarpin (350 mg/kg, i.p.) induzieren Status Epilepticus (SE) zu injizieren. Methylscopolamine und das Fahrzeug (Kochsalzlösung) die Kontrolle Ratten zu injizieren. Verwenden Sie 1 mL Spritze mit 25G Nadel für alle Verwaltungen i.p.
    1. Prüfen Sie die Tiere zu starten, um Verhaltensstörungen Anfälle (bewegte Vibrissa innerhalb von 5 min, nickte mit Kopf, Klonen die Gliedmaßen) und innerhalb von 25 min., kontinuierlich alle Körper (SE) zu klonen.
  3. Die SE-2 h nach dem Einsetzen einer Mortalität etwa 25 % und eine durchschnittliche Latenzzeit von etwa 10 Tagen durch die Gabe von Diazepam (20 mg/kg, i.p.) haben zu verhaften. Beobachten Sie und zeichnen Sie einer Beschlagnahme Verhalten Beginn unmittelbar nach der Injektion Pilocarpin auf und für mindestens 6 h danach.
  4. Geben die Tiere Kochsalzlösung (1 mL, i.p.) mit 25G Nadel und Saccharose-Lösung (1 mL, p.o.) 1 mL Spritze mit 1 mL Spritze und flexible Fütterung 17G-Nadel für ca. 2-3 Tage nach SE zur Förderung der Erholung von Körper-Gewicht-Verlust.
    1. Schließen Sie die Tiere, die nicht den ursprünglichen Körpergewichts innerhalb der ersten Woche nach Pilocarpin SE aus der Studie (mit Ausnahme der akuten Gruppe getötet 24 h nach SE erreicht, wo die Körper Gewicht Follow-up nicht möglich ist).
  5. Weisen Sie Post-SE Tiere zufällig auf verschiedene Versuchsgruppen (Abbildung 3): akute phase (wo die Mikrodialyse 24 h nach SE stattfindet), Latenz (7-9 Tage nach SE), ersten spontanen Anfall (ca. 11 Tage nach SE) und chronische Periode ( ca. 22-24 Tage nach SE, d. h. etwa 10 Tage nach dem ersten Anfall beginnt). Beobachten Sie die Tiere für das Auftreten von spontanen Anfällen.
    Hinweis: Verwenden Sie die folgenden Inklusion/Exklusion-Kriterien für weitere Experimente an epileptischen Ratten: Entwicklung der konvulsiven SE innerhalb 1 h nach Pilocarpin Verwaltung; Gewichtszunahme in der ersten Woche nach der SE und die richtige Positionierung der Sonde Mikrodialyse und Elektrode.

(4) epileptische Verhaltensüberwachung und Analyse

  1. Langzeit-monitoring von epileptischen Verhalten
    1. Ca. 6 h nach Pilocarpin Verabreichung (d. h.am Ende der direkten Beobachtung von den Forschern), setzen Sie die Tiere in die Käfige sauber nach Hause und starten Sie die 24 h video-Überwachung.
    2. Weiterhin die 24 h Video-Überwachung bis zum 5. Tag, verwenden eine digitale video-Überwachungssystem.
    3. Ab 5. Tag, verbinden Sie die Ratten in ihren Hause rechteckige Käfigen zum tethered EEG-Aufnahme-System und fortfahren Sie, 24 h video-Überwachung.
    4. Satz der Parameter des Verstärkers außerhalb der Faraday-Käfig (eingestellte Verstärkungsfaktor für jeden Kanal je nach der Besonderheit des EEG Signals jedes einzelnen Tieres) und dem Start des EEG Erwerb beobachten das EEG-Signal von unverbundenen produziert Kabel. Verwendung die Probenahme bewerten 200 Hz und low pass Filter-Set bis 0,5 Hz.
    5. Verbinden Sie das Tier mit Kabel eines Tieres Kopf zwischen zwei gestreckten Fingern einer Hand halten und die Anschlüsse an die Elektrode Sockel mit der anderen freien Hand festschrauben. Start der Akquisition.
      Vorsicht: Stellen Sie sicher, dass das Signal frei von Artefakten. Gemeinsame Artefakte sind die Spikes erheblich mehr als die Waage.
    6. Übertragen Sie einen Tag bevor der Mikrodialyse experimentieren, die Tiere in das gefesselte EEG-System mit Plexiglas-Zylinder für die Mikrodialyse ausgestattet. Trennen Sie die Tiere aus dem EEG Anbindehaltung System in home Käfig kniff die Anschlüsse von der Elektrode ohne Restrain das Tier. Legen Sie das Tier in die hohe Plexiglas-Zylinder.
  2. Überwachung der epileptischen Verhalten am Tag vor und während der Mikrodialyse-Sitzung
    1. Schalten Sie den Verstärker außerhalb der Faraday-Käfig. Öffnen Sie die EEG-Software. Start der EEG Erwerb beobachten das EEG-Signal von unverbundenen Kabel hergestellt.
    2. Verbinden Sie das Tier mit der gefesselte EEG-Recording-System eines Tieres Kopf zwischen zwei gestreckten Fingern einer Hand halten und die Anschlüsse an die Elektrode Sockel mit der anderen freien Hand festschrauben. Richten Sie einen Verstärkungsfaktor (Gain) auf jedem Kanal des Verstärkers entsprechend Elektrode Signal des einzelnen Tieres, damit das EEG-Signal im Maßstab ist. Lassen Sie das Tier entdecken Sie den neuen Käfig (Zylinder) für mindestens 1 h unter direkter Beobachtung des Forschers.
    3. Hinweis: 24 h vor der Mikrodialyse experimentieren, die Ratten werden mit Isofluran für den Schalter Anleitung Kanülen, Mikrodialyse Sonde kurz betäubt. Nutzen Sie den Moment, wenn sie betäubt sind, um sie mit der EEG-Aufnahme-System verbinden.
    4. Kürzen Sie oder verlängern Sie hängenden Kabel entsprechend des Tieres Ware. Stellen Sie sicher, dass die Kabel nicht mit Bewegungen und liegende Haltung des Tieres nicht stören.
    5. Suchen Sie das richtige Bild Framing der Videokameras. Starten Sie die Video-EEG-Aufzeichnung.
  3. Identifikation der Anfälle und EEG-Aktivität
    1. Verwenden Sie einen Software-Player um die Videos anzuschauen. Blättern Sie den Film 8 Mal schneller als das Real-Time spielen und individualisieren Sie die generalisierte Anfälle (siehe Tier nach hinten mit Vordergliedmaße Klonus oder Tier Aufzucht und fallen mit Vordergliedmaße Klonus). Das Video verlangsamen Sie und beachten Sie die genaue Uhrzeit des Beginns und des Endes der behavioral Beschlagnahme.
    2. Prozess die Daten durch zählen der Anzahl von generalisierten Anfällen beobachtet in 24 h von Videoaufzeichnungen und in Bezug auf die Beschlagnahme Häufigkeit und Dauer wie alle Anfälle beobachtet im 24 h-Wert bedeutet auszudrücken.
    3. Definieren Sie die EEG-Anfälle als Perioden von paroxysmale Aktivität von hoher Frequenz (> 5 Hz) zeichnet sich durch eine > 3-fold Amplitude Inkrement über Baseline mit Fortschreiten der Spike-Frequenz, die für ein Minimum von 3 s2,44 dauert oder ähnliche28. Verwenden Sie EEG-Software, um die rohen-EEG-Ableitungen zu verarbeiten. Die EEG-Spuren in 1 h Fraktionen aufgeteilt. Kopieren Sie die EEG Ablaufverfolgung Brüche für automatische Spike Softwareanalyse einzureichen.
    4. Analysieren Sie die EEG-Aktivität-Daten EEG-Software mit vordefinierten Parametern (4.3.3.). Analysen Sie alle video in zwei unabhängige Ermittler, die für die Gruppe der untersuchten Tiere blind sind. Im Falle von Abweichungen machen sie die Daten zusammen, um einen Konsens45erreichen erneut zu prüfen.

5. Mikrodialyse

  1. In-vitro- Sonde Erholung
    1. Bereiten Sie die Sonde für den ersten Einsatz nach den Anweisungen des Herstellers, in seiner Schutzhülle Handhabung.
    2. Führen Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung: bereiten Sie drei 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL Ringer Lösung mit der Mischung aus Standards (2,5 µM von Glutamat) und 2,5 µM Aspartate laden. Eingestellten Block Heizung auf 37 ° C drei geladenen 1,5 mL Reagenzgläsern hineingesteckt und positionieren Sie es an die Rührer.
      Hinweis: Verwenden Sie die gleichen standard-Lösungen für die Chromatographie Kalibrierungen.
    3. 1,5 mL Teströhrchen mit Paraffin Film zu versiegeln und durch scharfe Pinzette ein Loch von ca. 1 mm im Durchmesser zu durchstechen.
    4. Nehmen Sie die Sonde und stecke sie in das Loch in Paraffin-Film gemacht. Tauchen Sie die Membran mindestens 2 mm unter der Projektmappenebene. Befestigen Sie die Sonde in 1,5 mL Teströhrchen durch Paraffin Film weiter.
      Vorsicht: Stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht die Wände des Reagenzglases 1,5 mL berühren.
    5. Verbinden Sie die Sonde Einlass an der Spritze auf die Infusionspumpe mit FEP-Schläuche und Schlauch-Adapter montiert. Optional Bohrung Verwendung feiner Polyäthylen Schläuche von 0,28 mm ID und 0,61 mm OD und farbige Schläuche Adaptern (rote und blaue Schlauch-Adapter) für Verbindungen.
    6. Starten Sie die Pumpe mit 2 µL/min und lassen Sie die Flüssigkeit an der Steckdose der Spitze erscheinen. Schließen Sie die Sonde Steckdose an die 0,2 mL sammeln Reagenzglas mit FEP-Schläuche und Schlauch-Adapter an.
      Hinweis: Verwenden Sie FEP-Schläuche für alle Anschlüsse. Schneiden Sie die gewünschte Länge der Schläuche mit einer Rasierklinge. Verwenden Sie Schlauch-Adapter in verschiedenen Farben für Einlass und Auslass der Sonde. Lassen Sie die Pumpe laufen für 60 min. Prüfung auf Dichtheit und Luftblasen zu entfernen. Diese sollten nicht vorhanden sein.
    7. Legen Sie die Pumpe auf der Flow Rate 2 µL/min und beginnen Sie die Proben auf der Auslassseite des Schlauches zu sammeln.
    8. Sammeln Sie drei 30 min Perfusat und drei gleicher Lautstärke Proben im Reagenzglas 1,5 mL der Lösung. Nehmen Sie die gleichen Volumen Proben von 1,5 mL Reagenzglas alle 30 min. mit der Microsyringe in die Standardlösung im 1,5 mL Reagenzglas eingetaucht.
    9. Wiederhole das Experiment (5.1.1-5.1.8) die Pumpe Flow Rate 3 µL/min (5.1.7) einrichten, um eine Sonde Erholung Vergleich zu haben, bei der Verwendung von zwei verschiedenen Perfusion Durchflussmengen.
    10. Wenn Sie fertig sind, stoppen Sie die Pumpe und spülen Sie den Schlauch mit destilliertem Wasser, 70 % igem Ethanol und drücken Sie die Luft hinein. Speichern Sie die Sonde in ein Fläschchen mit destilliertem Wasser gefüllt. Spülen Sie die Sonde durch Vorrichtung es mit 2 µL/min durch destilliertes Wasser vor der Lagers gründlich aus.
    11. Analysieren Sie die Konzentration von Glutamat und Aspartat-in den Proben durch Chromatographie (finden Sie die Details unten; 6,3).
    12. Berechnen Sie die Wiederherstellung unter Verwendung der folgenden Gleichung:
      Verwertung (%) = (C Perfusat/cdialysed Lösung) X 100.
  2. Mikrodialyse Sitzungen im frei beweglichen Ratten
    1. Präparativen Verfahren: Sonde einführen und testen, Infusion pump Einstellung und starten
      1. Bereiten Sie die Mikrodialyse Sonden für den ersten Gebrauch laut Hersteller Benutzerhandbuch und füllen sie mit Ringer Lösung. Schneiden Sie ca. 10 cm lange Stücke von FEP-Schläuche und verbinden Sie sie mit Einlass und Auslass Kanülen der Sonde über die Schlauch-Adapter in verschiedenen Farben.
      2. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch die Adapter mit kein Totraum in alle Anschlüsse berührt.
      3. 5.2.1.3. 24 h vor dem Mikrodialyse-Experiment, betäuben kurz das Tier mit Isofluran (5 % in Luft) in einer Induktion Kammer bis Liegerad. Entfernen Sie die Dummy-Kanüle aus seiner Führung mit der Pinzette und hält den Kopf des Tieres fest. Führen Sie die Mikrodialyse-Sonde, ausgestattet mit einer dialyzing Membran in der Führer-Kanüle und Firma weiter die Mikrodialyse Kanülen von Knetmasse in ihrem Guide eingefügt.
        Vorsicht: Lassen Sie sich nicht die Sonde, die die Wände der schützenden Sonde Hülse berühren beim extrahieren.
      4. Das Tier in den Plexiglas-Zylinder und lassen Sie das neue Ambiente zu erkunden. Das Tier mit dem tethered EEG Aufnahmesystem verbinden, wie oben beschrieben (folgen Sie die Punkten 4.2.2 und 4.2.3).
      5. Folgen Sie der wach und beweglichen Sie frei Ratte Bewegungen und verbinden Sie den Einlass der Sonde mit 2,5 mL Spritze mit abgestumpften 22G Nadel mit Ringer Lösung über die Schlauch-Adapter. Drücken Sie Ringer Lösung innerhalb der Sonde Auswerfen 1 mL Ringer Lösung in 10 s drücken kontinuierlich den Kolben der Spritze 2,5 mL. Suchen Sie nach den Tropfen der Flüssigkeit am Ausgang erscheinen. Die Sonde ist nun einsatzbereit.
      6. Füllen Sie die 2,5 mL Spritzen mit FEP-Schläuche durch Schlauch Adapter mit Ringer Lösung verbunden und klebe sie auf die Infusionspumpe. Starten Sie die Pumpe mit 2 µL/min. Über Nacht laufen lassen.
        Hinweis: Verwenden Sie die gewünschte Länge der alle FEP-Schläuche aber berechnen Sie Schläuche Totvolumen zu wissen, wann die hohe K+ -Stimulation gestartet werden soll und die Quantifizierung Daten korrelieren mit neurochemischen Veränderungen im tierischen Gehirn zu. Verwenden Sie die Luftblase in der Verrohrung unter den Arbeitsfluss erstellt, um diesmal zu berechnen.
    2. Entnahme von Proben während der EEG-Aufzeichnung und Kalium-stimulation
      1. Überprüfen Sie das Fehlen von Anfällen in der 3 h vor Beginn der Probenentnahme (Video-EEG-Ableitungen) und weiterhin Anfallsaktivität während Mikrodialyse überwachen.
      2. Stoppen Sie die Pumpe tragen die FEP-Schläuche kanülierte Spritzen mit Ringer Lösung gefüllt. Berg auf die Pumpe, die einen anderen von 2,5 mL Spritzen Satz verbunden, FEP-Schläuche mit Schlauch Adapter füllte sich mit einer modifizierten Ringer-Lösung mit 100 mM K+ -Lösung.
      3. Starten Sie die Pumpe mit 2 µL/min und ließ es laufen. Setzen Sie für eine schnellere Füllung der Schläuche die Pumpe mit 5 µL/min für die Zeit der Füllung. Für die Abwesenheit von Luftblasen im System überprüfen. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch die Adapter mit kein Totraum in alle Anschlüsse berührt.
      4. Testen Sie die Sonde wenn bereit für den Einsatz in Tier wie oben (5.2.1.5) beschrieben.
        Hinweis: Wenn die Sonde aus irgendeinem Grund nicht funktioniert, ändern Sie ihn. In diesen Fällen halten Sie ein paar vorbereitete Mikrodialyse Sonden bereit, in der Nähe der Mikrodialyse-EEG-Arbeitsstation verwenden. Trennen Sie das Tier vom EEG Kabel und betäuben Sie es kurz mit Isofluran, falls erforderlich, um die Änderung zu realisieren.
      5. Verbinden Sie die FEP-Schläuche Spritzen gefüllt mit Ringer Lösung für die Einlass-Kanüle der Sonde in jedem Tier und warten auf das Erscheinungsbild des Flüssigkeitstropfens an der Spitze der Steckdose.
      6. Schließen Sie die Steckdose der Sonde an FEP-Schläuche, die Sammlung im Reagenzglas führt. Die FEP-Schläuche in geschlossenen 0,2 mL Reagenzglas mit einer perforierten Kappe einsetzen. Stellen Sie sicher, dass das Rohr an der Stelle bleibt, durch die Fixierung mit einem Stück Modelliermasse.
      7. Die Pumpe mit 2 µL/min 60 min zu laufen, ohne Proben um das System (null Probe) equilibrate weiter.
      8. Sammeln Sie 5 aufeinander folgenden 30 min Dialysat Proben (60 µL jeweiligen Volumen) Grundlinie Bedingungen (Perfusion mit normalen Ringer-Lösung). Speichern Sie die Proben auf Eis.
      9. Berechnen Sie die Zeit dauert es flüssiger von der Pumpe in den Kopf des Tieres gelangen (es hängt Totvolumen der Schläuche, d. h., Blase Sendezeit) und wechseln Sie die FEP-Schläuche, die von der Spritzen mit normalen Ringer-Lösung zu spritzen mit geht geändert (100 mM K+) Ringer-Lösung zu diesem Zeitpunkt ohne die Pumpe zu stoppen. Für das Fehlen der Luftblasen im System überprüfen. Lassen Sie die Pumpe für 10 min laufen.
        Vorsicht: In 10 min der hohen K+ -Stimulation, die Tiere bewegen sich frenetisch und präsentieren in der Regel eine große Anzahl von nassem Hund schüttelt tendenziell (Kontrolle und aus der Beschlagnahme Cluster Tiere) oder Verhaltensstörungen Krampfanfälle (epileptische Tiere), also bereit sein, zu intervenieren schützen Sie die Schläuche und Kabel gegen Verdrehen.
      10. Nach 10 Minuten wechseln Sie die Schläuche von den Spritzen mit 100 mM K+ Ringer-Lösung für normale Ringer-Lösung und lassen Sie die Pumpe laufen. Schalten Sie nicht die Pumpe während der Lösung Änderungen damit, dass es ein Tropfen der Flüssigkeit am Ende des Schlauches in Linie verbunden werden können.
      11. Von dem Moment, an dem das Dialysat hohe Kalium, d.h.nach der Entnahme der fünfte nach Gleichgewichtherstellung Dialysat enthält, sammeln die Dialysat Fraktionen alle 10 Minuten (20 µL) für 1 h sammeln 3 zusätzliche 30 min Dialysat Proben und stoppen den Pumpe. Speichern Sie die Proben auf Eis.
      12. Speichern Sie die Proben bei-80 ° C nach dem Experiment bis zur HPLC-Analyse.
      13. Wiederholen Sie die Mikrodialyse experimentieren für 3 aufeinanderfolgende Tage, mit Ausnahme der akuten (24 h) und Beschlagnahme Spitzengruppe, in der nur eine Mikrodialyse Sitzung 24 h nach SE oder innerhalb von 24 h nach der ersten spontanen Anfall (Abbildung 3) stattfindet.
      14. Nach Abschluss jedes Experiment einschläfern Sie des Tieres mit einer betäubenden Überdosis und entfernen Sie das Gehirn für die Überprüfung der Sonde und der Elektrode zu.
  3. Post-Mikrodialyse Verfahren
    1. Die verwendeten Mikrodialyse Sonden mit destilliertem Wasser abspülen und in ein Fläschchen gefüllt mit destilliertem Wasser bis zur nächsten Verwendung aufbewahren.
      Hinweis: Die wiederverwendeten Membranen können Durchlässigkeit erhöht haben; Überprüfen Sie die Sonde Erholung vor der wiederholten Verwendung.
    2. Spülen Sie die gesamte Mikrodialyse mit destilliertem Wasser, gefolgt von 70 % igem Ethanol (Schläuche, Anschlüsse und Spritzen) eingerichtet. Ersetzen von Ethanol mit Luft und das Set in einer sterilen Umgebung ansammeln.
    3. Die basalen Dialysat Proben in 20 µL Fraktionen aufgeteilt und verwenden Sie nur ein 20 µL Bruchteil für basale Konzentration Aminosäureanalyse. Speichern Sie die restlichen Probenmenge für weitere oder bestätigende Analyse bei-80 ° C.
    4. Die Köpfe in 10 % Formalin zu beheben und bewahren von Paraffin einbetten1. Koronal Abschnitt die Gehirne in Scheiben schneiden und färben sie mit Hämatoxylin und Eosin. Untersuchen Sie die Gehirne für richtige Sonde und Elektrode Platzierung1,2.
      Hinweis: Die Köpfe in gekühlten 2-Methylbutane zu beheben und bei-80 ° c aufbewahren Verwenden Sie anderen bewährten Färbung auf das Nervengewebe Abschnitte, die erlaubt, um die Sonde und Elektrode-Darm-Trakt zu visualisieren.

(6) chromatographische Analyse von Glutamat und Aspartat-

  1. Vorbereitung der derivatizing agent
    1. Mischen Sie die jeweiligen Bänden 20:1 (V/V) Orthophthaldialdehyde Reagenz (OPA) und 2-Mercaptoethanol (5-ME) in der Flasche. Schließen Sie das Fläschchen mit der Kappe und Luft dicht Septum.
      Vorsicht: Arbeiten Sie unter der chemischen Haube.
    2. Wirbel die fertige Lösung und steckte es in den Autosampler in die Position für derivatizing Agent.
  2. Vorbereitung von Dialysat Proben
    1. Genommen Sie Glaseinsatz mit unteren Feder in 2 mL braune Autosampler Fläschchen. Bereiten Sie die Fläschchen für alle Proben in einem Stapel gemessen.
    2. -80 ° C Gefrierschrank 20 µL Dialyse Proben entnehmen und schmelzen lassen. 1 µL der Lösung zu entfernen und fügen Sie 1 µL des internen Standards (IS) L-Homoserine (50 µM), 19 µL der Probe, damit die Probe enthält 2,5 µM von IS. Pipette 20 µL der Probe Dialyse in den Glaseinsatz in Fläschchen und versiegeln Sie es mit einer luftdichten Septum.
    3. Legen Sie die Fläschchen mit der Proben in den Autosampler mit der Chromatographie-Software, um die Proben in ihrer Position zu kennzeichnen.
  3. Chromatographische Analyse von Proben, Glutamat und Aspartat-Konzentration bestimmen
    1. Führen Sie die Analysen auf dem liquid Chromatograph System mit Spectrofluorometric Erkennung. Die Aminosäuren zu erkennen, nachdem 20 μl der Probe 2 min vor Spalte Derivatisierung mit 20 μl des Orthophthaldialdehyde/5-Mercaptoethanol 20:1 (V/V) hinzugefügt.
    2. Bereiten Sie das System für die Analyse von Aminosäuren. Schalten Sie den Autosampler, die Pumpe, die Degasser, Detektor und steuernde Einheit zusammen mit Computer.
    3. Tauchen Sie ein die Siphons in die Flaschen mit der mobilen Phase und Säuberung der Kanäle der chromatographischen Pumpe für die Analyse verwendet werden.
    4. Beginnen, den Fluss der mobilen Phase überprüfen den Druck auf die Spalte zu erhöhen (z. B.0,2 mL/min ab und erhöhen den Fluss für weitere 0,2 mL/min alle 5 min bis zum Erreichen der Arbeitsfluss). Lassen Sie das System laufen arbeiten fließen 0,8 mL/min für mindestens 1 h nach der Spalte equilibrate.
      Vorsicht: Instabile Druck zeigt das Vorhandensein der Luft im System. Der Druck sollte 25 MPa nicht überschreiten.
    5. Legen Sie die Verstärkung, hohe Empfindlichkeit und die Anregung und Emission Wellenlängen auf den Detektor, 345/455 nm bzw.. Das Detektorsignal (AUTOZERO) zurückgesetzt.
    6. Senden Sie die Chromatographie-Software verwenden, die Methode an das Instrument. Nun sollte der Chromatograph messbereit.
    7. Die Dialysat Proben zu trennen, Standard versetzt Dialysat Proben sowie Standards (0,25 µM – 2,5 µM Aspartat- und Glutamat in Ringer Lösung) auf die entsprechende chromatographische Spalte. Die chromatographische Methode zu kalibrieren und die Erkennung und Quantifizierung Grenzen vor einer Dialyse-Proben-Analyse zu etablieren.
    8. Aktivieren Sie die einzelnen Analyse oder die Reihenfolge der Proben analysiert werden mit Hilfe der Chromatographie-Software erstellen und Ausführen der Sequenzablaufs.
      Vorsicht: Führen Sie mehrere leere Probe und verschiedenen standard Proben innerhalb der Sequenz von Dialysat Proben um die Methode Genauigkeit zu kontrollieren.
    9. Sobald die Chromatogramme erworben sind, analysieren sie mit Chromatographie-Software. Überprüfen Sie die Integration der Gipfel des Interesses in der Kalibrierung Plot. Verwenden Sie Höhe oder Peak Peakfläche zur Quantifizierung.
    10. Sobald die Aufnahme beendet ist füllen Sie die Spalte und das System mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. 50 % Acetonitril in Reinstwasser) um zu verhindern, dass seine Alterung und Schimmel Wachstum drin.
    11. Herunterfahren des Systems.

Ergebnisse

Sonde Erholung

Die mittlere Erholung (d. h. die mittlere Aminosäuregehalt im Perfusat als Prozentsatz des Inhalts in ein gleiches Volumen der Durchstechflasche Lösung) war 15,49 ± 0,42 % bei einer Durchflussmenge von 2 μl/min und 6,32 ± 0,64 bei 3 μl/min für Glutamat und 14.89 ± 0,36 % bei einer Durchflussmenge von 2 Μl/min und 10,13 ± 0,51 bei 3 μl/min für Aspartate bei Verwendung der Cuprophane-Membran-Sonde...

Diskussion

In dieser Arbeit zeigen wir, wie eine kontinuierliche Video-EEG-Aufzeichnung gepaart mit Mikrodialyse in einem experimentellen Modell der TLE durchgeführt werden kann. Video-EEG-Aufzeichnung Techniken werden verwendet, um die verschiedenen Phasen der Fortschreiten der Krankheit bei Tieren korrekt zu diagnostizieren und die Mikrodialyse-Technik wird verwendet, um die Änderungen in Release Glutamat zu beschreiben, die rechtzeitig auftreten (keine Änderungen für wurden gefunden Aspartate in einer zuvor veröffentlichten...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten Anna Binaschi, Paolo Roncon und Eleonora Palma für ihren Beitrag zur Manuskripte veröffentlicht in der Rangfolge bedanken.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
3-channel two-twisted electrodeInvivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USAMS333/3-B/SPCMaterial
guide cannulaAgn Tho's, Lindigö, SwedenMAB 4.15.ICMaterial
Resin KK2 PlastikElettra Sport, Lecco, ItalyKK2Material
Super Attack gel LoctiteHenkel Italia Srl, Milano, Italy2047420_71941Material
Imalgene-KetamineMerial, Toulouse, France221300288 (AIC)Solution
XylazineSigma, Milano, ItalyX1251Material
Isoflurane-VetMerial, Toulouse, France103120022 (AIC)Solution
Altadol 50 mg/ ml - tramadolFormevet, Milano, Italy103703017 (AIC)Solution
Gentalyn 0.1% crm - gentamycineMSD Italia, Roma, Italy20891077 (AIC)Material
simplex rapid dental cementKemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United KingdomACR811Material
GlasIonomer CX-Plus CementShofu, Kyoto, JapanPN1167Material
probe clip holderAgn Tho's, Lindigö, Swedenp/n 100 5001Equipment
Histoacryl® Blue Topical Skin AdhesiveTissueSeal, Ann Arbor, Michigan, USATS1050044FPMaterial
Valium 10 mg/2 ml - diazepamRoche, Monza, Italy019995063 (AIC)Material
1 mL syringe with 25G needleVetrotecnica, Padova, Italy11.3500.05Material
rat flexible feeding needle 17GAgn Tho's, Lindigö Sweden7206Material
Grass Technology apparatusGrass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USAM665G08Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
modular data acquisition and analysis system MP150Biopac, Goleta, California, USAMP150WSWEquipment
digital video surveillance systemAverMedia Technologies, Fremont, California, USAV4.7.0041FDEquipment
microdialysis probeAgn Tho's, Lindigö SwedenMAB 4.15.1.CuMaterial
microdialysis probeSynaptech, Colorado Springs, Colorado, USAS-8010Material
block heaterGrant Instruments, Cambridge, EnglandQBD2Equipment
stirrerCecchinato A, Aparecchi Scientifici, Mestre, Italy711Equipment
infusion pumpUniventor, Zejtun, Malta864Equipment
fine bore polythene tubingSmiths Medical International Ltd., Keene, New Hampshire, USA800/100/100/100Material
blue tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1002Material
red tubing adaptersAgn Tho's, Lindigö Sweden1003Material
2.5 mL syringe with 22G needleChemil, Padova, ItalyS02G22Material
vial capCronus, Labicom, Olomouc, Czech RepublicVCA-1004TB-100Material
septumThermo Scientific, Rockwoood, Tennessee, USANational C4013-60 8 mm TEF/SIL septumMaterial
glass insert with bottom springSupelco, Sigma, Milano, Italy27400-UMaterial
autosampler vialNational Scientific, Thermo Fisher Scientific, Monza, ItalyC4013-2Material
Smartline manager 5000 system controller and degasser unitKnauer, Berlin, GermanyV7602Equipment
Smartline 1000 quaternary gradient pumpKnauer, Berlin, GermanyV7603Equipment
spectrofluorometric detectorShimadzu, Kyoto, JapanRF-551Equipment
chromatogrphic columnKnauer, Berlin, Germany25EK181EBJMaterial
chromatogrphic pre-columnKnauer, Berlin, GermanyP5DK181EBJMaterial
mobile phase solution A0.1 M sodium phosphate buffer, pH 6.0Solution
mobile phase solution B40% 0.1 M sodium phosphate buffer, 30% methanol, 30% acetonitrile, pH 6.5Solution
Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 2.7, NaCl 148, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
modified Ringer solutioncomposition in mM: MgCl2 0.85, KCl 100, NaCl 50.7, CaCl2 1.2, 0.3% BSASolution
saline0.9% NaCl, ph adjusted to 7.0Solution
sucrose solution10% sucrose in distilled waterSolution

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