Fluorimétrica técnicas para a avaliação das membranas de esperma

Resumo

Aqui, apresentamos metodologias para avaliar a integridade de membrana spermatozoan, uma celular característica associada com a competência de fertilização do espermatozoide. Nós descrevemos três técnicas para a avaliação de fluorimétrica de membranas de esperma: coloração simultânea com sondas fluorescentes específicas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma. Também são apresentados exemplos de combinar as metodologias.

Resumo

Spermiograms padrão, descrevendo a qualidade do esperma baseiam-se principalmente os parâmetros fisiológicos e visuais, tais como o volume de ejaculação e concentração, motilidade e motilidade progressiva e morfologia do esperma e viabilidade. No entanto, nenhuma destas avaliações é bom o suficiente para prever a qualidade do sêmen. Dado que a manutenção da viabilidade do esperma e fertilização potencial depende da integridade de membrana e funcionalidade intracelular, avaliação desses parâmetros poderá permitir uma melhor previsão de competência de fertilização do espermatozoide. Aqui, descrevemos três métodos viáveis para avaliar a qualidade do esperma utilizando sondas fluorescentes específicas, combinadas com análises de citometria de fluxo ou microscopia de fluorescência. Análises avaliaram integridade de membrana plasmática usando 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e iodeto de propidium (PI), integridade da membrana acrossomal usando conjugada com isotiocianato de fluoresceína aglutininas Pisum sativum (FITC-PSA) e integridade de membrana mitocondrial usando 5, 5', 6, 6-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodeto (JC-1). Combinações destes métodos também são apresentadas. Por exemplo, uso de anexina V combinado com ativa de fluorochromes PI avaliar apoptose e calcular a proporção de espermatozoides apoptotic (índice apoptótico). Acreditamos que essas metodologias, que são baseadas em examinar as membranas do espermatozoide, são muito úteis para a avaliação da qualidade do esperma.

Introdução

Integridade e funcionalidade de membranas de esperma são alguns dos fatores indicando a viabilidade do esperma e fertilização potencial. A membrana plasmática funciona como uma barreira entre os compartimentos intracelulares e extracelulares, mantendo assim o equilíbrio osmótico celular¹. Qualquer estresse que induz os danos para a integridade da membrana plasmática pode prejudicar a homeostase, reduzir a capacidade de viabilidade e fertilização e aumentar a morte celular. Por exemplo, criopreservação reduz viabilidade de esperma devido a danos a sua membrana plasmática, como resultado de mudanças de temperatura e estresse osmótico². Informamos anteriormente que expondo o esperma de touro a baixas concentrações de contaminantes de origem alimentar como o pesticida atrazine, diaminochlorotriazine seu metabolito principal ou a aflatoxina micotoxina B1, reduz a viabilidade de esperma^1,3 . Isso foi determinado pela rotulagem o DNA de cadeia dupla com DAPI em combinação com PI, que se liga ao DNA de células com uma membrana plasmática danificada.

Reacção acrossómica (AR) envolve a fusão da membrana externa do acrossoma e membrana plasmática sobrejacente, resultando na liberação de enzimas acrossomal^4,5. Estes são eventos essenciais para a penetração da zona pelúcida e ainda mais a fusão do espermatozoide com o oócito⁶. Portanto, a avaliação da integridade da membrana acrossomal constitui um parâmetro útil para avaliar a qualidade do sêmen e a fertilidade masculina^7,8,9. Várias técnicas fluorescentes são adequadas para a verificação de integridade do acrossoma, FITC-PNA ou FITC-PSA^8,10. Em nossos estudos anteriores, usando os padrões de FITC-PSA coloração^1,3, desde as definições precisas para (i) acrossoma intacta, (ii) danificado da membrana do acrossoma e (iii) reagiu acrossoma. No relatório atual, podemos avaliar o status de acrossoma usando citometria de fluxo de esperma-dedicado e comparar os resultados com aqueles usando microscopia de fluorescência.

As mitocôndrias são organelas multifuncionais envolvido em, entre outras coisas, ATP síntese, produção de espécies reactivas de oxigénio, sinalização de cálcio e apoptose. Disfunções fisiológicas, incluindo a infertilidade masculina e feminina, estão associadas com alteração da função mitocondrial¹¹. Mitocôndrias de esperma são arranjadas na peça intermediária e desempenham um papel crucial no esperma motilidade¹². É bem aceite que o elevado potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) está associado a motilidade normal e alta fertilização capacidade¹³. Em contraste, ΔΨm baixo está associado um nível elevado de espécies reativas de oxigênio e reduzida taxa de fertilização¹⁴. Não obstante, vários compostos ambientais, por exemplo, desreguladores endócrinos, podem induzir estresse celular e levar a um aumento transiente da hiperpolarização^1,3, ΔΨm, aumento da produção de radicais livres e, eventualmente, apoptose,¹⁵. A sonda fluorescente 5, 5', 6, 6-tetra-chloro-1, 1', 3, 3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodeto (JC-1) permite por exemplo, examinando os efeitos de toxinas de origem alimentar no esperma ΔΨm^1,3.

Spermiograms padrão, com base nos parâmetros fisiológicos e morfológicos, não são bons o suficiente para prever a qualidade do sêmen. Métodos mais precisos são necessários para assegurar a qualidade do esperma. Aqui, nós fornecemos dois métodos viáveis para determinar a qualidade do esperma com base em avaliações de membranas de esperma: coloração quádruplo simultânea com sondas fluorescentes específicas e microscopia de fluorescência, descrito em nossos estudos^1,3 e citometria de fluxo avançado dedicada ao esperma, recentemente utilizado em nosso laboratório e já está sendo usado por outros^16,17,18.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações de 1994 israelense para o bem-estar animal. Esperma de bovina foi fornecida pela empresa israelense comercial para inseminação artificial e reprodução. Ejacula de 11 touros foram avaliadas neste estudo.

1. preparação da amostra esperma

Nota: O procedimento baseia-se protocolo^{1,3 no laboratório Roth}.

1. Obter cerca de 1 – 6 mL de sêmen de touro em um tubo de 15 mL à temperatura ambiente.
2. Para cada 1 mL de sémen, adicionar 6 mL de tampão NKM escaldada (a 37 ° C) (110 mM de NaCl, 5 mM KCl, MOPS 20 mM [ácido 3-N-morphilino; pH 7,4]) e centrifugar para 8 min a 600 x g, 1-2 vezes até que o sobrenadante é claro.
   Nota: Se a concentração de espermatozoides ou o volume inicial é muito elevado, dividida em dois tubos na lavagem de primeira.
3. Imediatamente remover e descartar o sobrenadante claro e deixar cerca de 1 cm do líquido sobrenadante acima a pelota.
4. Inclinar-se cuidadosamente os tubos em um ângulo de 30° para aumentar a área de superfície para que o esperma nadar e esperar 20 a 30 min para permitir que os espermatozoides a nadar até a 37 ° C.
   Nota: Turbidez pode ser vista.
5. Utilizando uma micropipeta cuidadosamente, remova o superior 1 mL do sobrenadante contendo os espermatozoides móveis para um novo tubo de 1,5 mL.
6. Manter o esperma a 37 ° C até o uso.
7. Estime a contagem de esperma, usando um hemocytometer de Neubauer.
   Nota: Uma câmara de contagem diferente pode ser usada em vez disso, mas a contagem é diferente.
   1. Para evitar o movimento do espermatozoide, diluir 100 µ l dos espermatozoides móveis com 10 mL de água bidestilada (DDW) (diluição de 1: 100) em um tubo de 15 mL e misture delicadamente.
   2. Carrega 10 µ l da amostra em cada lado da hemocytometer e da lamela. Certifique-se de evitar formação de bolhas no interior da câmara, pois isto pode resultar em uma contagem de esperma imprecisas.
   3. Observe ao microscópio composto com um objetivo X 20.
      Nota: A grade completa em um hemocytometer contém 9 quadrados grandes, cada 1mm², e a lamela repousa 0,1 mm acima do piso da câmara. Assim, o volume sobre a área central de contagem é de 0,1 mm³ ou 0,1 µ l. A área central do hemocytometer contém 25 quadrados médios e cada quadrado médio possui 16 quadrados menores com linhas simples.
   4. Conte o número total de células encontradas em 4 quadrados de canto médio e da praça central. Para maior precisão, contar duas câmaras (ambos os lados do hemocytometer de Neubauer) e usar a média para calcular a concentração de células.
   5. Calcule a contagem de esperma, multiplicando o número médio obtido por 5 (para obter o número de células por área de contagem), por 10.000 (para obter o número de células por 1 mL da amostra diluída). Então, multiplique a contagem obtida pelo factor de diluição (1: 100).
      Nota: Por exemplo, um número médio de espermatozoides contados em 5 dos 25 quadrados médios dentro da área central de contagem de duas câmaras é 150 ([152 + 148] / 2). Assim, o número médio de espermatozoides por câmara (ou 0,1 µ l) é 150 x 5 = 750. Multiplica 750 por 10.000 para obter o número de células por 1 mL da amostra diluída (7.500.000) e então multiplicar por 100 (fator de diluição), para obter 75 x 10⁷ células por mL de amostra de sêmen original.

2. técnica #1: Avaliação simultânea das membranas de esperma usando vários fluorescente sondas

Nota: Membranas de esperma (plasma, acrossomal e mitocondrial) foram avaliadas conforme descrito por Celeghini et al.¹⁰, com algumas modificações. Utilizou-se microscopia epifluorescente, combinado com uma câmera digital com excitação em 450-490 nm e emissão a 515-565 nm, usando um filtro triplo.

1. Prepare soluções estoque.
   1. Prepare a 0,1 mg/mL solução stock de DAPI dissolvendo-se 5 mg de DAPI em 50 mL de soro de tampão fosfato (PBS). Preparar 50 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C. Antes de usar, dilua a solução estoque com PBS em 01:10 (solução de trabalho; 10 µ g/mL).
   2. Prepare-se 1 mg/mL solução FITC-PSA dissolvendo-se 1 mg de FITC-PSA em 1 mL de PBS. Preparar 50 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C. Antes de usar, dilua a solução estoque com PBS em 01:10 (solução de trabalho; 100 µ g/mL).
   3. Prepare o JC-1 de 1 mg/mL de solução dissolvendo-se 1 mg de JC-1 em 1 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO). Prepare-se 10 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C. Antes de usar, dilua a solução estoque com DMSO às 01:10 (solução de trabalho; 0,1 mg/mL).
   4. Prepare a solução-mãe PI dissolvendo-se 10 mg de PI em 400 µ l de PBS (dando 2,5 mg/mL). Loja em + 4 ° C. Dilua 1 de estoque com PBS em 01:20 (solução de trabalho; 0,125 mg/mL). Armazenar a + 4 ° C como uma solução.
      Atenção: O PI é um potencial mutagênico e deve ser manuseado com cuidado. O corante deve ser feito de forma segura e em conformidade com os regulamentos locais aplicáveis.
2. Transferi µ l 133 dos espermatozoides móveis (passo 1.5) para um novo tubo de 1,5 mL (25 x 10⁶ espermatozoides/mL).
   Nota: Se a concentração da amostra é maior, diluí-lo no buffer NKM para obter a concentração necessária; se a concentração da amostra de natação da amostra é menor, centrifugar o sobrenadante obtido após nadar até a 1.000 x g por 5 min, retire a 0,5 mL do sobrenadante e contar o esperma novamente.
3. Adicionar 17 µ l de DAPI (solução de trabalho) e incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
4. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
5. Ao pellet, adicione 100 µ l de tampão NKM.
6. Adicionar 50 µ l de FITC-PSA, 2 µ l de JC-1 e 3 µ l de PI (soluções de trabalho) e incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
7. Centrifugar a 1.000 x g por 5 min e retirar o sobrenadante.
8. Ao pellet, adicionar 40 µ l de tampão NKM e ressuspender pipetando.
9. Transferi 10 µ l da amostra para uma lâmina de vidro, esfregaço e lamela.
10. Visualizar imediatamente por microscopia de epifluorescência (uso 40 x objetivo) com um filtro triplo, equipado com uma câmera digital e capturar uma imagem separada para cada filtro.
    Nota: Não há nenhum significado na ordem dos filtros visualizado.
    1. Visualizar sob canal DAPI com excitação em 358 nm e emissão na 461 nm.
    2. Visualize sob canal FITC para monômeros verdes com excitação em 450-490 nm e emissão a 515 – 565 nm.
    3. Visualizar sob canal de PI para agregados vermelhos com excitação em 488 nm e emissão a 590 nm.
    4. Visualizar com JC-1 vermelhos agregados com excitação em 559 nm e emissão na faixa de 574-627 nm; JC-1 verdes monômeros com excitação em 488 nm e emissão na faixa de 500-535 nm.
11. Mescle as três imagens que recebeu os filtros em formato JPG/JPEG, usando a opção "Mesclar" do software da câmera.
12. Abra a imagem mesclada com a ferramenta "Paint" e usar a opção de escova para marcar a contagem de espermatozoides.
13. Classifica o espermatozoide baseada a fluorescência emitida por cada sonda:
    1. Em geral, avaliar pelo menos 200 espermatozoides por slide — todas as células aparecem azuis (DAPI).
    2. Avaliar a viabilidade pela contagem de células mortas, que aparecem roxo (PI [vermelho] + [azul] DAPI) e calcular a percentagem de células mortas (células morta/total contado células x 100).
    3. Avalie o status de acrossoma usando os padrões de coloração fluorescente (FITC-PSA). Calcule as porcentagens dos diferentes padrões (acrossoma intacto, danificados ou reagiram células/total contado células x 100).
       Nota: Membrana acrossomal danificada aparece como um tampão de acrossoma totalmente manchadas, verde; membrana acrossomal reagiram mostra residual verde equatorial ou superior mancha; células contendo membrana acrossomal intacta não exibirá qualquer coloração verde da região acrossomal.
    4. Avalie ΔΨm distinguindo espermatozoides com alta ΔΨm, que exibem uma peça intermediária manchados de vermelho e espermatozoides com baixa ΔΨm, que exibem uma peça intermediária manchado de verde. Conta vermelha e verde midpieces separadamente e calcular sua relação (vermelho/verde).

3. técnica #2: Avaliação das membranas de esperma com Kits prontos para uso e citometria de fluxo

Nota: Avaliação de integridade de membrana plasmática, integridade de membrana acrossomal e potencial de membrana mitocondrial foi feita com kits de citometria de fluxo de ready-to-use contendo liofilizados fluorochromes em cada poço. O procedimento foi realizado de acordo com os fabricantes, com algumas modificações.

1. Avaliação de integridade de membrana plasmática
   1. Pegue o número desejado de poços da embalagem do kit de viabilidade e concentração (PI e SYbr14), transferi-los para a base de trabalho e cubra com uma tampa flexível (proteger da luz).
   2. Adicione 199 µ l de solução tamponada para citometria por bem.
   3. Adicionar 1 µ l de sêmen homogênea em 57 x 10⁶/mL (57.000 células por poço) e homogeneizar por pipetagem.
   4. Cubra o prato com a tampa preta.
   5. Incube durante 10 minutos a 37 ° C, protegido da luz.
   6. Execute a amostra através do citômetro de fluxo com a viabilidade' configuração'.
2. Potencial de membrana mitocondrial
   1. Pegue o número desejado de poços da embalagem do kit atividade mitocondrial (JC-1), transferi-los para a base de trabalho e cubra com uma tampa flexível (proteger da luz).
   2. Adicionar 10 µ l de etanol absoluto por alvéolo e pipetar para Ressuspender o pó presente dentro do poço.
   3. Adicione 190 µ l de PBS por alvéolo e homogeneizar por pipetagem.
   4. Adicione 0,75 µ l de sêmen homogênea em 57 x 10⁶/mL (50.000 células por poço) e homogeneizar por pipetagem.
   5. Cubra o prato com a tampa preta.
   6. Incube durante 30 min a 37 ° C, protegido da luz.
   7. Executar a amostra através do citômetro de fluxo com a atividade de ʽmitochondrial de configuração '.
3. Integridade da membrana acrossomal
   Nota: FITC-PSA coloração (veja técnica #1) permite a avaliação de 3 categorias de acrossoma (acrossoma intacta, acrossoma reagiram e acrossoma danificada). Usando o citômetro de fluxo e kit de integridade do acrossoma (PI e FITC-PNA) e viabilidade, os espermatozoides são separados nestas 3 categorias.
   1. Pegue o número desejado de poços da embalagem do kit de integridade de viabilidade & acrossoma, transferi-los para a base de trabalho e cubra com uma tampa flexível (proteger da luz).
   2. Adicione 200 µ l de solução tamponada para citometria por bem.
   3. Adicionar 0,7 µ l de sêmen homogênea em 57 x 10⁶/mL (40.000 células por poço) e homogeneizar por pipetagem.
   4. Cubra o prato com a tampa preta.
   5. Incube durante 45 min a 37 ° C, protegido da luz.
   6. Executar a amostra através do citômetro de fluxo com o ʽInCyte de configuração '.
   7. Analisar o histograma resultante por retenção de três áreas de marcador de acordo com a intensidade da fluorescência, que representa células insignificantes, baixo fluoresce com acrossoma intacta, Imaculada (R1), baixa fluoresce células com residual manchado parte do acrossoma (R2) e células altamente fluorescentes com acrossoma interrompida (R3).
      Nota: Use a seção "Analisando arquivos adquiridos usando outros módulos" no guia do usuário do instrumento a fim de criar as três regiões (R1, R2, R3).

4. técnica #3: Avaliação das membranas do espermatozoide utilizando sondas fluorescentes e citometria de fluxo

Nota: Uso da anexina V combinado com ativa de fluorochromes PI avaliar apoptose e calcular a proporção de espermatozoides apoptotic (índice apoptótico).

1. Prepare 1 x anexina tampão de ligação V de 20 x solução estoque (diluir 500 µ l de tampão de ligação V 20 x solução estoque com 9,5 mL de água destilada estéril de anexina).
2. Estime a contagem de esperma, usando um hemocytometer Neubauer, conforme descrito na seção 1.7.
3. Lave 10⁶ espermatozoides em 1 mL de 1x anexina V ligação buffer e centrifugar 300 x g por 10 min.
4. Aspire o sobrenadante completamente.
5. Resuspenda o pellet em 100 µ l de 1x anexina tampão de ligação V.
6. Adicione 10 µ l da anexina V, conjugado com FITC.
7. Misture bem e incube por 15 min no escuro à temperatura ambiente.
8. Lave os espermatozoides, adicionando 1 mL de 1 x anexina V ligação buffer por 10⁶ células e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos.
9. Aspire o sobrenadante completamente.
10. Ressuspender as células em 500 µ l de 1 x anexina V ligação buffer por 10⁶ células total.
11. Adicione 1 µ g/mL PI imediatamente antes da análise com um citômetro de fluxo.
12. Executar a amostra através do citômetro de fluxo definido na ʽInCyte'.

Resultados

A Figura 1 mostra simultânea fluorimétrica avaliação das membranas de esperma (plasma, acrossomal e mitocondrial) usando PI, DAPI, FITC-PSA e JC-1. Avaliação das membranas de esperma usando coloração simultânea com quatro sondas fluorescentes, por exemplo, permite avaliar a proporção de espermatozoides em cada categoria — live vs mortos; alta vs baixa ΔΨm; intacta vs. danificado o acrossoma — simultaneamente para ca...

Discussão

Fecundação do esperma potencial depende de múltiplos fatores, refletindo sua qualidade. Uma alta concentração de espermatozoides e uma elevada proporção de espermatozoides móveis altamente progressivamente podem ser considerados o sêmen de alta qualidade. No entanto, essa avaliação não leva em conta outros parâmetros celulares e funcionais. O uso de 'bancada' conta citômetro de fluxo pode ser facilmente adaptado para avaliação de várias estruturas de esperma utilizando sondas fluorescentes, como mostrado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
MOPS [3-N-morphilino propanesulfonic acid]	Sigma	M1254
PBS	Sigma	P5493
DMSO	Sigma	D2438
Ethanol absolute	Sigma	64-17-5
Hemacytometer	Neubauer Germany		hemocytometer
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Sigma	D9542	fluorescent probe
PI (propidium iodide )	Sigma	P4170	fluorescent probe
FITC-PSA (fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin )	Sigma	L0770	fluorescent probe
JC-1 (5,5',6,6'-tetra-chloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide)	ENZOBiochem, New York, NY, USA	ENZ52304	fluorescent probe
Annexin V conjugated to FITC	MACS, Miltenyi Biotec	130-093-060	fluorescent probe
Annexin V binding buffer 20x stock solution	MACS, Miltenyi Biotec	130-092-820	buffer
Nikon Eclipse, TE-2000-u	Nikon, Tokyo, Japan		inverted fluorescence microscope
Nis Elements	Nikon, Tokyo, Japan		software
Nikon DXM1200F	Nikon, Tokyo, Japan		digital camera
Guava EasyCyte Plus	IMV Technologies, L'Aigle, France		microcapillary sperm flow cytometer
CytoSoft	Guava Technologies Inc., Hayward, CA, USA; distributed by IMV Technologies		software
Buffered solution for cytometry	IMV Technologies, L'Aigle, France	023862	buffer
Viability and concentration kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	024708	kit for viability assessment
Mitochondrial activity kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	024864	kit for mitochondrial activity assessment
Viability & acrosome integrity kit	IMV Technologies, L'Aigle, France	025293	kit for acrosome integrity assessment
JMP-13	SAS Institute Inc., 2004, ary, NC, USA		software
Bovine sperm	"SION", Israeli company for artificial insemination and dreeding, Hafetz-Haim, Israel