정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

요약

여기, 우리는 spermatozoan 막 무결성, 정자의 수정 능력와 관련 된 세포 기능을 평가 하는 방법론을 제시. 우리 정자 세포 막의 fluorimetric 평가 대 한 세 가지 기술에 설명: 특정 형광 프로브, 형광 현미경 검사 법, 그리고 고급 정자 전용 cytometry 동시 얼룩. 방법론을 결합의 예제도 제공 됩니다.

초록

정자의 품질을 설명 하는 표준 spermiograms 주로 생리 및 시각적 매개 변수, 사정 및 농도, 운동 성 및 진보적인 운동 성, 정자 형태 및 생존 능력 등 기준으로 합니다. 그러나, 이러한 평가은 충분히 정액 질을 예측 하는 좋은입니다. 그의 정자 생존 및 잠재적인 수정 유지 보수 막 무결성 및 세포내 기능에 따라, 이러한 매개 변수 평가 수 가능 정자의 수정 능력의 더 나은 예측 여기, 형광 현미경 검사 법 또는 흐름 cytometry 분석 결합 된 특정 형광 프로브를 사용 하 여 정자의 품질을 평가 하 세 가지 가능한 방법을 설명 합니다. 분석 평가 플라즈마 멤브레인 무결성 4', 6-diamidino-2-phenylindole를 사용 하 여 (DAPI) 및 propidium 요오드 화물 (PI), acrosomal 막 무결성 fluorescein isothiocyanate 활용을 사용 하 여 Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) 및 미토 콘 드 리아 멤브레인 무결성 사용 하 여 5, 5' 6, 6'-tetra-클로-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine 요오드 화물 (JC-1). 이러한 방법의 조합 또한 제공 됩니다. 예를 들어, annexin V의 사용 apoptosis를 평가 하 고 apoptotic 정자 (apoptotic 인덱스)의 비율을 계산 PI 형광 수와 결합. 우리 정자 막 검사에 근거 하는 이러한 방법론은 정자 품질 평가 대 한 매우 유용 합니다 믿습니다.

서문

정자 세포 막의 기능과 무결성 정자 생존 및 수정 가능성를 나타내는 요인 중 몇 가지 있습니다. 원형질 막 세포 삼 투 평형¹유지 세포내와 세포 외 구획 사이 방 벽 역할을 합니다. 원형질 막 무결성에 손상을 유도 스트레스 항상성 손상, 생존 능력 및 수정 능력을 감소 되 고 증가 세포 죽음. 예를 들어, cryopreservation 온도 변화 및 삼투성 스트레스²결과로 그것의 원형질 막에 손상에 인해 정자 생존 능력을 감소 시킨다. 우리는 이전 그 정자 생존^{1,3 감소 불 정자 농약 아트 가진, 그것의 주요 대사 산물 diaminochlorotriazine 등 mycotoxin 아플 라 톡 신 B1, 식중독 오염 물질의 낮은 농도에 노출 보고} . 이 손상 된 원형질 막 세포의 DNA에는 PI와 함께에서 DAPI와 이중 가닥 DNA 라벨 의해 결정 되었다.

Acrosome 반응 (AR) 외부 acrosome 막 및 acrosomal 효소^4,5의 출시에 따른 overlying 원형질 막의 융해를 포함 한다. 이들은 zona pellucida 침투 및 추가 oocyte⁶정자의 병합을 위해 필수적인 행사입니다. 따라서, acrosomal 막 무결성의 평가 정액 질 및 남성 불 임^7,,89평가 하는 유용한 매개 변수를 구성 합니다. 여러 형광 기법 acrosome 무결성, PNA FITC FITC PSA^8,10의 확인을 위해 적당 하다. FITC PSA 얼룩^1,3의 패턴을 사용 하 여 우리의 이전 연구에서 우리는 그대로 acrosome (i)에 대 한 정확한 정의 제공 (ii) acrosome 막 손상 하 고 (iii) acrosome 반응. 현재 보고서에서 우리 정자 전용 cytometry를 사용 하 여 acrosome 상태를 평가 하 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 그 결과 비교.

Mitochondria은 다기능 세포에, ATP 합성, 반응성 산소 종 생산, 칼슘 신호 및 apoptosis에 관여. 생리 장애, 남성 및 여성 불 임을 포함 한 변경 된 미토 콘 드리 아 기능¹¹와 연결 됩니다. 정자의 미토 콘 드리 아는 midpiece에서 배열 되 고 정자 운동 성¹²에서 중요 한 역할. 그것은 잘 높은 미토 콘 드리 아 막 잠재력 (ΔΨm)은 정상적인 운동 성 및 높은 수정 용량¹³와 연결을 허용 합니다. 대조적으로, 낮은 ΔΨm 반응성 산소 종의 높은 수준에 연결 하 고 수정 속도¹⁴감소. 그럼에도 불구 하 고, 다양 한 환경 화합물, 예를 들면 내 분 비 분리기, 수 세포 스트레스를 유발 하 고 ΔΨm, hyperpolarization^1,3, 그리고 결국, 자유 래 디 칼의 생산 증가에 일시적인 증가를 끌 apoptosis¹⁵. 형광 프로브 5, 5' 6, 6'-tetra-클로-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine 요오드 화물 (JC-1) 예를 들어 정자 ΔΨm^1,3에 식중독 독 소의 효과 조사 가능.

표준 spermiograms, 생리 및 형태학 매개 변수에 따라 충분히 정액 질을 예측 하는 좋지 않다. 더 정확한 방법은 정자의 품질을 보장 하기 위해 필요 합니다. 여기, 우리는 정자 세포 막의 평가에 따라 정자의 품질을 결정 하기 위해 두 가지 가능한 방법 제공: 형광 현미경 검사 법, 우리의 연구^1,3 에 설명 된 특정 형광 프로브와 동시 콰 얼룩 그리고 고급 정자 전용 cytometry, 최근 활용 우리의 실험실과 다른 사람에 의해 이미 사용 되 고^16,,1718.

프로토콜

모든 실험 동물 복지에 대 한 1994 이스라엘 지침에 따라 수행 했다. 소 정자 인공 수정 및 번 식에 대 한 상업 이스라엘 회사에 의해 공급 되었다. 11 시카고 불스의 ejaculates이이 연구에서 평가 했다.

1. 정자 샘플 준비

참고: 절차는 로스 연구소의 프로토콜^1,3를 기반으로 합니다.

1. 실 온에서 15 mL 튜브에 황소 정액의 약 1-6 mL를 얻을.
2. 정액의 각 1 ml, 6 mL (37 ° C)에서 prewarmed NKM 버퍼 (110 m m NaCl, KCl, 5mm [3-N-morphilino propanesulfonic 산, pH 7.4] 20mm MOPS)의 추가 하 고 원심 600 x g, 8 분 1-2 회는 상쾌한 때까지 명확 합니다.
   참고: 있다면 정자 농도 또는 초기 볼륨 매우 높은 첫 번째 세척에 2 개의 관으로 분할.
3. 즉시 제거 하 고 맑은 상쾌한 삭제 펠 릿 위에 상쾌한의 대략 1 cm를 두고.
4. 조심 스럽게 기대를 수영 하 고 37 ° c.에 수영 정 충 수 있도록 20-30 분을 기다려 하 정자에 대 한 표면 영역을 증가 30 ° 각도로 튜브
   참고: 탁도 볼 수 있습니다.
5. micropipette 신중 하 게 사용 하 여, 새로운 1.5 mL 튜브에 운동 정 충을 포함 하는 상쾌한의 상단 1 mL를 제거 합니다.
6. 37 ° C에서 사용까지 정자를 유지.
7. Neubauer hemocytometer를 사용 하 여 정자 수를 견적 한다.
   참고: 다른 세 상공 대신, 사용할 수 있습니다 하지만 계산 하는 것은 다르다.
   1. 정자 움직임을 방지 하기 위해, 두 배 증류수 (DDW) (1: 100 희석) 15 mL 튜브에 10 mL와 함께 운동 정 충의 100 µ L를 희석 하 고 부드럽게 혼합 합니다.
   2. Hemocytometer coverslip의 각 측에 10 µ L의 샘플을 로드 합니다. 이 부정 확 한 정자 수 발생할 수 있으므로 챔버 내부에 거품 형성을 피하기 위해 있는지 확인 합니다.
   3. 20 X 목표 화합물 현미경 관찰 합니다.
      참고: hemocytometer의 전체 표에 포함 9 큰 사각형, 각 1 m m², 그리고는 coverglass 챔버의 바닥 위에 0.1 m m를 달려있다. 따라서, 중앙 세 영역 볼륨은 0.1 m m³ 또는 0.1 µ L. hemocytometer의 중앙 지역 25 중간 사각형을 포함 하 고 각 중간 사각형은 단일 라인 16 작은 사각형.
   4. 4 중간 코너 광장, 중앙 광장에 있는 셀의 총 수를 계산 합니다. 높은 정밀도 대 한 두 개의 챔버 (Neubauer hemocytometer의 양쪽) 세 고 평균을 사용 하 여 셀 농도 계산.
   5. 5 (지역 세 당 셀의 수를 얻으려면) 및 10000 (희석된 샘플의 1 mL 당 셀의 수를 얻으려면)에 의해 평균 수를 곱하여 정자 수를 계산 합니다. 다음 희석 비율 (1: 100)에 의해 얻은 수를 곱하면 됩니다.
      참고: 예를 들어 두 개의 챔버의 중앙 계산 영역 내에서 25 중간 사각형의 5에서 계산 하는 정자의 평균 수는 150 ([152 + 148] / 2). 따라서, sperms 챔버 (또는 0.1 µ L 당)의 평균 수는 150 x 5 = 750. 750 여 10000 희석된 샘플 (7500000)의 1 mL 당 셀 수 다음 원래 정액 샘플의 mL 당 75 x 10⁷ 세포를 100 (희석 요인)에 의해 곱하기를 곱하면 됩니다.

2. 기술 #1: 여러 형광을 사용 하 여 정자 세포 막의 동시 평가 조사

참고: 정자 세포 막 (플라스마, acrosomal 및 미토 콘 드리 아) Celeghini 외¹⁰, 몇 가지 수정 하 여 앞에서 설명한 평가 됐다. Epifluorescent 현미경 검사 법, 450-490 nm에서 여기와 트리플 필터를 사용 하 여 515-565 nm에 방출 디지털 카메라와 함께 사용 되었다.

1. 재고 솔루션을 준비 합니다.
   1. 5mg DAPI의 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) 50 mL에 용 해 하 여 0.1 mg/mL DAPI 재고 솔루션을 준비 합니다. 50 µ L aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에 저장 사용 하기 전에 1:10 (작업 솔루션, 10 µ g/mL)에 PBS 가진 재고 솔루션을 희석.
   2. FITC-PSA의 PBS의 1 mL에 1 mg를 용 해 하 여 1 mg/mL FITC-PSA 재고 솔루션을 준비 합니다. 50 µ L aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에 저장 사용 하기 전에 1:10 (작업 솔루션, 100 µ g/mL)에 PBS 가진 재고 솔루션을 희석.
   3. JC-1의 1 밀리 그램의 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 1 mL에 용 해 하 여 1 mg/mL JC-1 재고 솔루션을 준비 합니다. 10 µ L aliquots를 준비 하 고-20 ° c.에 저장 사용 하기 전에 1:10 (작업 솔루션; 0.1 mg/mL)에서 DMSO와 재고 솔루션을 희석.
   4. PBS (주는 2.5 mg/mL)의 400 µ L에 PI의 10mg을 용 해 하 여 PI 재고 솔루션을 준비 합니다. 스토어 + 4 ° c. 1:20 (작업 솔루션, 0.125 mg/mL)에서 PBS 1 재고 희석. 재고 솔루션으로 + 4 ° C에서 저장 합니다.
      주의: PI 잠재적인 돌연 이며 신중 하 게 처리 되어야 한다. 해당 지역 규정에 따라 안전 하 게의 염료를 삭제 해야 합니다.
2. 새로운 1.5 mL 튜브 (25 x 10⁶ 정자/mL)을 운동 정 충 (단계 1.5)의 133 µ L를 전송 합니다.
   참고: 샘플 농도 더 높은 경우에, 필요한 농도; 달성 하기 NKM 버퍼에 희석 샘플을 수영의 샘플 농도 낮은 경우에, 1000 x g 5 분에서 최대 수영 후 얻은 상쾌한 원심는 상쾌한의 0.5 mL을 제거 하 고 다시 정자를 계산.
3. DAPI (작업 솔루션)의 17 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어
4. 5 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한 삭제.
5. 펠 릿, 100 µ L의 NKM 버퍼 추가 합니다.
6. FITC-PSA의 50 µ L, JC-1의 2 µ L, PI (작업 솔루션)의 3 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에서 10 분 동안 품 어
7. 5 분 동안 1000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 제거 합니다.
8. 펠 릿, 하 NKM 버퍼의 40 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 resuspend.
9. 유리 슬라이드, 얼룩 및 coverslip 10 µ L의 샘플을 전송 합니다.
10. 트리플 필터, 디지털 카메라를 갖춘 epifluorescence 현미경 검사 법 (사용 40 x 목표)에 의해 즉시 시각화 하 고 별도로 각 필터에 대 한 이미지를 캡처하십시오.
    참고: 시각 필터 순서 아무 의미가 있다.
    1. 358 nm에서 여기 및 방출 461에 DAPI 채널에서 시각화 nm.
    2. 515-565 nm에 방출 450-490 nm에서 여기와 녹색 단위체에 대 한 FITC 채널에서 시각화.
    3. 여기 488 nm 및 590에서 방출 빨간 집계에 대 한 PI 채널에서 시각화 nm.
    4. JC-1 시각화 559 nm, 574-627 nm;의 범위에 방출에서 여기 빨간 집계 488 nm와 500-535 nm의 범위에 방출에서 여기 JC-1 녹색 단위체.
11. 카메라 소프트웨어의 "병합" 옵션을 사용 하 여 JPG/JPEG 형식의 필터에서 받은 3 개의 이미지를 병합 합니다.
12. "페인트" 도구는 병합 된 이미지를 열고 계산된 정 충을 브러시 옵션을 사용 하 여.
13. 각 프로브에서 방출 하는 형광에 따라 정 충을 분류:
    1. 일반적 평가 슬라이드 당 적어도 200 정 충-모든 셀 표시 블루 (DAPI).
    2. 생존 능력 평가 죽은 세포를 계산 하 여 나타나는 보라색 (PI [레드] + [블루] DAPI)와 죽은 세포 (죽은 세포/총 계산 셀 x 100)의 비율을 계산.
    3. 형광 (FITC-PSA) 얼룩의 패턴을 사용 하 여 acrosome 상태를 평가 합니다. (손상, 손상 또는 반작용 acrosome 셀/총 계산 셀 x 100) 다양 한 패턴의 비율을 계산 합니다.
       참고: 손상 된 acrosomal 막이 나타납니다 완전히 스테인드, 녹색 acrosome 뚜껑; 반작용된 acrosomal 막이 보여줍니다 잔여 녹색 적도 또는 위 얼룩; 그대로 acrosomal 멤브레인 포함 된 셀 acrosomal 영역의 어떤 녹색 얼룩 전시 하지 것입니다.
    4. ΔΨm 레드 스테인드 midpiece 전시, 높은 ΔΨm와 정 충 그리고 녹색 얼룩이 midpiece 전시 하는 낮은 ΔΨm와 정 충을 구분 하 여 평가 합니다. 레드와 그린 midpieces 별도로 세 고 그들의 비율을 (빨강/녹색).

3. 기술 #2: 평가 준비-사용 키트와 Cytometry 정자 세포 막

참고: 원형질 막 무결성, 미토 콘 드리 아 막 잠재력과 acrosomal 막 무결성 평가 준비-사용 흐름 cytometry 키트에 각 잘 동결 건조 된 형광으로 수행 되었다. 절차는 몇 가지 수정 제조 업체에 따라 수행 되었다.

1. 원형질 막 무결성 평가
   1. 생존 및 농도 키트 (PI, SYbr14)의 패키지에서 우물의 원하는 수, 작업 자료 유연한 뚜껑 덮개에 그들을 전송 (빛에서 보호).
   2. 잘 당 cytometry 버퍼 솔루션의 199 µ L를 추가 합니다.
   3. 57 x 10⁶/mL (57000 셀 잘 당)에서 균질 정액의 1 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 균질.
   4. 검은 뚜껑 접시 커버.
   5. 빛에서 보호 하는 37 ° C에서 10 분 동안 품 어.
   6. 설정 '생존'과 교류 cytometer 통해 샘플을 실행 합니다.
2. 미토 콘 드리 아 막 잠재력
   1. 미토 콘 드리 아 활동 키트 (JC-1)의 패키지에서 우물의 원하는 수, 작업 자료 유연한 뚜껑 덮개에 그들을 전송 (빛에서 보호).
   2. 잘 당 절대 에탄올의 10 µ L을 추가 하 고 잘 내 현재 분말 resuspend 플라스틱.
   3. 잘 당 PBS의 190 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 균질.
   4. 57 x 10⁶/mL (잘 당 50000 세포)에서 균질 정액의 0.75 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 균질.
   5. 검은 뚜껑 접시 커버.
   6. 빛에서 보호 하는 37 ° C에서 30 분 동안 품 어.
   7. 교류 cytometer 설정 ʽmitochondrial 활동을 통해 샘플을 실행 '.
3. Acrosomal 막 무결성
   참고: FITC-PSA 얼룩 (기술 #1 참조) 3 acrosome 카테고리 (그대로 acrosome, 반작용된 acrosome 및 손상된 acrosome)의 평가 수 있습니다. 교류 cytometer 생존 및 acrosome 무결성 키트 (PI와 FITC-PNA)를 사용 하는 정 충이 3 개의 종류로 구분 됩니다.
   1. 생존 & acrosome 무결성 키트 패키지에서 우물의 원하는 수, 작업 자료 유연한 뚜껑 덮개에 그들을 전송 (빛에서 보호).
   2. 잘 당 cytometry 버퍼 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다.
   3. 57 x 10⁶/mL (40, 000 셀 잘 당)에서 균질 정액의 0.7 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 균질.
   4. 검은 뚜껑 접시 커버.
   5. 빛에서 보호 하는 37 ° C에서 45 분 동안 품 어.
   6. 샘플 설정 ʽInCyte와 교류 cytometer 통해 실행 '.
   7. 형광 강도 따라 3 개의 마커 영역을 게이팅 하 여 결과 히스토그램 분석, 잔류 스테인드 acrosome (R2)의 일부와 세포 낮은 fluorescing 그대로, 흠 없는 acrosome (R1)를 무시할 수, 낮은 fluorescing 셀 대표 및 교란된 acrosome (R3)와 매우 fluorescing 셀.
      참고: 3 개 지역 (R1, R2, R3)을 만들기 위해 악기 사용자 가이드의 "파일 다른 모듈을 사용 하 여 인수 분석" 섹션을 사용 합니다.

4. 기술 #3: 평가 형광 프로브 및 Cytometry 사용 하 여 정자 세포 막의

참고: Annexin V의 사용 apoptosis를 평가 하 고 apoptotic 정자 (apoptotic 인덱스)의 비율을 계산 PI 형광 수와 결합.

1. Annexin V 바인딩 버퍼 재고 솔루션 (annexin V 바인딩 버퍼 20 살 균 증류수의 9.5 mL 재고 솔루션 x의 희석 µ 500 L) x 20 x 1을 준비 합니다.
2. 1.7 섹션에 설명 된 대로 Neubauer hemocytometer를 사용 하 여 정자 수를 견적 한다.
3. Annexin V 바인딩 버퍼와 300 x g 에서 원심 분리기는 10 분 x 1의 1 mL에 10⁶ 정 충을 씻어.
4. 완전히는 상쾌한 발음.
5. Annexin V 바인딩 버퍼 x 1의 100 µ L에 펠 릿을 resuspend.
6. FITC 활용 annexin V의 10 µ L를 추가 합니다.
7. 잘 혼합 하 고 실 온에서 어둠 속에서 15 분 동안 품 어.
8. 10 분에 대 한 300 x g 에서 1 x annexin V 바인딩 버퍼 10⁶ 세포와 원심 분리기의 1 mL을 추가 하 여 정 충을 씻어.
9. 완전히는 상쾌한 발음.
10. 1 x annexin V 바인딩 버퍼 10⁶ 총 셀 당 500 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
11. 교류 cytometer 분석 직전 1 µ g/mL PI를 추가 합니다.
12. ʽInCyte에 설정 흐름 cytometer 통해 샘플을 실행 '.

결과

그림 1 보여줍니다 동시 fluorimetric 평가 정자 세포 막 (플라스마, acrosomal 및 미토 콘 드리 아)의 PI, DAPI, FITC PSA와 JC-1을 사용합니다. 4 형광 프로브 동시 얼룩을 사용 하 여 정자 세포 막의 평가 허용, 예를 들어 각 카테고리에서 정자의 비율을 평가-라이브 대 죽은; 높은 대 낮은 ΔΨm; 그대로 vs. acrosome 손상-각 정자에 대 한 동시에.

...

토론

정자의 수정 가능성의 품질을 반영 하는 여러 요인에 따라 달라 집니다. 정 충의 높은 농도 매우 점진적으로 운동 정 충의 높은 비율에 게 높은-품질 정액을 고려 될 수도 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 그러한 평가를 고려 하지 않는 다른 세포 및 기능 매개 변수. ' 벤치 맨 ' microcapillary 교류 cytometer 사용 하 여 이전¹⁷ 다른 사람에 의해 표시 하 고 시연 여기 (기술 #3) 형광 프로브?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]	Sigma	M1254
PBS	Sigma	P5493
DMSO	Sigma	D2438
Ethanol absolute	Sigma	64-17-5
Hemacytometer	Neubauer Germany		hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542	fluorescent probe
PI (propidium iodide )	Sigma	P4170	fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )	Sigma	L0770	fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)	ENZOBiochem, New York, NY, USA	ENZ52304	fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC	MACS, Miltenyi Biotec	130-093-060	fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20x stock solution	MACS, Miltenyi Biotec	130-092-820	buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u	Nikon, Tokyo, Japan		inverted fluorescence microscope
Nis Elements	Nikon, Tokyo, Japan		software
Nikon DXM1200F	Nikon, Tokyo, Japan		digital camera
Guava EasyCyte Plus	IMV Technologies, L'Aigle, France		microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft	Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies		software
Buffered solution for cytometry	IMV Technologies, L'Aigle, France	023862	buffer
Viability and concentration kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	024708	kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	024864	kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	025293	kit for acrosome integrity assessment
JMP-13	SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA		software
Bovine sperm	"SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel