Fluorimétrica de técnicas para la evaluación de las membranas del esperma

Resumen

Aquí, presentamos a metodologías para evaluar la integridad de la membrana de spermatozoan, una característica celular asociada con la capacidad de fertilización del esperma. Se describen tres técnicas para la evaluación de fluorimétrico de las membranas del esperma: coloración simultánea con sondas fluorescentes específicas, microscopía de fluorescencia y citometría de flujo avanzada dedicado de esperma. También se presentan ejemplos de la combinación de las metodologías.

Resumen

Espermogramas estándar que describe la calidad del esperma se basan principalmente en los parámetros fisiológicos y visuales, como el volumen de eyaculado y concentración, motilidad y motilidad progresiva, morfología espermática y viabilidad. Sin embargo, ninguna de estas evaluaciones es suficiente predecir la calidad del semen. Dado que el mantenimiento de viabilidad espermática y la fertilización potencial depende de la integridad de la membrana y función intracelular, evaluación de estos parámetros puede permitir una mejor predicción de la capacidad de fertilización del esperma. Aquí, Describimos tres métodos posibles para evaluar la calidad del esperma mediante sondas fluorescentes específicas combinadas con análisis de citometría de flujo o microscopia de fluorescencia. Análisis evaluaron la integridad de la membrana plasmática con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y yoduro de propidio (PI), integridad de la membrana acrosómica usando conjugados con isotiocianato de fluoresceína aglutinina de Pisum sativum (PSA-FITC) y integridad de la membrana mitocondrial con 5, 5', 6, 6'-tetra-cloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine yoduro (JC-1). También se presentan combinaciones de estos métodos. Por ejemplo, el uso de anexina V combinado con PI fluorocromos permite evaluar apoptosis calcular la proporción de espermatozoides apoptóticos (índice de apoptosis). Creemos que estas metodologías, que se basan en el examen de las membranas del espermatozoide, son muy útiles para la evaluación de la calidad del esperma.

Introducción

Integridad y funcionalidad de las membranas del esperma son algunos de los factores que indica viabilidad espermática y la fertilización posible. La membrana plasmática actúa como una barrera entre los compartimientos intracelulares y extracelulares, manteniendo así el equilibrio osmótico celular¹. Cualquier estrés que induce daño en la integridad de la membrana plasmática pueden la homeostasis, reducen la capacidad de viabilidad y fertilización e incrementar la muerte celular. Por ejemplo, criopreservación reduce la viabilidad espermática debido al daño a la membrana plasmática, como resultado de los cambios de temperatura y estrés osmótico². Hemos divulgado previamente que exponer los espermatozoides de Toro para bajas concentraciones de contaminantes de los alimentos tales como la plaguicidas atrazina, su metabolito principal diaminochlorotriazine o la aflatoxina de micotoxina B1, reduce el esperma viabilidad^1,3 . Esto fue determinado por el ADN de doble hebra con DAPI de etiquetado en combinación con PI, que se une al ADN de las células con una membrana de plasma dañada.

Reacción acrosómica (RA) consiste en la fusión de la membrana acrosómica externa y la membrana plasmática suprayacente resultando en la liberación de enzimas acrosómica^4,5. Estos son eventos esenciales para la penetración de la zona pelúcida y fusión del espermatozoide con el ovocito⁶más. Por lo tanto, la evaluación de la integridad de la membrana acrosómica constituye un parámetro útil para evaluar la calidad del semen y la fertilidad masculina^7,8,9. Varias técnicas fluorescentes son convenientes para la verificación de integridad del acrosoma, FITC-PNA o FITC-PSA^8,10. En nuestros estudios anteriores, utilizando los patrones de FITC-PSA tinción^1,3, proporciona las definiciones precisas para (i) acrosoma intacto, (ii) dañar la membrana del acrosoma y (iii) reacción acrosómica. En el informe actual, evaluar el estado del acrosoma mediante citometría de flujo de esperma dedicado y comparar los resultados a aquellos que utilizan la microscopía de fluorescencia.

Las mitocondrias son organelos multifuncionales involucrada en, entre otras cosas, ATP síntesis, producción de especies reactivas del oxígeno, señales de calcio y apoptosis. Disfunciones fisiológicas, incluyendo la infertilidad masculina y femenina, se asocian con alteración de la función mitocondrial¹¹. Las mitocondrias del espermatozoide se arreglan en la midpiece y desempeñan un papel crucial en el esperma motilidad¹². Es bien aceptado que el alto potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) se asocia con motilidad normal y fertilización alta capacidad¹³. En cambio, ΔΨm bajo se asocia con un nivel elevado de especies reactivas de oxígeno y reducción de la tasa de fertilización¹⁴. Sin embargo, varios compuestos ambientales, por ejemplo los disruptores endocrinos, pueden inducir estrés celular y conducir a un aumento transitorio en hiperpolarización^1,3, ΔΨm, aumento de la producción de radicales libres y eventualmente, ¹⁵de la apoptosis. La sonda fluorescente 5, 5', 6, 6'-tetra-cloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine yoduro (JC-1) permite examinar por ejemplo, los efectos de las toxinas transmitidas por los alimentos en esperma ΔΨm^1,3.

Espermogramas estándar, basadas en parámetros morfológicos y fisiológicos, no son lo suficientemente buenas como predecir la calidad del semen. Se requieren métodos más precisos para asegurar la calidad del esperma. Presentamos dos métodos posibles para determinar la calidad del esperma basada en evaluaciones de las membranas del esperma: coloración cuádruple simultánea con sondas fluorescentes específicas y microscopía de fluorescencia, descrito en nuestros estudios^1,3 y citometría de flujo de esperma dedicado avanzado recientemente en nuestro laboratorio y ya siendo utilizado por otros^16,17,18.

Protocolo

Todos los experimentos fueron realizados siguiendo las directrices israelíes de 1994 para el bienestar animal. Espermatozoides bovinos fue suministrado por empresa comercial israelí para la inseminación artificial y cría. Eyaculados de 11 toros fueron evaluados en este estudio.

1. preparación de muestras de esperma

Nota: El procedimiento se basa en protocolo^{1,3 del laboratorio Roth}.

1. Obtener aproximadamente de 1 a 6 mL de semen de toro en un tubo de 15 mL a temperatura ambiente.
2. Cada 1 ml de semen, añadir 6 mL de tampón NKM precalentado (a 37 ° C) (110 mM NaCl, KCl, de 5 mM 20 mM fregonas [ácido propanesulfonic 3-N-morphilino; pH 7.4]) y centrifugar para 8 min a 600 x g, 1 – 2 veces hasta que el sobrenadante esté claro.
   Nota: Si la concentración espermática o el volumen inicial es muy alto, dividida en dos tubos en el primer lavado.
3. Quitar inmediatamente y desechar el sobrenadante y dejar aproximadamente 1 cm del sobrenadante por encima de la pelotilla.
4. Lean cuidadosamente los tubos en un ángulo de 30 º para aumentar la superficie de los espermatozoides nadar hacia arriba y esperar 20-30 min para permitir que los espermatozoides a nadar hasta a 37 ° C.
   Nota: Se observa turbidez.
5. Con una micropipeta con cuidado, retire la parte superior 1 mL del sobrenadante que contiene los espermatozoides móviles a un nuevo tubo de 1,5 mL.
6. No el esperma a 37 ° C hasta su uso.
7. Estiman que el conteo de espermatozoides utilizando un hemocitómetro de Neubauer.
   Nota: Puede utilizar una cámara de conteo diferente, pero la cuenta es diferente.
   1. Para evitar el movimiento del espermatozoide, diluir 100 μl de los espermatozoides móviles con 10 mL de agua bidestilada (DDW) (dilución 1: 100) en un tubo de 15 mL y mezclar suavemente.
   2. Cargar 10 μl de la muestra en cada lado del hemocitómetro y el cubreobjetos. Asegúrese de evitar formación de burbujas dentro de la cámara como esto puede resultar en un conteo de esperma inexacta.
   3. Observar bajo un microscopio compuesto con el objetivo 20 X.
      Nota: La red completa en un hemocitómetro contiene 9 cuadrados grandes, cada 1 mm², y el cubreobjetos basa 0,1 mm por encima del piso de la cámara. Así, el volumen sobre el área central de la cuenta es de 0.1 mm³ o 0.1 μl. La zona central del hemocitómetro contiene 25 cuadrados medianos y cada cuadrado mediano tiene 16 plazas más pequeñas con líneas simples.
   4. Contar el número total de células que se encuentran en 4 cuadrados de la esquina del medio y la plaza central. Para mayor precisión, contar dos cámaras (ambos lados del hemocitómetro de Neubauer) y utilizar la media para calcular la concentración de células.
   5. Multiplicar al número obtenido por 5 (para obtener el número de células por conteo de área) y 10.000 (para obtener el número de células por 1 mL de la muestra diluida) para calcular el conteo de espermatozoides. Luego multiplique el recuento obtenido por el factor de dilución (1: 100).
      Nota: Por ejemplo, un número promedio de espermatozoides contados en 5 de las 25 plazas medio dentro de la zona central de la cuenta de dos compartimientos es de 150 ([152 + 148] / 2). Así, el número promedio de espermatozoides por cámara (o 0,1 μl) es 150 x 5 = 750. Multiplicar 750 por 10.000 para obtener el número de células por 1 mL de muestra diluida (7.500.000) y luego multiplicar por 100 (factor de dilución) para obtener 75 x 10⁷ células por mL de muestra de semen original.

2. técnica #1: Evaluación simultánea de las membranas de espermatozoides utilizando fluorescentes múltiples sondas

Nota: Membranas del esperma (plasma y acrosómica y mitocondrial) se evaluaron como se ha descrito por Celeghini et al¹⁰, con algunas modificaciones. Se utilizó la microscopía epifluorescente, combinado con una cámara digital con excitación a 450-490 nm y emisión a 515 565 nm con un filtro triple.

1. Preparar soluciones madre.
   1. Prepare a 0,1 mg/mL solución DAPI disolviendo 5 mg de DAPI en 50 mL de tampón fosfato salino (PBS). Preparar 50 alícuotas de μl y almacenar a-20 ° C. Antes del uso diluir la solución madre con PBS en 1:10 (solución de trabajo; 10 μg/mL).
   2. Prepare 1 mg/mL PSA-FITC solución disolviendo 1 mg de PSA-FITC en 1 mL de PBS. Preparar 50 alícuotas de μl y almacenar a-20 ° C. Antes del uso diluir la solución madre con PBS en 1:10 (solución de trabajo, 100 μg/mL).
   3. Preparar solución stock de 1 mg/mL 1 JC disolviendo 1 mg de JC-1 en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO). Preparar 10 alícuotas μl y almacenar a-20 ° C. Antes del uso diluir la solución con DMSO en 1:10 (solución de trabajo; 0,1 mg/mL).
   4. Disolver 10 mg de PI en 400 μL de PBS (dando 2,5 mg/mL) para preparar la solución madre de PI. Tienda a + 4 ° C. Diluir el caldo 1 con PBS a 1:20 (solución de trabajo; 0,125 mg/mL). Almacenar a 4 ° C como una solución de reserva.
      PRECAUCIÓN: PI es un mutágeno potencial y debe ser manejado con cuidado. El tinte debe eliminarse de forma segura y según la normativa local aplicable.
2. Transferencia 133 μl de espermatozoides móviles (criterio 1.5) a un nuevo tubo de 1,5 mL (25 x 10⁶ espermatozoides/mL).
   Nota: Si la concentración de la muestra es mayor, diluirlo en buffer NKM para lograr la concentración requerida; Si la concentración de la muestra de la natación por ejemplo es menor, centrifugar el sobrenadante obtenido después de nadar hasta a 1.000 x g durante 5 min, retirar 0.5 mL del sobrenadante y contar otra vez los espermatozoides.
3. Añadir 17 μl de DAPI (solución de trabajo) e incubar 10 min a 37 ° C.
4. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min y descarte el sobrenadante.
5. A la pelotilla, añadir 100 μl de buffer NKM.
6. Añadir 50 μl de PSA-FITC, 2 μl de JC-1 y 3 μl de PI (soluciones de trabajo) e incubar 10 min a 37 ° C.
7. Centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.
8. El precipitado, agregar 40 μl de tampón NKM y resuspender mediante pipeteo.
9. Transferir 10 μl de la muestra a un portaobjetos de vidrio, el borrón de transferencia y el cubreobjetos.
10. Visualizar inmediatamente por microscopía de epifluorescencia (uso 40 x objetivo) con un triple filtro, equipado con una cámara digital y capturar una imagen por separado para cada filtro.
    Nota: No hay ninguna importancia a la orden de filtros visualizado.
    1. Visualizar en el canal DAPI con excitación a 358 nm y emisión a 461 nm.
    2. Visualizar bajo canal FITC para monómeros verdes con excitación a 450 – 490 nm y emisión a 515 – 565 nm.
    3. Visualizar bajo canal de PI para hacer rojo con excitación de 488 nm y emisión a 590 nm.
    4. Visualizar según JC-1 rojo agregados con excitación a 559 nm y emisión en el rango de 574 – 627 nm; JC-1 verdes monómeros con excitación de 488 nm y emisión en el rango de 500-535 nm.
11. Unir las tres imágenes que recibió de los filtros en formato JPG/JPEG, usando la opción "merge" de software de la cámara.
12. Abra la imagen fusionada con la herramienta "Paint" y utilice la opción de pincel para marcar espermatozoides contados.
13. Clasificar basados en la fluorescencia emitida por cada sonda de espermatozoides:
    1. En general evaluar al menos 200 espermatozoides por diapositiva, todas las células aparecen azul (DAPI).
    2. Evaluar la viabilidad por recuento de células muertas, que aparecen púrpura (PI [rojo] + [blue] DAPI) y calcular el porcentaje de células muertas (células muerta contado total células x 100).
    3. Evaluar el estado del acrosoma con los patrones de tinción fluorescente (FITC-PSA). Calcular los porcentajes de los diferentes patrones (acrosoma intacto, dañados o reaccionado células total contado células x 100).
       Nota: Membrana acrosómica dañada aparece como una gorra de acrosoma totalmente barnizado, verde; membrana acrosómica reaccionada muestra residual verde ecuatorial o superior coloración; las células que contienen intacta membrana acrosómica no exhibirán ninguna coloración verde de la región acrosómica.
    4. Evaluar la ΔΨm distinción de espermatozoides con alta ΔΨm, que exhiben un midpiece teñido de rojo y los espermatozoides con baja ΔΨm que exhiben un midpiece teñido de verde. Cuenta roja y verde midpieces por separado y calcular su cociente (rojo/verde).

3. técnica #2: Evaluación de las membranas de espermatozoides listos para usar y citometría de flujo

Nota: Evaluación de la integridad de la membrana plasmática, integridad de la membrana acrosómica y potencial de membrana mitocondrial se realizó con kits de citometría de flujo lista para usar que contiene liofilizados fluorocromos en cada pozo. El procedimiento se realizó según los fabricantes con algunas modificaciones.

1. Evaluación de integridad de membrana plasmática
   1. Tome el número deseado de pocillos del paquete del kit de viabilidad y concentración (PI y SYbr14), transferencia a la base de trabajo y cubierta con una tapa flexible (proteger de la luz).
   2. Añadir 199 μl de solución tampón para citometría por pozo.
   3. Añadir 1 μl de semen homogénea en 57 x 106/ml (57.000 células por pocillo) y homogeneizar por pipeteo.
   4. Cubra la placa con la tapa negra.
   5. Incubar 10 min a 37 ° C, protegido de la luz.
   6. Ejecutar la muestra por el citómetro de flujo con la 'viabilidad' de configuración.
2. Potencial de membrana mitocondrial
   1. Tome el número deseado de pocillos del paquete del kit de actividad mitocondrial (JC-1), transferencia a la base de trabajo y cubierta con una tapa flexible (proteger de la luz).
   2. Añadir 10 μl de etanol absoluto por pozo y pipeta para Resuspender el polvo presente en el pozo.
   3. Añadir 190 μl de PBS por pozo y homogeneizar mediante pipeteo.
   4. Añadir 0,75 μl de semen homogénea en 57 x 106/ml (50.000 células por pocillo) y homogeneizar por pipeteo.
   5. Cubra la placa con la tapa negra.
   6. Incubar durante 30 min a 37 ° C, protegido de la luz.
   7. Ejecutar la muestra por el citómetro de flujo con la actividad de ʽmitochondrial de ajuste '.
3. Integridad de la membrana acrosómica
   Nota: PSA-FITC tinción (ver técnica de #1) permite la evaluación de las 3 categorías de acrosoma (acrosoma intacto, acrosoma reaccionado y acrosoma dañado). Uso del citómetro de flujo y viabilidad y kit de integridad del acrosoma (PI y FITC-PNA), los espermatozoides son separados en estas 3 categorías.
   1. Tomar el número de pozos el paquete de kit de integridad viabilidad y acrosoma, transferirlos a la base de trabajo y cubierta con una tapa flexible (proteger de la luz).
   2. Añadir 200 μL de solución tampón para citometría por pozo.
   3. Añadir 0,7 μl de semen homogénea en 57 x 106/ml (40.000 células por pocillo) y homogeneizar por pipeteo.
   4. Cubra la placa con la tapa negra.
   5. Incubar durante 45 min a 37 ° C, protegido de la luz.
   6. Ejecutar la muestra por el citómetro de flujo con la ʽInCyte de ajuste '.
   7. Analizar el histograma resultante por bloquear tres áreas de marcador según la intensidad de fluorescencia, en representación de insignificantes, baja fluorescencia células con acrosoma intacto, sin manchas (R1), baja fluorescencia células con residual manchado parte del acrosoma (R2) y células altamente fluorescentes con acrosoma interrumpida (R3).
      Nota: Utilice la sección "analizar archivos adquiridos mediante otros módulos" en la guía del usuario del instrumento para crear las tres regiones (R1, R2, R3).

4. técnica #3: Evaluación de las membranas de espermatozoides mediante sondas fluorescentes y citometría de flujo

Nota: Uso de anexina V combinado con PI fluorocromos permite evaluar apoptosis calcular la proporción de espermatozoides apoptóticos (índice de apoptosis).

1. Preparar 1 x annexin tampón de Unión V de 20 x solución (diluido 500 μl de tampón de Unión V 20 x solución con 9,5 mL de agua destilada estéril de anexina).
2. Estiman que el conteo de espermatozoides utilizando un hemocitómetro de Neubauer como se describe en la sección 1.7.
3. Lavar 10⁶ espermatozoides en 1 mL de 1 x anexina V enlace buffer y centrifugar a 300 x g durante 10 minutos.
4. Aspire completamente el sobrenadante.
5. Resuspender el sedimento en 100 μl de 1 x annexin tampón de unión de V.
6. Añadir 10 μl de anexina V conjugada con FITC.
7. Mezclar bien e incubar durante 15 min en oscuridad a temperatura ambiente.
8. Lavar espermatozoides mediante la adición de 1 mL de 1 x anexina V enlace tampón por 10⁶ células y centrifugar a 300 x g durante 10 minutos.
9. Aspire completamente el sobrenadante.
10. Resuspender el precipitado de células en 500 μl de 1 x anexina V enlace tampón por 10⁶ células totales.
11. Añadir 1 μg/mL PI inmediatamente antes del análisis con un citómetro de flujo.
12. Ejecutar la muestra por el citómetro de flujo en ʽInCyte'.

Resultados

Figura 1 muestra fluorimétrico simultánea evaluación de membranas del esperma (plasma y acrosómica y mitocondrial) usando PI, DAPI y FITC-PSA JC-1. Evaluación de las membranas de espermatozoides utilizando tinción simultánea con cuatro puntas de prueba fluorescentes permite, por ejemplo, evaluar la proporción de espermatozoides en cada categoría: vivo y muerto; alta vs baja ΔΨm; intactos vs. dañado el acrosoma, simultán...

Discusión

Potencial de fecundación de espermatozoides depende de múltiples factores que refleja su calidad. Una alta concentración de espermatozoides y una alta proporción de espermatozoides móviles altamente progresivamente podrían considerarse semen de alta calidad. Sin embargo, esa evaluación no toma en cuenta otros parámetros celulares y funcionales. El uso de la 'bancada' microcapillary citometría de flujo puede ser fácilmente adaptado a la evaluación de diferentes estructuras de esperma mediante sondas fluorescent...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]	Sigma	M1254
PBS	Sigma	P5493
DMSO	Sigma	D2438
Ethanol absolute	Sigma	64-17-5
Hemacytometer	Neubauer Germany		hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542	fluorescent probe
PI (propidium iodide )	Sigma	P4170	fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )	Sigma	L0770	fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)	ENZOBiochem, New York, NY, USA	ENZ52304	fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC	MACS, Miltenyi Biotec	130-093-060	fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20x stock solution	MACS, Miltenyi Biotec	130-092-820	buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u	Nikon, Tokyo, Japan		inverted fluorescence microscope
Nis Elements	Nikon, Tokyo, Japan		software
Nikon DXM1200F	Nikon, Tokyo, Japan		digital camera
Guava EasyCyte Plus	IMV Technologies, L'Aigle, France		microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft	Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies		software
Buffered solution for cytometry	IMV Technologies, L'Aigle, France	023862	buffer
Viability and concentration kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	024708	kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	024864	kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	025293	kit for acrosome integrity assessment
JMP-13	SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA		software
Bovine sperm	"SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel