Fluorimétrique Techniques pour l’évaluation des Membranes des spermatozoïdes

Résumé

Nous présentons ici les méthodes pour évaluer l’intégrité membranaire de spermatozoïde, une fonctionnalité cellulaire associée à compétence de fertilisation de sperme. Nous décrivons trois techniques pour l’évaluation fluorimétrique des membranes des spermatozoïdes : coloration simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques, microscopie à fluorescence et avancé cytométrie dédiés au sperme. Exemples de combiner les méthodes sont également présentés.

Résumé

Spermiograms standards décrivant la qualité du sperme sont principalement basées sur les paramètres physiologiques et visuels, tels que le volume de l’éjaculat et concentration, mobilité et motilité progressive et la morphologie des spermatozoïdes et la viabilité. Cependant, aucun de ces évaluations est assez bon pour prédire la qualité de sperme. Étant donné que le maintien de la viabilité des spermatozoïdes et la fécondation potentielle dépend de l’intégrité membranaire et intracellulaire fonctionnalité, évaluation de ces paramètres pourrait permettre une meilleure prédiction de la compétence de la fécondation de sperme. Nous décrivons ici trois méthodes possibles pour évaluer la qualité du sperme à l’aide de sondes fluorescentes spécifiques combinées avec des analyses fluorescence microscopie ou écoulement cytometry. Analyses a évalué l’intégrité de la membrane plasmique avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’iodure de propidium (PI), intégrité de la membrane acrosomique utilisant conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine agglutinine de Pisum sativum (FITC-PSA) et intégrité de la membrane mitochondriale à l’aide de 5, 5', 6, 6'-tétra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodure (JC-1). Combinaisons de ces méthodes sont également présentées. Par exemple, utilisation de l’annexine V combiné avec permet de fluorochromes PI évaluant l’apoptose et de calculer la proportion de spermatozoïdes apoptotiques (index apoptotique). Nous croyons que ces méthodes, qui reposent sur l’examen des membranes de spermatozoïde, sont très utiles pour l’évaluation de la qualité du sperme.

Introduction

L’intégrité et la fonctionnalité des membranes des spermatozoïdes sont quelques-uns des facteurs indiquant la viabilité des spermatozoïdes et la fécondation potentielle. La membrane plasmique agit comme une barrière entre les compartiments intracellulaires et extracellulaires, préservant ainsi l' équilibre osmotique cellulaire¹. Tout stress qui provoque des dommages à l’intégrité de la membrane plasmique pourrait nuire à l’homéostasie, réduire la capacité de viabilité et de la fertilisation et augmenter la mort cellulaire. Par exemple, cryoconservation réduit la viabilité de sperme la dommages à sa membrane plasmique, par suite de changements de température et de stress osmotique². Nous avons déjà indiqué que l’exposant de sperme de taureau à de faibles concentrations de contaminants d’origine alimentaire tels que l’atrazine de pesticides, son principal métabolite diaminochlorotriazine ou l’aflatoxine mycotoxine B1, réduit sperme viabilité^1,3 . Cela a été déterminé par marquage de l’ADN double-brin au DAPI en combinaison avec PI, qui se lie à l’ADN des cellules avec une membrane plasmique endommagée.

Réaction de l’acrosome (AR) implique la fusion de la membrane de l’acrosome externe et la membrane plasmique sus-jacente, aboutissant à la libération d’enzymes acrosomique^4,5. Voici les événements essentiels pour pellucide pénétration et plus loin la fusion du spermatozoïde avec l' ovocyte⁶. En conséquence, l’évaluation de l’intégrité membranaire acrosomique constitue un paramètre utile pour évaluer la qualité du sperme et la fertilité masculine^7,8,9. Plusieurs techniques de fluorescence sont appropriés pour la vérification de l’intégrité de l’acrosome, FITC-PNA ou FITC-PSA^8,10. Dans nos études précédentes, en utilisant les patrons de PSA FITC coloration^1,3, nous fournit des définitions précises de (i) acrosome intact, (ii) endommagé la membrane de l’acrosome et (iii) a réagi acrosome. Dans le présent rapport, nous évaluer l’état d’acrosome cytométrie dédiés au sperme et comparer les résultats à ceux utilisant la microscopie à fluorescence.

Les mitochondries sont des organites multifonctionnels impliqué dans, entre autres choses, ATP synthèse, production d’espèces oxygénées radicalaires, signalisation calcique et l’apoptose. Des dysfonctionnements physiologiques, y compris la stérilité masculine et féminine, sont associés à l’altération de la fonction mitochondriale¹¹. Mitochondries du sperme sont disposées dans la pièce et jouent un rôle crucial dans la motilité de sperme¹². Il est bien reconnu que haut potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨm) est associé à la motilité normale et fertilisation haute capacité¹³. En revanche, ΔΨm faible est associé à un niveau élevé d’espèces réactives de l’oxygène et réduit le taux de fécondation¹⁴. Néanmoins, divers composés environnementaux, par exemple de perturbateurs endocriniens, peuvent provoquer le stress cellulaire et conduisent à une augmentation transitoire de la ΔΨm, hyperpolarisation^1,3, augmentation de la production de radicaux libres et, éventuellement, ¹⁵de l’apoptose. La sonde fluorescente 5, 5', 6, 6'-tétra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodure (JC-1) permet d’examiner par exemple, les effets des toxines d’origine alimentaire sur sperme ΔΨm^1,3.

Spermiograms standards, en fonction des paramètres physiologiques et morphologiques, ne sont pas assez bons pour prédire la qualité de sperme. Des méthodes plus précises sont nécessaires pour assurer la qualité du sperme. Ici, nous fournissent deux méthodes possibles pour déterminer la qualité du sperme fondée sur des évaluations des membranes des spermatozoïdes : coloration quadruple simultanée avec des sondes fluorescentes spécifiques et la microscopie de fluorescence, décrit dans nos études^1,3 et cytométrie en flux de sperme-dédiée avancée, utilisées récemment dans notre laboratoire et déjà utilisé par d’autres^16,17,18.

Protocole

Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux directives israélien 1994 pour le bien-être animal. Sperme bovin a été fourni par la compagnie israélienne commerciale pour élevage et d’insémination artificielle. Les éjaculats de 11 taureaux ont été évalués dans cette étude.

1. préparation de l’échantillon de sperme

Remarque : La procédure est issue protocole^{1,3 du laboratoire Roth}.

1. Obtenir environ 1 à 6 mL de sperme de taureau dans un tube de 15 mL à température ambiante.
2. À chaque 1 mL de sperme, ajouter 6 mL de tampon NKM préchauffée (à 37 ° C) (110 mM NaCl, KCl, 5 mM 20 mM MOPS [3-N-morphilino sulfonique ; pH 7,4]) et centrifuger à 8 min à 600 g, 1 à 2 fois jusqu'à ce que le liquide surnageant est clair.
   Remarque : Si la concentration des spermatozoïdes ou le volume initial est très élevé, divisé en deux tubes au premier lavage.
3. Immédiatement, retirer et jeter le surnageant clair et laisser environ 1 cm du surnageant au-dessus du culot.
4. Soigneusement se pencher les tubes selon un angle de 30° pour augmenter la surface des spermatozoïdes à nager vers le haut et attendez 20 à 30 min pour permettre des spermatozoïdes à nager vers le haut à 37 ° C.
   Remarque : Turbidité peut être vu.
5. Aide d’une micropipette soigneusement, enlever le haut 1 mL du surnageant contenant les spermatozoïdes dans un nouveau tube de 1,5 mL.
6. Garder le sperme à 37 ° C jusqu'à l’utilisation.
7. Estimer le nombre de spermatozoïdes à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer.
   Remarque : Une chambre de comptage différente peut être utilisée à la place, mais le décompte est différent.
   1. Pour éviter tout mouvement de spermatozoïde, diluer 100 µL des spermatozoïdes motiles avec 10 mL d’eau bidistillée (DDW) (dilution 1 : 100) dans un tube de 15 mL et mélanger doucement.
   2. Charger 10 µL de l’échantillon de chaque côté de l’hémocytomètre et lamelle. Veillez à éviter la formation de bulles à l’intérieur de la chambre car cela peut entraîner une numération des spermatozoïdes inexactes.
   3. Observer au microscope composé avec un objectif 20 X.
      Remarque : La grille complète sur un hémocytomètre contient 9 grands carrés, chacun de 1 mm², et la lamelle repose 0,1 mm au-dessus du sol de la chambre. Ainsi, le volume au-dessus de la zone centrale de comptage est de 0,1 mm³ ou 0.1 µL. La zone centrale de l’hémocytomètre contient 25 places moyennes et chaque carré moyen a 16 carrés plus petits avec des lignes simples.
   4. Compter le nombre total de cellules 4 places d’angle moyen et la place centrale. Pour une plus grande précision, compter deux chambres (les deux côtés de l’hémocytomètre Neubauer) et la moyenne permet de calculer la concentration cellulaire.
   5. Calculer le nombre de spermatozoïdes en multipliant le nombre moyen obtenu par 5 (pour obtenir le nombre de cellules par zone de comptage) et par 10 000 (pour obtenir le nombre de cellules par 1 mL d’échantillon dilué). Alors, multipliez le nombre obtenu par le facteur de dilution (1/100).
      Remarque : Par exemple, un nombre moyen de spermatozoïdes comptés dans 5 des 25 places moyennes dans la zone centrale de comptage de deux chambres est 150 ([152 + 148] / 2). Ainsi, le nombre moyen de spermatozoïdes par chambre (ou par 0,1 µL) est de 150 x 5 = 750. Multipliez les 750 par 10 000 pour obtenir le nombre de cellules par 1 mL de l’échantillon dilué (7 500 000) et puis multiplier par 100 (facteur de dilution) afin d’obtenir 75 x 10⁷ cellules / mL d’échantillon de sperme original.

2. technique #1 : Évaluation simultanée des Membranes des spermatozoïdes à l’aide de multiples Fluorescent sondes

Remarque : Des membranes des spermatozoïdes (plasma, acrosome et mitochondrial) ont été évaluées comme décrit par Celeghini et al.¹⁰, avec quelques modifications. La microscopie épifluorescente servait, combiné avec un appareil photo numérique avec excitation à 450-490 nm et d’émission à 515-565 nm en utilisant un filtre triple.

1. Préparer les solutions.
   1. Préparer à 0,1 mg/mL solution DAPI en dissolvant 5 mg de DAPI dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Préparer 50 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C. Avant utilisation, diluer la solution mère avec du PBS à 01:10 (solution de travail ; 10 µg/mL).
   2. Préparer 1 mg/mL solution FITC – PSA en dissolvant 1 mg de FITC – PSA dans 1 mL de PBS. Préparer 50 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C. Avant utilisation, diluer la solution mère avec du PBS à 01:10 (solution de travail ; 100 µg/mL).
   3. Préparer 1 mg/mL JC-1 solution en dissolvant 1 mg de JC-1 dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO). Préparer 10 µL d’extraits et de conserver à-20 ° C. Avant utilisation, diluer la solution mère avec le DMSO à 01:10 (solution de travail ; 0,1 mg/mL).
   4. Préparer la solution mère de PI en dissolvant 10 mg de PI dans 400 µL de PBS (soit 2,5 mg/mL). Conserver à + 4 ° C. Diluer stock 1 avec du PBS à 01:20 (solution de travail ; 0,125 mg/mL). Conserver à + 4 ° C comme une solution-mère.
      ATTENTION : PI est un potentiel mutagène et doit être manipulé avec soin. Le colorant doit être éliminé en toute sécurité et conformément aux réglementations locales applicables.
2. Transférer 133 µL des spermatozoïdes motiles (étape 1.5) dans un nouveau tube de 1,5 mL (25 x 10⁶ spermatozoïdes/mL).
   Remarque : Si la concentration de l’échantillon est plus élevée, le diluer dans le tampon NKM à obtenir la concentration requise ; Si la concentration de l’échantillon de la natation, l’échantillon est inférieure, centrifuger le surnageant obtenu après avoir nagé vers le haut à 1 000 x g pendant 5 min, prélever 0,5 mL du surnageant et compter les spermatozoïdes à nouveau.
3. Ajouter 17 µL de DAPI (solution de travail) et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
4. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
5. Au culot, ajouter 100 µL de tampon NKM.
6. Ajouter 50 µL de FITC – PSA, 2 µL de JC-1 et 3 µL de PI (solutions de travail) et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
7. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min et retirer le surnageant.
8. Au culot, ajouter 40 µL de tampon de NKM et remettre en suspension par pipetage.
9. Transférer 10 µL de l’échantillon à une lame de verre, le frottis et la lamelle couvre-objet.
10. Visualiser immédiatement par microscopie à épifluorescence (utilisation 40 x objectif) avec un triple filtre, équipé d’un appareil photo numérique et de capturer une image séparément pour chaque filtre.
    Remarque : Il n’y a pas d’importance à l’ordre des filtres visualisé.
    1. Visualiser sous canal DAPI avec excitation à 358 nm et d’émission à 461 nm.
    2. Visualiser sous canal FITC de monomères verts avec excitation à 450 – 490 nm et d’émission à 515 – 565 nm.
    3. Visualiser sous canal PI pour les agrégats rouges avec excitation à 488 nm et d’émission à 590 nm.
    4. Visualiser sous JC-1 rouges agrégats avec excitation à 559 nm et d’émission de l’ordre de 574 – 627 nm ; JC-1 verts monomères avec excitation à 488 nm et d’émission de l’ordre de 500 – 535 nm.
11. Fusionner les trois images provenant des filtres au format JPG/JPEG, à l’aide de l’option de « fusion » du logiciel de la caméra.
12. Ouvrez l’image fusionnée avec l’outil « Paint » et utilisez l’option de la brosse pour marquer les spermatozoïdes comptés.
13. Classer les spermatozoïdes basées sur la fluorescence émise par chaque sonde :
    1. Évaluer en général au moins 200 spermatozoïdes par lame — toutes les cellules apparaissent en bleus (DAPI).
    2. Évaluer la viabilité en comptant les cellules mortes, qui apparaissent pourpre (PI [rouge] + DAPI [bleu]) et de calculer le pourcentage de cellules mortes (dead cellules/total compté cellules x 100).
    3. Évaluer le statut d’acrosome en utilisant les patrons de coloration fluorescente (FITC – PSA). Calculer les pourcentages des différents modèles (x 100 des cellules intactes, endommagés ou réagie acrosome cellules/total compté).
       Remarque : Membrane acrosomique endommagé apparaît comme un capuchon acrosome entièrement tachée, vert ; réaction acrosomique membrane montre résiduelle vert équatoriale ou supérieure de coloration ; cellules contenant une membrane acrosomique intacte n’affichera aucune coloration verte de la région acrosomique.
    4. Évaluer les ΔΨm en distinguant les spermatozoïdes avec ΔΨm élevé, qui présentent une pièce colorées au rouge et avec ΔΨm faible, les spermatozoïdes qui présentent une coloration vert bien. Compter les rouge et vert midpieces séparément et calculer leur ratio (rouge/vert).

