Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Resumo

Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.

Resumo

Imobilização de genes em superfícies Litograficamente estruturadas permite o estudo do gene compartimentada processos de expressão em um sistema do biorreator microfluidic aberto. Em contraste com outras abordagens para sistemas celulares artificiais, tal uma configuração permite um fornecimento contínuo com reagentes de expressão de gene e drenagem simultânea de produtos residuais. Isto facilita a implementação de processos de expressão do gene sem célula durante longos períodos de tempo, o que é importante para a realização de sistemas de feedback reguladoras do gene dinâmico. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a fabricação de biochips genéticas usando uma simples de usar litográfica técnica baseada em reações de deslocamento do DNA strand, que usa exclusivamente componentes disponíveis comercialmente. Também oferecemos um protocolo sobre a integração dos genes compartimentadas com um polydimethylsiloxane (PDMS)-microfluidic sistema baseado. Além disso, mostramos que o sistema é compatível com microscopia de fluorescência (TIRF) reflexão interna total, que pode ser usada para a observação direta de interações moleculares entre o DNA e as moléculas contidas na mistura, a expressão.

Introdução

Célula-liberdade de expressão de gene reações são de grande interesse para várias aplicações de biotecnologia, bioquímica e biologia sintética. Célula-livre expressão de proteínas foi fundamental para a preparação de amostras de proteína pura, que serviram de base para inúmeros estudos em biologia estrutural. Por exemplo, sistemas de célula livre foram usados com sucesso para a expressão da proteína complexos¹ ou membrana proteínas², que são difíceis de produzir usando a expressão baseada em célula. Notavelmente, célula livre expressão gênica reações também foram utilizadas para elucidar a estrutura do código genético, começando com os inovadoras experimentos por Nirenberg e Matthaei em 1961³.

Recentemente, tem havido um interesse renovado em métodos sem célula em biotecnologia e biologia sintética^4,5,6. Sistemas sem célula podem ser aumentados com compostos não-biológico, e componentes de origem biológica diversa podem ser combinadas mais facilmente⁷. Apesar de sistemas sem célula têm a desvantagem aparente que eles não fazem "crescer e se dividir", é concebível para preparar aberto sem célula biorreatores com funções metabólicas básicas e deixá-los a sintetizar metabólitos quando fornecido com energia e carbono simples entradas⁸. Dentro o campo emergente da biologia sintética, sistemas sem célula prometem ser um "chassis" mais previsível para a implementação de funções biológicas sintéticas.

Atualmente, as reações de expressão do gene sem célula são realizadas utilizando célula extrai (a partir de diferentes fontes tais como bactérias, leveduras, insetos), ou sistemas de transcrição e tradução que foram otimizados para diferentes aplicações (por exemplo, procariotas vs eucariotas expressão gênica, produção de proteínas de membrana, etc.). Um protocolo popular para a preparação do extrato de célula bacteriana (comumente denominado TXTL) foi fornecido recentemente por V. Noireaux e colegas de trabalho⁹. Suas propriedades biofísicas tem sido completamente caracterizadas¹⁰, e o sistema TXTL foi já utilizado com sucesso para realizar uma série de tarefas bioquímicas complexas: por exemplo, o assembly de bacteriófagos funcional através de célula-livre expressão do genoma do fago¹¹, a síntese de proteínas bacterianas filamentos¹²ou a implementação de circuitos de gene sem célula^13,14.

Popular em biologia sintética sem célula outro sistema é o sistema puro, que é reconstituído a partir de componentes purificados^15,16. Em comparação com o sistema TXTL, ele não contém nucleases ou máquinas de degradação de proteínas. Enquanto a degradação do DNA linear, moléculas de RNA ou proteínas é menos de um problema do puro sistema, caminhos de decaimento são realmente importantes para a implementação de funções dinâmicas. Para reduzir o efeito de degradação do exonuclease de modelos lineares gene no sistema TXTL (por RecBCD), a proteína de GamS extremidade-proteger tem a ser adicionado. Tanto o TXTL e o sistema puro estão comercialmente disponíveis.

Um tema intimamente relacionado às preocupações de biologia celular-free o estudo do efeito da compartimentalização em reações bioquímicas e ainda mais a criação de estruturas artificiais célula ou protocélulas^{17,18,19 ,20}. Pesquisa sobre células artificiais normalmente envolve o encapsulamento de um sistema de reação bioquímica dentro de compartimentos vesiculares de fosfolipídios ou outros amphiphiles. Enquanto tais sistemas ajudam a explorar os aspectos fundamentais da compartimentalização, ou o surgimento de celularidade e estruturas auto-replicante, que enfrentam os problemas típicos de sistemas fechados: na ausência de um metabolismo funcional e apropriado mecanismos de transporte de membrana, é difícil manter reações compartimentadas correndo por longos períodos de tempo - usadas de moléculas de combustível e produtos de resíduos se acumulam.

Uma alternativa interessante para compartimentalização dentro desses compartimentos celulares-imitando é a organização espacial do material genético usando métodos fotolitográfica. Imobilização de "genes em um chip" foi pioneira pelo grupo no Instituto Weizmann de Bar-Ziv há mais de dez anos²¹. Entre as principais questões que precisavam ser resolvidos foram a adsorção não específica de DNA e a potencial desnaturação das proteínas na superfície do chip. Bar-Ziv et al desenvolveram um resist fotolitografia dedicado denominado "Daisy", que era composto de um silano reativo terminal para a imobilização das moléculas sobre superfícies de dióxido de silício, resiste um espaçador de longa polietileno glicol (PEG) que assegurou biocompatibilidade e uma headgroup photocleavable, que foi convertido em uma amina reativa após irradiação com luz ultravioleta (UV). Ficou demonstrado que a Daisy pode ser usado para imobilizar a moléculas de DNA do gene-comprimento (com comprimentos de vários quilo-pares de bases (kbp)) sobre uma superfície de chip. Polímero física ponto de vista, os sistemas representaram escovas de polímero enxertadas em um substrato sólido. Devido à natureza do polyelectrolyte do DNA, a conformação dessas escovas é fortemente afetada pela osmótica e outros efeitos íon-específicos de^22,23.

O mais importante, ficou demonstrado que genes de substrato-imobilizado são ainda funcionais e podem ser transcrita e traduzida para o RNA e proteína. Escovas do gene são acessíveis para ARN-polimerase de solução²⁴, e a mistura complexa macromolecular da transcrição/tradução não é desnaturada na superfície. Uma das vantagens da imobilização dos componentes genéticos sobre um substrato é que podem ser operados em um sistema de reator aberto microfluidic continuamente fornecido com moléculas precursoras pequenas e de produtos que resíduos podem ser removidos^{25 , 26}.

Recentemente desenvolvemos uma variante desse método denominado Bephore (para o feixe de elétrons biocompatível e fotorresiste)²⁷, que foi baseado exclusivamente em componentes disponíveis comercialmente e utilizadas sequência-DNA strand invasão a reacções específicas para a realização de um procedimento simples para implementar várias etapas litografia para a criação de células artificiais baseada no chip. Uma visão esquemática do processo é mostrada na Figura 1. É baseado no gancho de cabelo as moléculas de DNA que contém um grupo de photocleavable, que são imobilizadas em uma camada de PEG biocompatível. Photocleavage do gancho de cabelo apresenta uma sequência de single-stranded ponto de apoio, através do qual DNA moléculas de interesse (que contém a sequência DIS "uma substituição") podem ser anexado através de invasão de vertente mediada por ponto de apoio.

Enquanto Bephore é potencialmente mais simples de implementar, Daisy permite a realização de muito denso e limpo "gene" pincéis, que tem vantagens em certas aplicações. Em princípio, no entanto, litografia de Daisy e Bephore poderia ser facilmente combinada. Um método de litografia relacionada utilizando escovas de deslocamento de strand DNA para estruturação do DNA em ouro foi desenvolvido anteriormente por Huang et al, mas não foi utilizado no contexto da expressão de gene sem célula^28,29.

O protocolo seguinte nós fornecemos que uma descrição detalhada da produção de DNA brushes para expressão do gene sem célula usando o método Bephore. Descrevemos como os chips de gene são fabricados e demonstram o uso de foto-litografia de várias etapa para a imobilização espacialmente estruturada dos genes em um chip. Discutimos também a fabricação de câmaras de reação e a aplicação de microfluídica para o desempenho das reações de expressão do gene em-microplaqueta.

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Protocolo

Nota: Um calendário para as etapas nas seções diferentes consta a informação suplementar (seção 1).

1. fabricação do chip

Nota: como substratos, wafers de silício de uso (diâmetro de 100 mm, espessura de 0,525 mm) com 50 nm espessa camada de dióxido de silício ou lâminas de vidro (24 mm x 24, n. º 1.5; 22 mm x 50 mm, n º 4). Dependendo da aplicação, outros tamanhos e espessuras podem ser mais apropriadas.

1. Limpeza a substratos através de uma RCA limpe procedimento (água, solução de amoníaco NH₃(aq) 30% e peróxido de hidrogênio H₂O₂ 30%, na proporção de 5:1:1)
   1. Misturar a solução de água e amoníaco em um copo de béquer e aquecer a mistura a 70 ° C, um prato quente, agitando.
   2. Adicione o peróxido de hidrogênio e o substrato. Para maior rendimento, coloque vários substratos (especialmente as lâminas de vidro pequeno) em um suporte de politetrafluoretileno (PTFE).
   3. Após 30 min, retire o substrato, enxaguar abundantemente com água de lavagem de garrafa e seque-o com uma arma de nitrogênio. Imediatamente prosseguir com a PEGylation do substrato.
      Cuidado: Use proteção para os olhos e a pele e trabalhar em uma coifa. Não feche o recipiente de resíduos a fim de permitir a liberação do gás da mistura.
2. PEGylation do substrato
   Nota: Repetidos congelamentos e descongelamentos da unidade populacional de biotina-PEG-silano reduz a reatividade do silano devido à condensação da umidade do ar. Portanto, prepare-se 5 mL-os tubos com quantidades adequadas de biotina-PEG-silano (por exemplo, 10-20 mg) e enchê-los com argônio seco antes de congelá-los até o uso.
   1. Dissolva a biotina-PEG-silano em tolueno seco vortexing (5 mg/mL).
   2. Coloque o substrato em um prato de petri de vidro (120 cm de diâmetro, 2 cm de altura) em uma coifa.
   3. Adicionar a solução (µ l de ≈200 para uma lamela de vidro único, alguns mL para uma bolacha de silicone grande) sobre o substrato, cobrindo toda a superfície, mas evitar a solução fluindo ao longo da borda do substrato.
   4. Feche a caixa de Petri. Para reduzir a secagem do substrato, adicione uma cobertura adicional com uma toalha de papel molhada.
   5. Após 30 min, adicionar aproximadamente 40 ml de álcool isopropílico, em seguida, retire o substrato, enxágue-o novamente com álcool isopropílico e seque-o com uma arma de nitrogênio (para lâminas de vidro, lembre-se do lado de peguilado). Armazene o substrato no escuro até o uso.
      Cuidado: Use proteção para os olhos e a pele e trabalhar em uma coifa.

2. preparação de Genes para a imobilização

Nota: Primer sequências, modificações de DNA e um protocolo PCR exemplar constam as informações complementares (seções 2-4).

1. Use primers modificados para amplificar o gene de interesse pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma primeira demão carrega um fluoróforo para visualização em microscopia de fluorescência, e o outro primer é separado da sequência de DIS por um espaçador de glicol do triethylene a fim de manter a sequência DIS single-stranded durante a PCR.
2. Purificar o DNA usando um kit de purificação de coluna de rotação e medir sua concentração usando um fotómetro de absorção. A concentração não deve ser muito menor do que 100 nM.
3. Ajuste a concentração de NaCl a 1 M, usando uma solução concentrada de NaCl 5 M. A alta concentração de sal facilita o DNA escova montagem processo²².

3. fotolitos

Nota: O photocleavable de DNA (PC) deve ser manuseado somente em um ambiente de amarelo-luz. Amarela folha para salas limpas pode ser usada para filtrar a luz de lâmpadas de luz brancas convencionais.

1. Preparação do substrato
   1. Preparar a mistura de Bephore (1 µM estreptavidina, DNA de PC 1,5 µM, 7,5 µM PH DNA em 1X PBS (tampão fosfato salino)) e a passivação misturar (10 µM unlabeled DIS DNA, BSA (albumina de soro bovino), de 1 mg/mL de 1X PBS). Ambos podem ser armazenados no escuro na geladeira por várias semanas.
   2. Corte a carcaça em pedaços menores (alguns cm²) usando um cortador de vidro ou por quebrar uma bolacha de silicone ao longo de uma linha de cristal pressionando sobre um canto com um bisturi. Como uma marca de alinhamento simples, crie um pequeno arranhão do centro para uma aresta do substrato usando o cortador de vidro. Pequenas partículas de golpe fora o chip com uma arma de nitrogênio.
   3. Misture duas gotas de cola de silicone do dois-componente, por exemplo, com uma ponta da pipeta, mexendo e aplique a cola na superfície do chip, deixando a área ao redor da ponta da risque em branco (Figura 2A). A cola fornece uma barreira hidrofóbica que facilita as etapas de lavagem e reduz a quantidade de DNA necessária para a incubação do. Em uma etapa posterior, a cola pode ser facilmente removida.
   4. Incube 10 µ l (ou quanto for necessário para cobrir o chip) da Bephore-mistura à temperatura ambiente (RT) no chip. Durante a incubação, o chip em uma caixa, por exemplo, uma caixa de ponta da pipeta parcialmente cheio de água para reduzir a evaporação.
   5. Depois de 1 h, lave o chip várias vezes (5 x com 50 µ l) pipetando com PBS 1x para remover sem uma ligação Bephore-mix.
   6. Tire reserva tanto quanto possível sem o chip de secagem e incube 10 µ l de mistura de passivação do chip no RT
   7. Após 2 h, lave o chip várias vezes (10 x com 50 µ l) pipetando com PBS 1x remover agentes de passivação não acoplado.
2. Litografia de projeção
   Nota: Para litografia, um microscópio vertical com um 60 x objetivo de imersão de água pode ser usado. Tempos de iluminação dependem do objetivo, a fonte de luz, a máscara, densidade de superfície do substrato (slide vidro ou chip de silício) e o DNA desejado. Com um objetivo 60 x, tempos de exposição típica variaram menos de um minuto para uma litografia de duas etapas com sobreposição de regiões (15 s para chips de silício, 45 s para lâminas de vidro)-2-3 min para uma exposição completa. Não utilize uma lamela (exceto quartzo fundido) em cima do substrato, uma vez que bloqueia a luz UV.
   1. Cortar uma impressa Fotomáscara (ver arquivo complementar com máscaras de litografia exemplar e complementar seção 5) para um tamanho adequado para caber um suporte adequado da máscara, que pode ser inserido na posição da parada de campo (Figura 2B). Para litografia precisa de várias etapa, alinhe a máscara com marcas de alinhamento sobre o titular.
   2. Coloque o substrato em uma lâmina de microscopia e movê-lo para o palco do microscópio. Para padronização de lâminas de vidro de Bephore, inserir folha preta (por exemplo, reposição da folha de máscaras as impressas) entre a lâmina de microscopia e Bephore slide para fornecer um fundo escuro para litografia.
   3. Inserir um filtro vermelho o caminho da iluminação, foco sobre a superfície do substrato e navegue até a região do substrato, que será exposto, por exemplo, a região na ponta da risque.
   4. Insira o suporte de máscara, bloquear a iluminação e mudar para o filtro UV (Figura 2). Em uma baixa intensidade de luz, abrir o obturador e usar a câmera para foco rapidamente a máscara sobre o substrato.
   5. Bloquear o caminho de luz para a câmera e iluminar o substrato em uma alta intensidade de luz para o tempo de exposição desejada.
   6. Tomar a amostra do microscópio e remova cuidadosamente tanto buffer possível do substrato sem secá-lo.
   7. Adicione 10 a 20 µ l de DNA com dis sequência de. Coloque o substrato em uma caixa molhada para mantê-lo de secagem. Incubar o DNA no substrato para 2h (oligonucleotides numa concentração micromolar) ou diversas horas/pernoite (kbp-long DNA na concentração de aproximadamente 100 nM) na RT
   8. Retire o chip do DNA e lavá-lo várias vezes com PBS 1x. Para reduzir o desperdício de DNA (especialmente para fragmentos mais longos), armazenar o DNA retirado do substrato e reutilizá-lo.
3. Litografia de várias etapa
   Nota: Para um alinhamento preciso de dois ou mais exposições em uma única área, manter a amostra no palco para evitar desalinhamento angular. Certifique-se que o chip não secar. Para o posicionamento de vários pincéis de DNA nas diferentes regiões em um substrato, use um palco motorizado para dirigir para a área designada ou usar um substrato com marcas de alinhamento apropriado.
   1. Após a primeira exposição (seção 3.2), incube DNA com dis-sequência de no substrato. É importante que todos os sites de ligação resultantes da primeira exposição estão ocupados. Portanto, incubar oligonucleotides (10 µM) para aproximadamente 3 h no RT
   2. Para imobilizar os genes dis-etiquetados, colocá-los no substrato durante várias horas ou pernoite no RT, então lavar a amostra e adicione a mistura de passivação para outro 2h no RT. prosseguir com a próxima exposição.
   3. Para exposições adicionais, repita as etapas anteriores (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS dispositivos

Nota: De preferência, trabalha em uma sala limpa. A fabricação de um dispositivo PDMS segue um protocolo padrão, como descrito por McDonald et al . ³⁰

1. Fabricação de moldes mestre através de fotolitos
   1. Limpar um wafer de silício (76,2 mm de diâmetro, 525 µm de espessura) por sonication na acetona por 5 min em potência alta e enxaguar com álcool isopropílico e água deionizada. Depois coloque a bolacha num prato aquecido a 150 ° C por 15 min.
   2. Opcionalmente, a fim de melhorar a aderência de resistir para o wafer, adicionar promotor de adesão de 2-3 mL e girar a 3000 rpm por 30 s. calor o wafer de 120 ° C por 2 min.
   3. Adicionar cerca de 2-3 mL fotorresiste (ver Tabela de materiais). Girar a bolacha por 15 s a 500 rpm e, em seguida, a 3000 rpm por 30 s. Isto deve resultar em uma camada de espessura 20 µm de fotorresiste. Deixe a camada de fotorresiste relaxar em temperatura ambiente por 10 min.
   4. Para cozer a pré-exposição, coloque a bolacha em um prato quente a 50 ° C por 2 min, em seguida, a 85 ° C por 5 min.
   5. Coloque a bolacha sob a Fotomáscara com a planta dos compartimentos. De preferência, use uma máscara-alinhador. A Fotomáscara deve ter uma resolução de 64.000 dpi (ver arquivo complementar com máscaras de litografia e complementar seção 5).
   6. Expor a hóstia por 1 min com luz UV (-linha 5-10 mW/cm²) através da Fotomáscara.
   7. Para cozer a pós-exposição, coloque a bolacha a 50 ° C por 2 min e, em seguida, a 85 ° C por 5 min. Deixe a bolacha arrefecer e relaxar por 1h à temperatura ambiente.
   8. Coloque a bolacha em um prato com o desenvolvedor para 3 min enquanto suavemente agita o copo. Enxágue a bolacha com álcool isopropílico e seque-o com uma arma de nitrogênio. Coloque a bolacha em um prato quente a 130 ° C, durante 45 min.
2. Preparação do dispositivo PDMS
   1. Base Mix PDMS e PDMS agente em uma proporção de 10:1 e despeje sobre a bolacha em um recipiente fechado até uma camada de cerca de 5 mm formou acima a bolacha de cura. Para obter um dispositivo PDMS de apenas 1 mm de espessura, em vez disso gire o casaco a bolacha com PDMS em 100 rpm por 2 min.
   2. Coloque o recipiente num exsicador e aplicar um vácuo (cerca de 85 kPa) por cerca de 30 min. Em seguida, aqueça o PDMS para cerca de 70° C durante 1-2 h no forno.
   3. O dispositivo PDMS separe a bolacha. Corte o PDMS em lajes para que cada parte contém um conjunto de compartimentos. No caso do PDMS será conectado a uma instalação microfluídicos, buracos (1 mm de diâmetro) como uma entrada e saída nas extremidades do canal de abastecimento.
   4. Limpe o PDMS com álcool isopropílico e água deionizada e seque-o com uma arma de nitrogênio. Armazene o PDMS livre de poeira.

5. expressão do Gene compartimentada

Nota: O procedimento a seguir descreve a montagem de um porta-amostras (Figura 3) para a observação da expressão do gene compartimentada em um microscópio invertido com uma incubadora de gaiola para controle de temperatura. O titular foi construído com materiais facilmente disponíveis e ferramentas (3,5 a 5 mm espessura cloreto de polivinila (PVC) plásticos, parafusos e porcas, broca) e pode ser personalizado para diferentes tipos de microscópios. As etapas descritas em 5.1 e 5.2 devem ser realizadas tal que ambas as partes do titular estão prontas ao mesmo tempo.

1. Conjunto do suporte inferior
   1. Preparar um chip de Bephore marca de alinhamento (por exemplo, um arranhão) e cola-lo no porta chip usando fita adesiva dupla-face (Figura 3B). O chip deve ser maior do que o dispositivo PDMS que irá cobri-lo.
   2. Imobilizar um ou vários genes no chip (consulte as seções 2 e 3).
   3. Adicione algum vácuo graxa em torno do furo central do titular do fundo e, em seguida, conecte o titular do chip.
      Nota: O titular do chip agora adere ao titular do fundo por meio da graxa, mantendo a possibilidade de re-posicionamento do chip no plano x-y.
2. Conjunto de suporte superior
   1. Prepare um chip PDMS fino com compartimentos usando o procedimento de revestimento de rotação na etapa 4.2.1. Corte o PDMS tão pequena quanto possível, deixando um canal aberto para um dos lados para permitir a troca de resíduos e precursor de moléculas por difusão.
   2. Limpar uma lamela de vidro (24 mm x 24, n. º 1.5) e a parte traseira do chip PDMS (lado sem compartimentos) com plasma de oxigênio para 42 s (operado em 200 W e 0.8 mbar com a amostra em uma gaiola de Faraday).
   3. Coloque o chip PDMS no centro do slide vidro com os compartimentos do apontando para cima. Asse o vidro com o PDMS por 1h a 70 ° C.
   4. Adicione algum vácuo graxa em torno do grande furo do porta superior.
   5. Antes de iniciar o experimento, limpe a lâmina de vidro e o PDMS o chip com plasma de oxigênio para 42 s para processar o PDMS hidrofílico.
   6. Coloque a lâmina de vidro com o PDMS no suporte superior ( Figura 3) e pressione suavemente o vidro para a graxa (Figura 3).
3. Conjunto de suporte
   1. Prepare-se 100 µ l de um sistema de célula livre expressão e mantê-lo no gelo.
   2. Cuidadosamente Retire o chip de buffer e lave uma vez com 10 µ l do sistema célula livre expressão. Em seguida, Adicionar 60 µ l do sistema de expressão livre de celular para o chip e remover a cola de silicone do dois-componente das bordas do chip (já removida na Figura 3B).
   3. Adicione 20 µ l do sistema de expressão para o PDMS. Após a colocação da gota para o PDMS, verificar rapidamente no microscópio estereoscópico que os compartimentos são bem molhados e sem bolhas de ar. Se existem bolhas de ar, tente lavá-los com o resto do sistema célula livre expressão.
   4. Para montar as duas partes do titular e para alinhar as câmaras e escovas de DNA, trabalhar sob um microscópio estereoscópico e imobilizar o suporte inferior com um braço de pegador, então os dois parafusos e wingnuts são facilmente acessíveis com ambas as mãos (Figura 3D-F ).
   5. Insira o suporte superior no suporte inferior e abaixá-la até que as gotículas de sistema de expressão sem célula fusível (Figura 3D). Verifique através do microscópio estereoscópico se os compartimentos e a marca de alinhamento estão em uma região semelhante no plano x-y-, caso contrário puxar para cima o suporte superior e re-posição o vidro deslizar no porta superior.
   6. Do fundo, estragar os wingnuts até que eles toquem o lado inferior do titular. Aperte cuidadosamente os wingnuts, enquanto alinhando os compartimentos e o chip no plano x-y através da alça na parte inferior do titular do chip (Figura 3E). Uma vez em contato, apertar os wingnuts apenas muito suavemente (Figura 3F).
      Nota: Este passo requer alguma experiência e depende da instalação experimental. Sob o microscópio, padrões de interferência resultante líquido entre PDMS e vidro podem indicar que a força aplicada é muito pequena, enquanto uma menor intensidade de fluorescência (a partir de uma escova de DNA ou proteínas expressas) no centro de um dicas de compartimento em um muito alto pressão (ver também informações complementares, secção 6).
   7. Pulverizar a esponja no recinto antievaporação com água e encaixe o suporte da caixa. Encher uma seringa de 5 mL com cola de silicone do dois-componente e usá-lo para selar a caixa (Figura 3).
   8. A caixa de transferência a um microscópio com temperatura controlada e imagem a escova de DNA e a reação em microscopia de fluorescência. Mesmo sem iluminação, a fluorescência da escova DNA desvanece-se em um sistema de célula livre expressão. No entanto, a escova mantém sua atividade, como pode ser mostrado pela expressão do gene repetidas da mesma escova.
      Nota: Ao usar uma lâmina de vidro de Bephore em vez de um chip de silício, a posição (superior/inferior) do chip PDMS e Bephore pode ser trocada, permitindo o uso de objectivos com menores distâncias de trabalho.

6. sustentado expressão em dispositivos microfluídicos

Nota: A configuração experimental é montada a partir das partes indicadas na Figura 4A. Detalhes sobre a montagem do palco temperatura controlada constam as informações complementares (secção 7).

1. Tubulação e sistema de expressão livre de célula
   1. Prepare o sistema de célula livre expressão em um tubo de amostra (cerca de 200 µ l). Esferas de poliestireno rotuladas com corantes fluorescentes podem ser adicionadas ao monitor mais tarde a taxa de fluxo através de um canal de abastecimento.
   2. Ligue o tubo a um controlador de pressão. Coloca o tubo em um reservatório de gelo grande que mantém o frio por cerca de 12 horas. Reabasteça com gelo se necessário.
      Nota: Como uma alternativa para um controlador de pressão, uma bomba de seringa fornece um caudal constante de sistema célula livre expressão, mesmo se as mudanças de resistência de fluxo, por exemplo, devido a bolhas de ar, que pode ajudar com longo prazo experimentos.
   3. Ligar o tubo contendo o sistema de célula livre expressão para PTFE tubo (diâmetro interno de 0,8 mm), que chega à fase aquecida. Uma agulha de seringa (diâmetro de 0,9 mm) em pedaços de 1-2 cm, com extremidades sem corte e inserir um pedaço para o tubo de PTFE. Mais tarde servirá como conector para o PDMS. Tente minimizar o comprimento da tubulação entre o palco e o tubo (Figura 4).
   4. Para esfriar o tubo de PTFE, envolvê-la em torno do maior tubo de borracha conectado a um reservatório de água gelada e uma bomba peristáltica. Fita-los juntamente com fita adesiva (Figura 4).
2. Conjunto de suporte superior
   1. Limpe o lado liso do PDMS chip com plasma de oxigênio (42 s) e coloque-o sobre uma lâmina de microscopia com furos de montagem de entrada e saída do PDMS (Figura 4B). Os furos no vidro podem ser perfurados de antemão com um copo de cabeça de perfuração. Certifique-se de que o microcâmaras não estão enfrentando a lâmina de vidro.
   2. Aplica fita adesiva dupla-face para o lado liso do titular do PDMS. Enfie um pedaço de papel alumínio preto (por exemplo, de uma máscara de litografia) na região entre os dois furos do suporte para evitar a fluorescência de plano de fundo da fita adesiva.
   3. Enfiar a lâmina de vidro com o chip PDMS para o titular.
   4. Tratar o PDMS e o titular PDMS com o vidro anexado slide com plasma de oxigênio em um plasma líquido de limpeza (42 s).
   5. Aplique lubrificante vácuo ao redor do buraco grande no suporte superior e inserir o titular PDMS (Figura 4B). O titular PDMS agora adere ao titular do superior, mantendo a possibilidade de re-posicionamento nas direções x-y.
   6. Conecte o tubo de PTFE com o conector de agulha da seringa para a entrada do chip PDMS. Para facilitar o acesso para o PDMS pelo suporte superior, a placa de plástico superior pode ser removida brevemente para isto e o passo seguinte.
   7. Inserir um segundo pedaço de PTFE tubo (cerca de 5 cm) com um conector de agulha de seringa à saída (Figura 4).
   8. Posicione o titular PDMS no suporte superior para é livre para se mover em todas as direções. Lugar o titular superior vagamente para o palco aquecido como na Figura 4E sem apertar qualquer wingnuts.
   9. Com o microscópio, navegar para a posição dos compartimentos de PDMS e centralizá-las da câmera campo de visão. Não o palco deste ponto seguir em frente.
   10. Remova o suporte superior com o PDMS do palco.
3. Fase aquecida e lâmina de vidro de Bephore
   1. Regule a temperatura da fase aquecida a 37 ° C
   2. Cole uma lâmina de vidro de Bephore (n º 4) com as escovas do gene para a fase de temperatura controlada, o microscópio de fluorescência invertido usando fita de adesivo dupla face, com a marca de alinhamento aproximadamente no centro do campo de visão do microscópio. Este posicionamento da marca de alinhamento garante que os compartimentos serão reduzidos mais ou menos a mesma região.
   3. Criar a imagem no canal correspondente da fluorescência do pincel gene e marcar a sua posição na imagem da câmera.
   4. Remover o tampão da escova gene, mas não a deixe ir seco. Adicionar 20 µ l do sistema célula - liberdade de expressão para o pincel de gene e usar uma pinça para remover a armação de cola de silicone.
4. Montagem da instalação do microfluídicos
   1. Adicione a pressão para o tubo de amostra até o sistema de célula livre expressão encheu o tubo de PTFE e aparece na parte inferior do dispositivo PDMS. Além disso, pipete 10 µ l do sistema célula livre expressão para as microcâmaras sobre o PDMS. Certifique-se que os compartimentos estão livres de bolhas de ar.
   2. Cuidadosamente Abaixe o titular superior a lâmina de vidro e a alinhar as microcâmaras com o pincel de gene. Antes de PDMS e o alinhamento marca atingir o mesmo plano focal, use os pequenos parafusos na parte de trás do titular PDMS para alinhar precisamente a x-y-posição e orientação do dispositivo PDMS com o pincel de gene (Figura 4E).
   3. Mantenha a posição e pressione o PDMS a lâmina de vidro apertando os wingnuts junto os parafusos que conectam o titular superior à fase de microscópio (Figura 4E).
   4. Aumente a pressão no tubo contendo o sistema de célula livre expressão e monitor o fluxo dos grânulos fluorescentes através do canal de abastecimento (fluxo são recomendadas taxas entre 0,5 a 5 µ l / h) (Figura 4F). Se necessário, aumente a pressão do PDMS no vidro apertando os wingnuts.

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Resultados

Litografia de duas etapas: a Figura 5 mostra o resultado de um processo de duas etapas litográfica sobre uma lâmina de vidro com sobreposição de padrões de cordões DIS fluorescente etiquetadas.

Expressão de uma proteína fluorescente de uma escova de gene: Figura 6 demonstra a expressão da proteína fluorescente YPet de DNA imobilizado. Em vários pontos no temp...

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Discussão

Litografia de Bephore é uma técnica robusta e versátil para a imobilização padronizada de DNA ou RNA. Ainda, o procedimento inclui várias etapas, que - se alterado - podem ser uma fonte para falha ou reduzir o desempenho do sistema.

Um passo crucial na fabricação de chips de Bephore é a PEGylation do substrato, que fornece a biocompatibilidade da superfície. Aqui, a etapa de limpeza com um procedimento RCA é importante, desde que ele também ativa a superfície para a silanização ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)	Siegert Wafer		Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold)	Siegert Wafer		Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4	Menzel		22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5	Assistent		24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane	Laysan Bio		MW 5,000
Anhydrous toluene	Sigma Aldrich (Merck)	244511
Streptavidin	Thermo-Fisher Scientific	S888
DNA	Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	New England Biolabs	M0531S	PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System	Promega	A9281	Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress	New England Biolabs	E6800S	Cell-free expression system
PDMS	Dow Corning	Slygard 184
FluoSpheres	Thermo-Fisher Scientific	F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)	Bola	S 1810-10
EpoCore 20	micro resist technology GmbH		Photoresist
mr-Dev 600	micro resist technology GmbH		Photoresist developer
Ti-Prime	MicroChemicals		Adhesion promoter
Two-component silicon glue	Picodent	Twinsil
UV-protection yellow foil	Lithoprotect (via MicroChemicals)	Y520E212
Equipment
Masks for photolithography	Zitzmann GmbH		64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope	Olympus	BX51	Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective	Olympus	LumPlanFl	Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective	Olympus	LumPlanFl	Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera	Photometrics	Coolsnap HQ	Used with Olympus BX51
Ligtht source	EXFO	X-Cite 120Q	Used with Olympus BX51
Inverted microscope	Nikon	Ti2-E	Fluorescence imaging of gene expression
4x objective	Nikon	CFI P-Apo 4x Lambda	Used with Nikon Ti2-E
Camera	Andor	Neo5.5	Used with Nikon Ti2-E
Light source	Lumencor	SOLA SM II	Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator	Okolab	bold line	Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller	Elveflow	OB1 MK3
NanoPhotometer	Implen		DNA concentration measurement
Plasma cleaner	Diener	Femto	200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage