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Resumen

Se describe un sencillo procedimiento litográfico para la inmovilización de las moléculas de ADN del gen-longitud sobre una superficie, que puede utilizarse para llevar a cabo experimentos de expresión génica sin células en biochips.

Resumen

Inmovilización de genes en superficies litográfico estructurados permite el estudio del gen compartimentado procesos de expresión en un sistema de biorreactor de microfluidos abierto. En contraste con otros enfoques hacia sistemas celulares artificiales, tal configuración permite un suministro continuo con gene expresión reactivos y drenaje simultáneo de productos de desecho. Esto facilita la implementación de procesos de expresión génica sin células durante largos períodos de tiempo, lo cual es importante para la realización de sistemas de retroalimentación reguladora de genes dinámico. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la fabricación de biochips genéticos utilizando una técnica litográfica de simple-to-use basada en reacciones de desplazamiento de hebra de ADN, que utiliza exclusivamente los componentes comercialmente disponibles. También proporcionamos un protocolo sobre la integración de genes compartimentadas con un polidimetilsiloxano (PDMS)-sistema de microfluidos. Por otra parte, nos muestran que el sistema es compatible con microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total, que puede ser utilizado para la observación directa de las interacciones moleculares entre el ADN y las moléculas contenidas en la mezcla de la expresión.

Introducción

Libre expresión génica, las reacciones son de gran interés para diversas aplicaciones en Bioquímica, biotecnología y biología sintética. Libre expresión de las proteínas fue instrumental para la preparación de las muestras de proteína pura, que fueron la base para numerosos estudios de biología estructural. Por ejemplo, sistemas libres de células fueron utilizados con éxito para la expresión de la proteína complejos1 o membrana proteínas2, que son difíciles de producir con la expresión de la célula. En particular, libre expresión génica reacciones también fueron utilizadas para dilucidar la estructura del código genético, a partir de los experimentos innovadores de Nirenberg y Matthaei en 19613.

Recientemente, ha habido un renovado interés en métodos sin células en biotecnología y biología sintética4,5,6. Sistemas libres de células pueden ser aumentados con compuestos no-biológica, y componentes de origen biológico distinto pueden combinarse más fácilmente7. A pesar de sistemas libres de células tienen la desventaja evidente que no es "crecer y dividir", es concebible para preparar Biorreactores abiertos libres de células con funciones metabólicas básicas y que sintetizan metabolitos cuando provisto de energía y carbono simple entradas8. Dentro del campo emergente de la biología sintética, sistemas libres de células prometen ser un "chasis" más predecible para la ejecución de funciones biológicas sintético.

Actualmente, las reacciones de expresión de genes sin células se llevan a cabo usando los extractos de célula (de diferentes fuentes tales como bacterias, levaduras, insectos), o sistemas de transcripción y traducción que fueron optimizados para diferentes aplicaciones (por ejemplo, procariotas vs. eucariotas la expresión génica, la producción de proteínas de membrana, etc.). Un popular protocolo para la preparación del extracto de la célula bacteriana (comúnmente llamados TXTL) fue proporcionado recientemente por V. Noireaux y compañeros de trabajo9. Sus propiedades biofísicas han sido completamente caracterizados10, y el sistema TXTL ha sido ya utilizado con éxito para llevar a cabo una serie de tareas bioquímicas complejas: por ejemplo, la Asamblea de bacteriófagos funcional a través de expresión sin células el genoma phage del11, la síntesis de proteína bacteriana filamentos12o la aplicación del gen sin células circuitos13,14.

Otro sistema popular en biología sintética libre de células es el sistema puro, que se reconstituye a partir de componentes purificados15,16. En comparación con el sistema TXTL, no contiene las nucleasas o maquinaria de degradación de proteínas. Mientras que la degradación de ADN lineal, las moléculas de ARN o proteínas es tan importante en el sistema puro, vías de decaimiento son realmente importantes para la implementación de funciones dinámicas. Para reducir el efecto de la degradación de la exonucleasa de plantillas gene lineal en el sistema TXTL (a través de RecBCD), la proteína extremo-protección de GamS debe agregar. El sistema puro y el TXTL están disponibles en el mercado.

Un tema estrechamente relacionado con preocupaciones de la biología celular gratis el estudio del efecto de la compartimentalización en reacciones bioquímicas y aún más la creación de estructuras de la célula artificiales o protocélulas17,18,19 ,20. Investigación sobre las células artificiales típicamente implica el encapsulamiento de un sistema de reacción bioquímica dentro de compartimientos vesiculares de fosfolípidos u otros Anfífilos. Mientras que estos sistemas ayudan a explorar aspectos fundamentales de la compartimentalización, o la aparición de la celularidad y estructuras auto-replicantes, afrontan los problemas típicos de los sistemas cerrados: en ausencia de un metabolismo funcional y apropiado mecanismos de transporte de membrana, es muy difícil mantener reacciones compartimentadas para largos períodos de tiempo - las moléculas del combustible se utilizan para arriba y se acumulan productos de desecho.

Una alternativa interesante a la compartimentación interior de dichos compartimientos imitan a las células es la organización espacial del material genético mediante métodos photolithographic. Inmovilización de "genes en un chip" fue promovido por el grupo Bar-Ziv en el Instituto Weizmann hace más de diez años21. Entre las principales cuestiones que tenían que resolver eran la adsorción inespecífica del ADN y la posible desnaturalización de proteínas en la superficie del chip. Bar-Ziv et al desarrolló una resistencia Fotolitografía dedicado llamado "Daisy", que se compone de un silano reactivo terminal para la inmovilización de las moléculas de resistir en las superficies de dióxido de silicio, un espaciador largo polietileno glicol (PEG) que aseguró biocompatibilidad y una headgroup photocleavable, que fue convertida en una amina reactiva a la irradiación con luz ultravioleta (UV). Se ha demostrado que la Margarita puede utilizarse para inmovilizar moléculas de la DNA del gene-longitud (con longitudes de varios kilo-pares de bases (kbp)) sobre una superficie de viruta. De un polímero física punto de vista, los sistemas representan cepillos de polímero injertados sobre un sustrato sólido. Debido a la naturaleza de polielectrolito de ADN, la conformación de estos cepillos es afectada fuertemente por efectos de iones específicos osmótico y otros22,23.

Lo más importante, se ha demostrado que genes inmovilizada de sustrato son aún funcionales y pueden ser transcrito y traducido en ARN y proteínas. Cepillos de gene son accesibles para ARN Polimerasas de solución24, y la mezcla macromolecular complejo de la transcripción y traducción no es desnaturalizada en la superficie. Una de las ventajas de la inmovilización de componentes genéticos en un sustrato es que pueden funcionar en un sistema de reactor abierto microfluídico que continuamente se suministra con moléculas pequeñas precursor y de la cuales productos de desecho puede ser eliminado25 , 26.

Recientemente hemos desarrollado una variante de este método llamado Bephore (para haz de electrones Biocompatible y fotoresistencia)27, que se basó exclusivamente en los componentes comercialmente disponibles y utilizados secuencia específica DNA filamento invasión las reacciones para la realización de un procedimiento de litografía varios pasos simples de implementar para la creación de células artificiales basadas en el chip. Un Resumen esquemático del procedimiento se muestra en la figura 1. Se basa en horquilla las moléculas de ADN que contiene un grupo photocleavable, que están inmovilizadas en una capa biocompatible de PEG. Fotorrotura de la horquilla expone una secuencia de cadena simple punto de apoyo, a través de que DNA moléculas de interés (que contiene la secuencia DIS "desplazar") pueden ser conectado vía invasión de filamento mediada por punto de apoyo.

Mientras que Bephore es potencialmente más fácil de implementar, Daisy permite la realización de muy denso y limpio "cepillos de gen", que tiene ventajas en ciertas aplicaciones. En principio, sin embargo, litografía Daisy y Bephore podría ser fácilmente combinada. Un método de litografía relacionada utilizando desplazamiento de hebra de ADN para estructurar ADN cepillos en oro fue previamente desarrollado por Huang et al., pero no fue utilizado en el contexto del gen libre expresión28,29.

En el siguiente protocolo brindamos que una descripción detallada de la producción de ADN cepillos para la expresión del gen libre utilizando el método de Bephore. Describimos cómo el gene se fabrican y demostrar el uso de multi-step foto-litografía para la inmovilización espacialmente estructurado de genes en un chip. También discutimos la fabricación de cámaras de reacción y la aplicación de la microfluídica para la realización de reacciones de expresión del gen de la en-viruta.

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Protocolo

Nota: Un calendario para las medidas en las diferentes secciones se da en la información complementaria (sección 1).

1. fabricación de microchips

Nota: como substratos obleas de silicio de uso (100 mm de diámetro, 0,525 mm de espesor) con una capa gruesa de 50 nm de dióxido de silicio o vidrio portaobjetos (24 mm x 24 mm, no. 1.5; 22 mm x 50 mm, no. 4). Dependiendo de la aplicación, otros tamaños y espesores pueden ser más convenientes.

  1. Limpieza de los sustratos a través de un RCA Limpie procedimiento (agua, solución de amoníaco NH3(aq) 30% y el peróxido de hidrógeno H2O2 30%, en una proporción 5:1:1)
    1. Mezclar solución de agua y amoniaco en un vaso de vaso de precipitados y calentar la mezcla a 70 ° C en una placa caliente removiendo.
    2. Añadir el peróxido de hidrógeno y el sustrato. Para un mayor rendimiento, coloque varios sustratos (especialmente el pequeño portaobjetos) en un porta de politetrafluoroetileno (PTFE).
    3. Después de 30 minutos, sacar el sustrato, enjuague bien con agua de una botella de lavado y secar con una pistola de nitrógeno. Inmediatamente proceder con la pegilación del sustrato.
      PRECAUCIÓN: Use protección ocular y piel y trabajar en una campana de humos. No cierre el recipiente herméticamente para permitir la liberación de gas de la mezcla.
  2. Pegilación del sustrato
    Nota: La repetida congelación y descongelación de la acción de la biotina-PEG-silano reducen la reactividad de silano debido a la condensación de la humedad del aire. Por lo tanto, preparar 5 tubos de mL con cantidades adecuadas de biotina-PEG-silano (por ejemplo 10-20 mg) y llenarlos con argón seco antes de congelar hasta su uso.
    1. Biotina-PEG-silano disolver en tolueno seco Vortex (5 mg/mL).
    2. Colocar el sustrato en un plato de petri de vidrio (diámetro de 120 cm, altura de 2 cm) en una campana de humos.
    3. Pipetear la solución (≈200 μL para un cubreobjetos de vidrio solo, unos pocos mL para una placa de silicio grandes) sobre el sustrato, cubriendo toda la superficie, pero no la solución que fluye sobre el borde del sustrato.
    4. Cerca de la caja Petri. Para reducir la sequedad del sustrato, agregar una adicional cubierta con una toalla de papel húmeda.
    5. Después de 30 min, agregar aproximadamente 40 ml de alcohol isopropílico, luego sacar el sustrato, otra vez enjuague con alcohol isopropílico y secar con una pistola de nitrógeno (para laminas de vidrio, recuerda el lado pegilado). Almacenar el sustrato en la oscuridad hasta su uso.
      PRECAUCIÓN: Use protección ocular y piel y trabajar en una campana de humos.

2. preparación de Genes para la inmovilización

Nota: Las secuencias de la cartilla, modificaciones del ADN y un protocolo PCR ejemplar figuran en la información complementaria (secciones 2-4).

  1. Usar primers modificados para amplificar el gen de interés por reacción en cadena de polimerasa (PCR). Una cartilla lleva un fluoróforo para visualización en microscopía de fluorescencia, y la otra cartilla está separada de la secuencia DIS por un separador de glicol trietileno para mantener la secuencia DIS sola fila a lo largo de la polimerización en cadena.
  2. Purificar el ADN utilizando un kit de purificación de la columna de vuelta y medir su concentración mediante un fotómetro de absorción. La concentración no debe ser mucho menor que 100 nM.
  3. Ajustar la concentración de NaCl 1 m, utilizando una solución concentrada de NaCl de 5 M. La alta concentración de sal facilita el ADN cepillo conjunto proceso22.

3. Fotolitografía

Nota: Photocleavable ADN (PC) debe manipularse en un entorno de luz amarillo. Papel amarillo para salas limpias puede utilizarse para filtrar la luz de lámparas de luz blancas convencionales.

  1. Preparación del sustrato
    1. Preparar la mezcla Bephore (1 μm estreptavidina, 1,5 μm PC ADN, μm 7,5 PH ADN en 1 x PBS (tampón fosfato salino)) y la estabilización de la mezcla (10 μm sin etiqueta DIS ADN, 1 mg/mL BSA (albúmina de suero bovino), en PBS 1 x). Ambos se pueden almacenar en la oscuridad en la nevera durante varias semanas.
    2. Corte el sustrato en trozos más pequeños (unos pocos cm2) utilizando un cortador de vidrio o rompiendo una oblea de silicio a lo largo de una línea de cristal presionando sobre un borde con un bisturí. Como una marca de alineación simple, crear un rasguño corto desde el centro hacia el borde del sustrato usando el cortador de vidrio. Partículas pequeñas de blow off el chip con una pistola de nitrógeno.
    3. Mezclar dos gotas de pegamento de silicona de dos componentes, mezclando por ejemplo con una punta de pipeta y aplique el pegamento a la superficie del chip, dejando en blanco el área alrededor de la punta de la raya (Figura 2A). La cola proporciona una barrera hidrofóbica que facilita pasos de lavado y reduce la cantidad de ADN necesaria para incubaciones. En un paso posterior, el pegamento puede ser fácilmente despegado.
    4. Incubar 10 μl (o tanto como necesario para cubrir el chip) de la mezcla de Bephore a temperatura ambiente (RT) en el chip. Durante la incubación, lugar el chip en una caja, por ejemplo, una caja de punta de pipeta parcialmente lleno de agua para reducir la evaporación.
    5. Después de 1 h, lavar el chip varias veces (5 x con 50 μL) mediante pipeteo con 1 x PBS para quitar desatado Bephore-mix.
    6. Sacar tanta amortiguación como sea posible sin secar el chip e incubar 10 μl de la mezcla de pasivación en el chip a TA.
    7. Después de 2 horas, lave el chip varias veces (10 x con 50 μL) mediante pipeteo con 1 x PBS para quitar a agentes de estabilización independiente.
  2. Litografía de proyección
    Nota: Para litografía, puede usarse un microscopio vertical con un 60 x objetivo de inmersión de agua. Tiempos de iluminación dependen del objetivo, la fuente de luz, la máscara, el substrato (diapositiva de chip o vidrio de silicio) y la DNA deseada densidad superficial. Con el objetivo 60 x, tiempos de exposición típicos variaron desde abajo un minuto por una litografía de dos etapas con la superposición de regiones (15 s para chips de silicio, 45 s para laminas de vidrio) a 2-3 minutos para una exposición completa. No utilice un cubreobjetos (excepto cuarzo) en la parte superior del sustrato, ya que bloquea la luz UV.
    1. Cortar un photomask impresa (véase archivo complementario con máscaras de litografía ejemplar y complementaria sección 5) a un tamaño apropiado para caber un soporte adecuado de la máscara, que puede ser insertado en la posición de la parada de campo (figura 2B). Para litografía precisa de varios paso, alinear la máscara con las marcas de alineación en la titular.
    2. El sustrato en un portaobjetos de microscopía y muévala a la platina del microscopio. Para patrones de diapositivas de vidrio Bephore, inserte papel negro (e.g. repuesto hoja de patrones impresos) entre microscopia diapositiva y diapositiva de Bephore para proporcionar un fondo oscuro para litografía.
    3. Inserte un filtro rojo en el camino de la iluminación, enfoque hacia la superficie del sustrato y navegar a la región del sustrato, que se expondrá, por ejemplo, la región en el extremo de la raya.
    4. Inserte el soporte de máscara, bloquean la iluminación y cambiar el filtro de UV (figura 2). A una baja intensidad de luz, abra el obturador y utilice la cámara para enfocar rápidamente la máscara en el substrato.
    5. Bloquear la trayectoria de la luz a la cámara e iluminar el sustrato a una alta intensidad de luz para el tiempo de exposición deseado.
    6. Tomar la muestra del microscopio y retire con cuidado tanto buffer como sea posible del substrato sin secarlo.
    7. Añadir 10-20 μl del ADN con la DIS secuencia de. Colocar el sustrato en una caja de mojado para evitar sequedad. Incubar el ADN en el substrato para 2 h (oligonucleótidos a concentración micromolar) o varias horas/noche (kbp largo DNA en aproximadamente 100 concentración nM) a TA.
    8. Extraer el ADN del chip y lávelo varias veces con PBS 1 x. Con el fin de reducir la pérdida de ADN (especialmente para los fragmentos más largos), almacenar el ADN tomado del substrato y reutilizarla.
  3. Litografía de paso múltiples
    Nota: Para una alineación precisa de dos o más exposiciones en una sola área, mantenga la muestra en el escenario para evitar la desalineación angular. Asegúrese de que el chip no secan. Para la colocación de varios cepillos de ADN en las diferentes regiones en un sustrato, use una etapa motorizada a unidad de área designada o un substrato con marcas de alineación adecuada.
    1. Después de la primera exposición (sección 3.2), incubar el ADN con la DIS-secuencia de en el sustrato. Es importante que estén ocupados todos los sitios de Unión resultante de la primera exposición. Por lo tanto, incubar oligonucleótidos (10 μm) durante aproximadamente 3 horas a TA.
    2. Para inmovilizar dis-etiquetados genes, los coloca en el substrato durante varias horas o toda la noche a temperatura ambiente, lavar la muestra y agregar la mezcla de pasivación por otro 2 h en RT. proceder con la siguiente exposición.
    3. Para exposiciones adicionales, repita los pasos anteriores (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS dispositivos

Nota: Preferiblemente, trabajar en una sala limpia. La fabricación de un dispositivo PDMS sigue un protocolo estándar como descrito por McDonald et al. 30

  1. Fabricación de moldes maestros mediante Fotolitografía
    1. Limpie una oblea de silicio (76,2 mm de diámetro, 525 μm de grosor) por sonicación en acetona durante 5 minutos a alta potencia y enjuague con alcohol isopropílico y agua desionizada. Luego colocar la oblea en un plato caliente a 150 ° C durante 15 minutos.
    2. Opcionalmente, con el fin de mejorar la adherencia de resistir a la oblea, añadir promotor de adhesión 2-3 mL y centrifugado a 3000 rpm por 30 s. calor la oblea a 120 ° C por 2 min.
    3. Añadir sobre la fotoresistencia de 2-3 mL (véase Tabla de materiales). Girar la oblea por 15 s en 500 rpm y a 3000 rpm por 30 s. Esto debe resultar en una capa gruesa de 20 μm de photoresist. Deje que la capa de photoresist descansar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
    4. Para la pre-exposición cuece al horno, colocar la oblea en un plato caliente a 50 ° C por 2 min, luego a 85 ° C durante 5 minutos.
    5. Colocar la oblea en el photomask con el modelo de los compartimientos. Preferentemente, use un alineador de la máscara. El photomask debe tener una resolución de dpi 64.000 (véase archivo complementario con máscaras de litografía y complementario artículo 5).
    6. Exponga la oblea durante 1 minuto con la luz UV (-línea 5-10 mW/cm2) a través de la fotomáscara.
    7. Para la post-exposición cuece al horno, colocar la oblea a 50 ° C por 2 min y luego a 85 ° C durante 5 minutos. Deje que la oblea refrescarse y relajarse durante 1 h a temperatura ambiente.
    8. Colocar la oblea en un plato con el revelador durante 3 minutos mientras se agita suavemente el vaso. Enjuague la oblea con alcohol isopropílico y secar con una pistola de nitrógeno. Colocar la oblea en un plato caliente a 130 ° C por 45 min.
  2. Preparación del dispositivo PDMS
    1. Base de mezcla de PDMS y PDMS curado a agente en una relación 10:1 y vierta en la oblea en un envase cerrado hasta una capa de aproximadamente 5 mm ha formado encima de la oblea. Para obtener un dispositivo PDMS de sólo 1 mm de espesor, en lugar de otro spin capa la oblea con PDMS en 100 rpm por 2 min.
    2. Coloque el recipiente en un desecador y aplicar un vacío (de 85 kPa) para 30 minutos. Luego, calentar el PDMS a unos 70° C durante 1-2 h en un horno.
    3. Separar el dispositivo PDMS de la oblea. Cortar el PDMS en losas para que cada pieza contiene un conjunto de compartimentos. En el caso de los PDMS se conectará a una configuración de microfluidos, taladro (1 mm de diámetro) como entrada y salida en los extremos del canal de alimentación.
    4. Limpie el PDMS con alcohol isopropílico y agua desionizada y seque con una pistola de nitrógeno. Almacenar el PDMS-libre de polvo.

5. expresión del gen compartimentado

Nota: El siguiente procedimiento describe el montaje de un sostenedor de la muestra (figura 3) para la observación de la expresión génica compartimentado en un microscopio invertido con una incubadora de jaula para control de temperatura. El titular fue construido con materiales fácilmente disponibles y herramientas (3.5-5 mm espesor Policloruro de vinilo (PVC) plásticos, tornillos y tuercas, taladro) y puede ser modificado para requisitos particulares para adaptarse a diferentes tipos de microscopios. Los pasos descritos en 5.1 y 5.2 deben realizarse tal que ambas partes del titular están listos al mismo tiempo.

  1. Conjunto de soporte inferior
    1. Preparar un chip de Bephore con la marca de alineación (por ejemplo, un rasguño) y pegar sobre el soporte del chip con cinta adhesiva de doble cara (figura 3B). El chip debe ser mayor que el dispositivo PDMS que lo cubrirá.
    2. Inmovilizar uno o varios genes en el chip (ver apartados 2 y 3).
    3. Añadir alguna grasa para vacío alrededor del agujero central del soporte inferior, y luego en el soporte del chip.
      Nota: El soporte del chip ahora se adhiere al soporte inferior por medio de la grasa, conservando la posibilidad de reubicación de la viruta en el plano x-y.
  2. Soporte superior
    1. Preparar una viruta fina de PDMS con compartimentos mediante el procedimiento de recubrimiento de vuelta en el paso 4.2.1. Corte el PDMS tan pequeño como sea posible, dejando un canal abierto a un lado para permitir el intercambio de residuos y precursor de moléculas por difusión.
    2. Limpiar un cubreobjetos de vidrio (24 mm x 24 mm, no. 1.5) y la parte trasera de la viruta PDMS (lado sin compartimentos) con plasma de oxígeno para 42 s (funcionado a 200 W y 0,8 mbar con la muestra en una jaula de Faraday).
    3. Coloque el chip PDMS en el centro de la diapositiva de cristal con los compartimientos hacia arriba. Hornear el vidrio con el PDMS por 1 h a 70 ° C.
    4. Añadir alguna grasa para vacío alrededor del gran agujero superior del titular de la.
    5. Antes de comenzar el experimento, limpie el portaobjetos de cristal y el PDMS chip con plasma de oxígeno para 42 s para representar el PDMS hidrofílico.
    6. Coloque el portaobjetos de vidrio con PDMS en el soporte superior ( figura 3) y presione suavemente el vaso en la grasa (figura 3).
  3. Conjunto de soporte
    1. Preparar 100 μl de un sistema de expresión libre y mantenerlo en hielo.
    2. Retirar el tampón desde el chip cuidadosamente y lavar una vez con 10 μl de sistema de la libre expresión. A continuación, añadir 60 μL de sistema de la libre expresión en el chip y quitar el pegamento de silicona de dos componentes de los bordes del chip (ya retirado en la figura 3B).
    3. Añadir 20 μl del sistema de expresión en el PDMS. Después de poner la gota en el PDMS, comprobar rápidamente en el microscopio estereoscópico que los compartimientos están bien mojados y sin burbujas de aire. Si hay burbujas de aire, intente lavar con el resto del sistema de libre expresión.
    4. Para montar las dos piezas del titular y para alinear cámaras y cepillos de ADN, trabajar bajo un microscopio estereoscópico e inmovilizar el soporte inferior con un brazo de agarre, así que los dos tornillos y tuercas de mariposa son fácilmente accesibles con ambas manos (figura 3D-F ).
    5. Inserte el soporte superior en el soporte inferior y baje hasta que las gotitas de sistema de la libre expresión del fusible (figura 3D). Comprobar a través del microscopio estereoscópico si los compartimientos y la marca de alineación en una región similar en el plano x-y, en caso contrario levantar el soporte superior y re-posición el cristal se deslice en el soporte superior.
    6. Desde abajo, tornillo hasta las tuercas de mariposa hasta que toquen la parte inferior del soporte. Apriete con cuidado las tuercas de mariposa, mientras que alinea los compartimientos y el chip en el plano x-y a través de la manija en la parte inferior del soporte del chip (figura 3E). Una vez en contacto, apriete las tuercas de mariposa sólo muy ligeramente (figura 3F).
      Nota: Este paso requiere algo de experiencia y depende de la disposición experimental. Bajo el microscopio, patrones de interferencia derivada de líquido entre PDMS y vidrio pueden indicar que la fuerza aplicada es demasiado pequeña, mientras que una menor intensidad de fluorescencia (de un cepillo de ADN o proteínas expresadas) en el centro de un consejos de compartimiento en un muy alto presión (ver también sección 6 información adicional).
    7. Rocíe la esponja en el recinto de la evaporación del agua e Inserte el soporte en la caja. Llene una jeringa de 5 mL con pegamento de silicona de dos componentes y usarlo para sellar la caja (figura 3).
    8. Transferir la caja a un microscopio con control de temperatura y de la imagen del cepillo de la DNA y la reacción en la microscopia de fluorescencia. Incluso sin luz, la fluorescencia de la escobilla de ADN se desvanece en un sistema de libre expresión. Sin embargo, el pincel conserva su actividad, como puede ser demostrado por los genes repetidos del mismo cepillo.
      Nota: Cuando se utiliza un portaobjeto de Bephore en lugar de un chip de silicio, la posición (superior/inferior) de la viruta PDMS y Bephore se puede intercambiar, lo que permite el uso de objetivos con distancias de trabajo más pequeñas.

6. constante expresión en dispositivos microfluídicos

Nota: La instalación experimental está montada de las piezas mostradas en la Figura 4A. Detalles en el conjunto de la etapa de control de temperatura se dan en la información complementaria (sección 7).

  1. Tubería y sistema de la libre expresión
    1. Preparar el sistema de la libre expresión en un tubo de muestra (200 μL). Granos del poliestireno marcados con colorantes fluorescentes pueden agregarse a más adelante monitor el flujo a través de un canal de alimentación.
    2. Conectar el tubo a un controlador de presión. Coloque el tubo en un depósito de hielo grandes que mantiene frío durante 12 horas aproximadamente. Llenar con hielo si es necesario.
      Nota: Como alternativa a un controlador de presión, una bomba proporciona un caudal constante de sistema de la libre expresión aunque los cambios de resistencia de flujo, por ejemplo, debido a las burbujas de aire, que podría a largo plazo experimentos.
    3. Conecte el tubo que contiene el sistema de libre expresión para PTFE tubo (diámetro interno de 0,8 mm), que llega a la etapa de calefacción. Una aguja de jeringa (de 0,9 mm de diámetro) se romperá en pedazos de 1-2 cm con los extremos romos e insertar una pieza en el tubo de PTFE. Más tarde servirá como conector a los PDMS. Tratar de minimizar la longitud de la tubería entre el escenario y el tubo (figura 4).
    4. Para enfriar el tubo de PTFE, envuélvalo alrededor de tubo de goma más grande que está conectado a un reservorio de agua con hielo y una bomba peristáltica. Pegarlas con cinta adhesiva (figura 4).
  2. Soporte superior
    1. Limpiar el lado plano de la viruta PDMS con plasma de oxígeno (42 s) y colóquelo en un portaobjetos de microscopía con agujeros de montaje de entrada y salida de PDMS (Figura 4B). Los agujeros en el cristal pueden taladrarse previamente con un vaso en la cabeza de perforación. Asegúrese de que las cámaras de micro no enfrentan el portaobjetos de cristal.
    2. Aplique cinta adhesiva de doble cara a la parte plana del soporte del PDMS. Pegue un pedazo de papel negro (por ejemplo, de una máscara de litografía) en la región entre los dos orificios del soporte para evitar la fluorescencia del fondo de la cinta adhesiva.
    3. Pegar el portaobjetos de cristal con el chip PDMS al titular.
    4. Tratar la PDMS y el titular PDMS con el vidrio Unido Deslice con plasma de oxígeno en un plasma limpiador (42 s).
    5. Aplique grasa de vacío alrededor del gran agujero en el soporte superior e inserte el soporte PDMS (Figura 4B). El titular PDMS se adhiere ahora en el soporte superior, conservando la posibilidad de reubicación en las direcciones x-y.
    6. Conecte la manguera de PTFE con el conector de aguja de la jeringa a la entrada de la viruta PDMS. Para facilitar el acceso a los PDMS a través del soporte superior, la placa superior plástica puede quitarse brevemente para este y el siguiente paso.
    7. Insertar una segunda pieza de PTFE tubos (unos 5 cm) con un conector de aguja de la jeringa en la salida (figura 4).
    8. Coloque el soporte PDMS en el soporte superior por lo que es libre de moverse en todas direcciones. El soporte superior sin apretar sobre la platina calefactada como en figura 4E sin apretar cualquier wingnuts.
    9. Con el microscopio, desplácese a la posición de los compartimientos de PDMS y centro en el campo de visión. No pasar la etapa de este punto.
    10. Retire el soporte superior con la PDMS de la etapa.
  3. Calefactada y portaobjetos de vidrio Bephore
    1. Ajuste la temperatura de la platina calefactada a 37 ° C
    2. Pegar una diapositiva de cristal Bephore (núm. 4) con las escobillas de gene a la etapa de control de temperatura del microscopio de fluorescencia invertido utilizando cinta adhesiva de doble cara, con la marca de alineación aproximadamente en el centro del campo visual del microscopio. Este posicionamiento de la marca de alineación asegura que los compartimientos se reducirá aproximadamente a la misma región.
    3. Tomar una imagen en el canal correspondiente de la fluorescencia de la escobilla de gene y marque su posición en la imagen de la cámara.
    4. Quitar el tampón del cepillo gene, pero no lo dejes andar seco. Añadir 20 μl del sistema celular - libertad de expresión para el cepillo de gene y utilice unas pinzas para extraer el marco de pegamento de silicona.
  4. Montaje de la instalación de la microfluídica
    1. Añadir presión al tubo de muestra hasta que el sistema de la libre expresión ha llenado el tubo de PTFE y aparece en la parte inferior del dispositivo PDMS. Además, Pipetear 10 μl de sistema de la libre expresión en las cámaras de micro en el PDMS. Asegúrese de que los compartimientos son libres de burbujas de aire.
    2. Cuidadosamente baje el soporte superior en el portaobjetos de cristal y alinear las cámaras de micro con el cepillo de gene. Antes de PDMS y alineación de la marca alcancen un mismo plano focal, utilice los tornillos pequeños en la parte posterior del soporte PDMS para alinear exactamente la posición x-y y la orientación del dispositivo PDMS con el cepillo de gen (figura 4E).
    3. Mantener la posición y presione el PDMS en el portaobjetos de cristal apretando las tuercas de mariposa a lo largo de los tornillos que conectan el soporte superior a la platina del microscopio (figura 4E).
    4. Aumentar la presión en el tubo que contiene el sistema de la libre expresión y el monitor el flujo de los granos fluorescentes a través del canal de alimentación (flujo se recomiendan tasas de entre 0.5 a 5 μl por hora) (figura 4F). Si es necesario, aumentar la presión de los PDMS en el cristal apretando las tuercas de mariposa.

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Resultados

Litografía de dos etapas: la figura 5 muestra el resultado de un proceso de dos pasos litográficos en un portaobjetos de vidrio con la superposición de patrones de fluorescencia etiquetada DIS hilos.

Expresión de una proteína fluorescente de un cepillo de gene: figura 6 demuestra la expresión de la proteína fluorescente YPet de DNA inmovilizado. En varios puntos ...

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Discusión

Bephore litografía es una técnica robusta y versátil para el modelado inmovilización de ADN o ARN. Sin embargo, el procedimiento incluye varios pasos, que - si - pueden ser una fuente de fracaso o menor rendimiento del sistema.

Un paso crucial en la fabricación de chips de Bephore es la pegilación del sustrato, que proporciona la biocompatibilidad de la superficie. Aquí, el paso de limpieza con un procedimiento RCA es importante, ya que también activa la superficie para la silanizació...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses que compiten.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo financiero para este proyecto por la Volkswagen Stiftung (grant no. 89 883) y el Consejo Europeo de investigación (beca Convenio Nº 694410 - AEDNA). M.S.-S. agradece apoyo por el DFG a través de GRK 2062.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)Siegert WaferThickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold)Siegert WaferThickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4Menzel22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5Assistent24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-SilaneLaysan BioMW 5,000
Anhydrous tolueneSigma Aldrich (Merck)244511
StreptavidinThermo-Fisher ScientificS888
DNAIntegrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531SPCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System PromegaA9281Spin-column PCR clean-up kit
PURExpressNew England BiolabsE6800SCell-free expression system
PDMS Dow CorningSlygard 184
FluoSpheresThermo-Fisher ScientificF8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)BolaS 1810-10
EpoCore 20micro resist technology GmbHPhotoresist
mr-Dev 600micro resist technology GmbHPhotoresist developer
Ti-PrimeMicroChemicalsAdhesion promoter
Two-component silicon gluePicodentTwinsil 
UV-protection yellow foilLithoprotect (via MicroChemicals)Y520E212
Equipment
Masks for photolithographyZitzmann GmbH64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscopeOlympusBX51Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objectiveOlympusLumPlanFlUsed with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objectiveOlympusLumPlanFlUsed with Olympus BX51, NA 0.5
CameraPhotometricsCoolsnap HQUsed with Olympus BX51
Ligtht sourceEXFOX-Cite 120QUsed with Olympus BX51
Inverted microscopeNikonTi2-EFluorescence imaging of gene expression
4x objectiveNikonCFI P-Apo 4x LambdaUsed with Nikon Ti2-E
CameraAndorNeo5.5Used with Nikon Ti2-E
Light sourceLumencorSOLA SM IIUsed with Nikon Ti2-E
Cage incubatorOkolabbold lineUsed with Nikon Ti2-E
Pressure ControllerElveflowOB1 MK3
NanoPhotometerImplenDNA concentration measurement
Plasma cleanerDienerFemto200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

Referencias

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