3. technique #2 : Évaluation des Membranes des spermatozoïdes avec les Kits prêts à l’emploi et de la cytométrie en flux

Remarque : Évaluation de l’intégrité de la membrane plasmique, intégrité acrosomique et potentiels de membrane membrane mitochondriale a été réalisée avec les kits de cytométrie en flux de prêts à l’emploi contenant des fluorochromes lyophilisées dans chaque puits. La procédure s’est déroulée selon les fabricants avec quelques modifications.

1. Évaluation de l’intégrité de la membrane plasmique
   1. Prenez le nombre désiré de puits de l’emballage du kit de viabilité et de la concentration (PI et SYbr14), de les transférer à la base de travail et les recouvrir avec un couvercle souple (protéger de la lumière).
   2. Ajouter 199 µL de solution tampon pour la cytométrie en flux / puits.
   3. Ajouter 1 µL de sperme homogène à 57 x 106/ml (57 000 cellules / puits) et homogénéiser par pipetage.
   4. Couvrir la plaque avec le couvercle noir.
   5. Incuber pendant 10 min à 37 ° C, abri de la lumière.
   6. Exécuter l’exemple à travers le cytomètre de flux avec la « viabilité » de réglage.
2. Potentiel de membrane mitochondrial
   1. Prendre le nombre désiré de puits de l’emballage du kit de l’activité mitochondriale (JC-1), de les transférer à la base de travail et les recouvrir avec un couvercle souple (protéger de la lumière).
   2. Ajouter 10 µL d’éthanol absolu / puits et Pipeter pour remettre en suspension de la poudre présente dans le puits.
   3. Ajouter 190 µL de PBS / puits et homogénéiser par pipetage.
   4. Ajouter 0.75 µL de sperme homogène à 57 x 106/ml (50 000 cellules / puits) et homogénéiser par pipetage.
   5. Couvrir la plaque avec le couvercle noir.
   6. Incuber 30 min à 37 ° C, abri de la lumière.
   7. Exécuter l’exemple à travers le cytomètre de flux avec l’activité d’établissement de ʽmitochondrial'.
3. Intégrité de la membrane acrosomique
   Remarque : FITC – PSA coloration (voir Technique #1) permet l’évaluation des 3 catégories de l’acrosome (acrosome intact, acrosome réagie et acrosome endommagé). Utilisant le cytomètre en flux et la viabilité & la trousse d’intégrité acrosome (PI et FITC – ANP), les spermatozoïdes sont séparés dans ces 3 catégories.
   1. Prenez le nombre désiré de puits de l’emballage du kit intégrité viabilité & acrosome, transférer à la base de travail et les recouvrir avec un couvercle souple (protéger de la lumière).
   2. Ajouter 200 µL de solution tampon pour la cytométrie en flux / puits.
   3. Ajouter 0,7 µL de sperme homogène à 57 x 106/ml (40 000 cellules / puits) et homogénéiser par pipetage.
   4. Couvrir la plaque avec le couvercle noir.
   5. Incuber pendant 45 min à 37 ° C, abri de la lumière.
   6. Exécuter l’exemple à travers le cytomètre de flux avec le paramètre ʽInCyte'.
   7. Analyser l’histogramme résultant en bloquant les trois zones de marqueur selon l’intensité de la fluorescence, soit négligeables, faible fluorescence des cellules avec acrosome intact, sans coloration (R1), faible fluorescence cellules avec résiduel teinté partie de l’acrosome (R2) et cellules hautement fluorescentes avec acrosome perturbé (R3).
      Remarque : Utilisez la section « analyse des fichiers acquis à l’aide d’autres modules » dans le guide utilisateur de l’instrument afin de créer les trois régions (R1, R2, R3).

4. technique #3 : Évaluation des Membranes des spermatozoïdes à l’aide de sondes fluorescentes et cytométrie en flux

Remarque : Utilisation de l’annexine V combiné avec permet de fluorochromes PI évaluant l’apoptose et de calculer la proportion de spermatozoïdes apoptotiques (index apoptotique).

1. Préparer 1 x annexine tampon de liaison V de 20 x solution mère (dilué 500 µL de tampon de liaison V 20 x solution-mère dont 9,5 mL d’eau distillée stérile d’annexine).
2. Estimer le nombre de spermatozoïdes à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer tel que décrit dans la section 1.7.
3. Lavez 10⁶ spermatozoïdes dans 1 mL de 1 x annexine V fixation tampon et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
4. Aspirer le surnageant complètement.
5. Resuspendre le culot dans 100 µL de 1 x annexine tampon de liaison V.
6. Ajouter 10 µL de l’annexin V conjugué à l’ITCF.
7. Bien mélanger et laisser incuber pendant 15 min à l’obscurité à température ambiante.
8. Laver les spermatozoïdes en ajoutant 1 mL de 1 x annexin V fixation tampon par 10⁶ cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
9. Aspirer le surnageant complètement.
10. Resuspendre le culot dans 500 µL de 1 x annexin V fixation tampon par 10⁶ cellules total.
11. Ajouter 1 µg/mL PI immédiatement avant l’analyse avec un cytomètre en flux.
12. Exécuter l’exemple à travers le cytomètre situé sur ʽInCyte'.

Résultats

Figure 1 montre fluorimétrique simultanée évaluation des membranes des spermatozoïdes (plasma, acrosome et mitochondrial) à l’aide de PI, DAPI, FITC-PSA et JC-1. Évaluation des membranes des spermatozoïdes à l’aide de coloration simultanée avec quatre sondes fluorescentes permet, par exemple, évaluer la proportion de spermatozoïdes dans chaque catégorie — vivre vs morts ; élevé par rapport à faible ΔΨm ; intact v...

Discussion

Fertilisation de sperme potentielle dépend de multiples facteurs reflétant sa qualité. Une forte concentration de spermatozoïdes et une forte proportion des spermatozoïdes très progressivement pourraient considérer sperme de haute qualité. Néanmoins, une telle évaluation ne prend pas en compte autres paramètres cellulaires et fonctionnelles. L’utilisation de « table » microcapillaire cytomètre de flux peut être facilement adaptée à l’évaluation des différentes structures de sperme à l’aide de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]	Sigma	M1254
PBS	Sigma	P5493
DMSO	Sigma	D2438
Ethanol absolute	Sigma	64-17-5
Hemacytometer	Neubauer Germany		hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542	fluorescent probe
PI (propidium iodide )	Sigma	P4170	fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )	Sigma	L0770	fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)	ENZOBiochem, New York, NY, USA	ENZ52304	fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC	MACS, Miltenyi Biotec	130-093-060	fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20x stock solution	MACS, Miltenyi Biotec	130-092-820	buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u	Nikon, Tokyo, Japan		inverted fluorescence microscope
Nis Elements	Nikon, Tokyo, Japan		software
Nikon DXM1200F	Nikon, Tokyo, Japan		digital camera
Guava EasyCyte Plus	IMV Technologies, L'Aigle, France		microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft	Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies		software
Buffered solution for cytometry	IMV Technologies, L'Aigle, France	023862	buffer
Viability and concentration kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	024708	kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	024864	kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	025293	kit for acrosome integrity assessment
JMP-13	SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA		software
Bovine sperm	"SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel