JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים הליך ליטוגרפית פשוט לאימוביליזציה של מולקולות DNA ג'ין באורך על משטח, אשר יכול לשמש כדי לבצע ניסויים ביטוי הגן ללא תא biochips.

Abstract

קיבעון של גנים על משטחים lithographically מובנה מאפשר המחקר של ג'ין ממודר ביטוי תהליכים במערכת ביוריאקטור microfluidic פתוח. בניגוד גישות אחרות כלפי מערכות סלולריות מלאכותי, כזו מלכודת מאפשר אספקה רציפה עם ריאגנטים ביטוי גנים וניקוז סימולטני של חומרי פסולת. זה מקל על ביצוע תהליכי ביטוי הגן ללא תא במשך תקופות זמן, וזה חשוב עבור מימוש מערכות משוב רגולטוריות ג'ין דינמי. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט הזיוף של biochips גנטי בטכניקה פשוטה לשימוש ליטוגרפית בהתבסס על DNA סטרנד תגובות הדחק, המשתמשת אך ורק רכיבים זמינים מסחרית. אנו מספקים גם פרוטוקול על האינטגרציה של גנים ממודר polydimethylsiloxane (PDMS)-microfluidic מערכת מבוססת. יתר על כן, אנו מראים כי המערכת הוא תואם עם מיקרוסקופ גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF), אשר יכול לשמש בהתבוננות ישירה של אינטראקציות מולקולרי בין DNA מולקולות הכלול המיקס ביטוי.

Introduction

תא-ביטוי גנים תגובות הן עניין רב ליישומים שונים, ביוכימיה, ביוטכנולוגיה, ביולוגיה סינתטית חינם. תא ללא ביטוי של חלבונים היה אינסטרומנטלי עבור הכנת דגימות חלבון טהור, אשר היו בסיס מחקרים רבים בביולוגיה מבנית. למשל, מערכות ללא תא בהצלחה שימשו עבור הביטוי של חלבון מתחמי1 או קרום חלבונים2, אשר הם קשה לייצר שימוש בביטוי מבוססת-תא. ראוי לציין, התא ללא ביטוי גנים תגובות שימשו גם להבהיר את המבנה של הקוד הגנטי, החל הניסויים פורצי דרך על-ידי נירנברג Matthaei 19613.

לאחרונה, יש כבר עניין מחודש בשיטות ללא תאים, ביוטכנולוגיה, ביולוגיה סינתטית-4,-5,-6. מערכות ללא תא ניתן בתוספת עם תרכובות הלא-ביולוגיים, רכיבים מגוונים ממקור ביולוגי ניתן לשלב בקלות רבה יותר7. אף-על-פי מערכות ללא תא יש החיסרון לכאורה הם אינם "גדלים ומתחלקים", זה מתקבל על הדעת להכין ריאקטורים ללא תא פתוח עם פונקציות בסיסיות מטבולית ולתת להם לסנתז מטבוליטים כאשר מסופק עם פחמן פשוטה ואנרגיה תשומות8. בתוך השדה המתעוררים של ביולוגיה סינתטית, מערכות ללא תא מבטיחה להיות צפוי יותר "מארז" ליישום של תפקודים ביולוגיים סינתטי.

כיום, ללא תא ג'ין ביטוי תגובות מבוצעות או באמצעות תא תמציות (ממקורות שונים כגון חיידקים, שמרים, חרקים), או מערכות תרגום/תמלול אשר היו אופטימיזציה עבור יישומים שונים (למשל, prokaryotic לעומת האיקריוטים ביטוי גנים, הפקה של חלבוני ממברנה, וכו '). פרוטוקול פופולרי עבור הכנת תמצית תא החיידק (הפטרוני TXTL) סופק לאחרונה על ידי Noireaux (פ') ועמיתים9. תכונותיו biophysical מאופיין ביסודיות10, מערכת TXTL כבר שימש בהצלחה לבצע סדרה של משימות מורכבות הביוכימי: למשל, ההרכבה של bacteriophages פונקציונלי ויה תא ללא ביטוי של הגנום phage11, הסינתזה של חלבון חיידקי חוטים12או היישום של הגן ללא תא מעגלים13,14.

מערכת אחרת מבוקש ב ביולוגיה סינתטית ללא תא היא מערכת טהור, אשר הוא מחדש של רכיבי מטוהרים15,16. בהשוואה למערכת TXTL, הוא אינו מכיל nucleases או חלבון השפלה מכונות. תוך השפלה של DNA ליניארי, מולקולות RNA או חלבונים הוא פחות בעיה במערכת טהור, מסלולים עששת חשובים למעשה עבור מימוש פונקציות דינמיות. כדי להפחית את האפקט של אקסונוקלאז השפלה של ג'ין ליניארי תבניות למערכת TXTL (דרך RecBCD), החלבון GamS הגנה על קצה צריך להתווסף. גם את TXTL וגם מערכת טהור זמינים מסחרית.

נושא קשור קשר הדוק ל ביולוגיה תא ללא דאגות המחקר של ההשפעה של מידור על תגובות ביוכימיות, נוסף על הקמת מבנים דמויי-תא מלאכותיים או protocells17,18,19 ,20. מחקר על תאים מלאכותיים כוללת בדרך כלל את ומגעים מערכת התגובה הביו בתוך תאי vesicular זני פוספוליפידים או חומרים פעילי שטח אחרים. בעוד מערכות כאלה לעזור לחקור את ההיבטים הבסיסיים של מידור, או הופעתה של cellularity ומבנים המשכפלת, הם עומדים בפני בעיות טיפוסיות של מערכות סגורות: בהיעדר של מטבוליזם של תפקוד והולמים מנגנוני הובלה ממברנה, קשה לשמור על תגובות ממודר פועל במשך פרקי זמן ארוכים - מולקולות הדלק משמשים ולצבור הפסולת.

אלטרנטיבה מעניינת מידור בתוך תאים מחקה תא כזה הוא הארגון המרחבי של חומר גנטי בשיטות photolithographic. קיבעון של "גנים על שבב" היה חלוץ על ידי קבוצת בר-זיו במכון ויצמן לפני יותר מעשר שנים21. בין הנושאים העיקריים היו צריכים להיפתר היו של ספיחה שאינם ספציפיים של ה-DNA, את פוטנציאל דנטורציה של חלבונים על פני שבב. . בר-זיו ואח פיתח להתנגד פוטוליתוגרפיה ייעודי כינה "דייזי", אשר היה מורכב silane מסוף תגובתי על הנייח של מולקולות להתנגד על משטחים צורן דו-חמצני, כרווח ארוך פוליאתילן גליקול (PEG) זה מובטח הביו, headgroup photocleavable, אשר הוסב על אמין תגובתי על הקרנה עם אור אולטרה סגול (UV). הוכח כי דייזי יכול לשמש כדי לשתק גנים באורך במולקולות דנ א (באורכים של קילו מספר בסיסי-זוגות (kbp)) על משטח השבב. פולימר פיזיקה נקודת מבט, ייצג המערכות מברשות פולימר הושתל על גבי מצע מוצק. בשל אופיו polyelectrolyte של ה-DNA, שיאשר מברשות אלה מושפע בחוזקה תופעות ספציפיות יון ואחרים22,23.

והכי חשוב, זה הוכח כי הגנים המצע. מרותק למיטה עדיין מתפקד, יכולים להיות משועתקים, תרגום לתוך RNA וחלבון. ג'ין מברשות נגישים עבור ה-RNA polymerases מ פתרון24, לא שפגע בסימני את התערובת macromolecular תרגום/תמלול על פני השטח. אחד היתרונות של קיבעון של רכיבים גנטיים על מצע הוא כי הם יכול להיות מופעל בכל מערכת הכור microfluidic פתוח ברציפות המסופק עם מולקולות קטנות קודמן ומן אילו מוצרים פסולת יכול להיות שהוסרו25 , 26.

לאחרונה פיתחנו וריאציה של שיטה זו כינה Bephore (עבור קרינה מסתיימים ו photoresist)27, אשר היה מבוסס באופן בלעדי על רכיבים זמינים מסחרית, מנוצל ספציפיים רצף DNA סטרנד הפלישה תגובות עבור מימוש הליך ליתוגרפיה שקודמים פשוטה כדי ליישם את הקמת מבוססי שבב תאים מלאכותיים. מבט סכמטי של התהליך מוצג באיור1. הוא מבוסס על מולקולות דנ א סיכת ראש המכיל קבוצת photocleavable, אשר נמצאים ותשמרו על שכבה פג מסתיימים. Photocleavage של הסיכה חושף רצף מקום אחיזה לרגל חד-גדילי, דרך איזה DNA מולקולות עניין (המכיל את רצף דיס "והותירו") יכול להיות המחוברים באמצעות גדיל בתיווך מקום אחיזה לרגל הפלישה.

בעוד Bephore הוא שעשוי להיות פשוט ליישם, דייזי מאפשר את מימוש מאוד צפוף ונקי "ג'ין מברשות", אשר יש יתרונות ביישומים מסוימים. עקרונית, עם זאת, ליתוגרפיה Bephore ודייזי יכולים לשלב בקלות. שיטת ליתוגרפיה קשורים ניצול DNA הזחה סטרנד להבניית DNA מברשות על זהב קודם לכן פותחה על ידי הואנג. et al., אך היה מנוצל לא בהקשר של הגן ללא תא ביטוי28,29.

בפרוטוקול הבא אנו מספקים שתיאור מפורט של הייצור של ה-DNA מברשות על ביטוי גנים תא ללא שימוש בשיטת Bephore. אנו מתארים כיצד האסימונים ג'ין מיוצרים, מדגימים את השימוש רב שלבי פוטוליתוגרפיה לאימוביליזציה במרחב מובנית של גנים על שבב. נדון גם הזיוף של תגובת תאי והיישום של מיקרופלואידיקה להופעה של ג'ין על שבב ביטוי תגובות.

Protocol

הערה: לוח זמנים עבור השלבים בסעיפים שונים הוא נתון המידע הנוסף (סעיף 1).

1. שבב פבריקציה נוספת

הערה: כמו מצעים, שימוש סיליקון (קוטר 100 מ מ, 0.525 מ מ עובי) עם 50 ננומטר שכבה עבה של צורן דו-חמצני או שקופיות זכוכית (24 מ מ x 24 מ מ, 1.5 מס; 22 מ מ x 50 מ מ, מס ' 4.). בהתאם ליישום, בעוביים וגדלים אחרים עשויים להיות מתאימים יותר.

  1. ניקוי של סובסטרטים דרך RCA לנקות הליך (מים, אמוניה פתרון NH3(aq) 30% ו מימן על-חמצני H2O2 30%, ביחס של 5:1:1)
    1. לערבב מים ואמוניה פתרון בכוס כוס כימית, מחממים את התערובת עד 70 מעלות צלזיוס על פלטה חמה תוך כדי ערבוב.
    2. הוסף את מימן על-חמצני, המצע. עבור תפוקה גבוהה יותר, מקום סובסטרטים מרובים (במיוחד שקופיות זכוכית קטנים) בעל טפלון (PTFE).
    3. לאחר 30 דקות, להוציא את המצע, לשטוף אותו ביסודיות עם מים מבקבוק לשטוף, לייבש אותו עם אקדח חנקן. מיד להמשיך PEGylation של המצע.
      התראה: ללבוש עור והגנה על העין ולעבוד בשכונה fume. לא תסגור את פח אשפה בחוזקה על מנת לאפשר לשחרור גז מן התערובת.
  2. PEGylation של המצע
    הערה: חוזרים ונשנים הקפאה והפשרה של המניה ביוטין-פג-Silane מפחית את תגובתיות של silane עקב התעבות של לחות אוויר. לכן, להכין 5 מ לצינורות עם כמויות מתאימות של ביוטין-פג-Silane (למשל 10-20 מ"ג) ולמלא אותם עם ארגון יבש לפני הקפאת אותם עד השימוש.
    1. להמיס ביוטין-פג-Silane טולואן יבש על ידי vortexing (5 מ"ג/מ"ל).
    2. מקם את המצע בצלוחית זכוכית (בקוטר 120 ס מ, גובה 2 ס מ) ברדס fume.
    3. Pipette הפתרון (≈200 µL עבור תגית כיסוי זכוכית בודד, כמה מ עבור רקיק סיליקון גדולים) על גבי המצע, מכסה את כל המשטח, אלא למנוע את הפתרון זורם מעל הקצה של המצע.
    4. סגור את צלחת פטרי. כדי להפחית ייבוש של המצע, להוסיף על כיסוי נוסף עם מגבת נייר רטובה.
    5. לאחר 30 דקות, הוסף כ- 40 מ ל אלכוהול איזופרופיל, ואז תוציא את המצע, לשטוף אותו שוב ביסודיות עם אלכוהול איזופרופיל, לייבש אותו עם אקדח חנקן (עבור שקופיות זכוכית, לזכור את הצד PEGylated). לאחסן את המצע בחושך עד השימוש.
      התראה: ללבוש עור והגנה על העין ולעבוד בשכונה fume.

2. הכנה של גנים הנייח

הערה: פריימר רצף, שינויים DNA, פרוטוקול ה-PCR למופת מקבלים את המידע המשלים (סעיפים 2-4).

  1. השתמש תחל ששונה כדי להגביר את הגן של עניין על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR). פריימר אחד נושא של fluorophore להמחשת במיקרוסקופ פלורסצנטיות, ומהצמיגים אחרים מופרדת מן הרצף דיס באמצעות כרווח גליקול triethylene על מנת לשמור על רצף דיס חד גדילי ברחבי ה-PCR.
  2. לטהר את הדנ א באמצעות ערכת טיהור עמודה ספין ומדידת הריכוז שלו באמצעות photometer של קליטה. הריכוז לא צריך להיות נמוך מ- 100 ננומטר.
  3. התאם את הריכוז של NaCl ל-1 מ באמצעות פתרון מרוכז של NaCl 5 מ'. ריכוז המלח גבוה מקלה על תהליך22הרכבה מברשת ה-DNA.

3. פוטוליתוגרפיה

הערה: photocleavable ה-DNA (PC) צריך להיות מטופל רק בסביבת אור צהוב. נייר כסף צהוב cleanrooms יכול לשמש כדי לסנן את האור של מנורות אור לבן רגיל.

  1. הכנת המצע
    1. להכין את Bephore-מיקס (1 מיקרומטר streptavidin, ה-DNA PC מיקרומטר 1.5, 7.5 מיקרומטר PH DNA ב- PBS 1 x (באגירה פוספט תמיסת מלח)), את פסיבציה לערבב (תווית דיס דנ א, 1 מ"ג/מ"ל BSA (אלבומין שור), ב- PBS 1 x 10 מיקרומטר). שניהם ניתן לאחסן בחושך במקרר למשך מספר שבועות.
    2. חותכים את המצע לחתיכות קטנות יותר (כמה ס מ2) באמצעות לחיתוך זכוכית או על ידי שבירת רקיק סיליקון בקו קריסטל על ידי לחיצה על קצה עם אזמל. כסימון יישור פשוטה, ליצור שריטה קצר מהמרכז לכיוון קצה של המצע באמצעות את חותך זכוכית. חלקיקים קטנים המכה הנחה את השבב עם אקדח חנקן.
    3. לערבב שתי טיפות של דבק סיליקון שני, לדבר על זה למשל עם טיפ פיפטה, ולהחיל את הדבק אל פני השטח של השבב, עזיבת האזור שמסביב לקצה השריטה ריק (איור 2 א). הדבק מספק מחסום הידרופובי מקלה על שלבי הכביסה, מפחיתה את כמות הדנ א הדרושים עבור incubations. בשלב מאוחר יותר, הדבק יכול בקלות לקלף.
    4. דגירה 10 µL (או ככל הדרוש לכסות את השבב) של Bephore-מיקס בטמפרטורת החדר (RT) על השבב. במהלך הדגירה, המקום השבב בתוך קופסה, למשל קופסא עצה פיפטה חלקית מלא במים כדי להקטין התאדות.
    5. לאחר 1 h, לשטוף את השבב מספר פעמים (5 x עם 50 µL) על ידי pipetting עם PBS 1 x כדי להסיר לא מאוגדים Bephore-מיקס.
    6. תורידי את מאגר רב ככל האפשר ללא ייבוש השבב, דגירה µL 10 של פסיבציה-לערבב את השבב-RT.
    7. לאחר 2 h, לשטוף השבב מספר פעמים (10 x עם 50 µL) על ידי pipetting עם PBS 1 x כדי להסיר פסיבציה לא מאוגדת סוכנים.
  2. הקרנה ליתוגרפיה
    הערה: עבור לליטוגרפיה, מיקרוסקופ זקוף עם 60 x המטרה טבילה במים יכול לשמש. תאורה פעמים תלוי המטרה, מקור האור, המסכה, המצע (סיליקון צ'יפ או זכוכית-שקופיות), ה-DNA הרצוי לפני השטח צפיפות. עם מטרה 60 x, פעמים חשיפה טיפוסית נע מתחת דקה אחת ליתוגרפיה שני שלבים עם אזורים חופפים (15 s עבור שבבי סיליקון, 45 s עבור שקופיות זכוכית) ל 2-3 דקות לחשיפה מלאה. אל תשתמש/י תגית כיסוי (למעט fused קוורץ) על גבי המצע, מאז זה חוסם אור UV.
    1. חתך של photomask המודפס (ראה קובץ משלים עם מסכות ליתוגרפיה למופת, משלים בסעיף 5) לגודל המתאים כדי להתאים בעל המסכה מתאימים, אשר יכול להיות מוכנס במיקום של התחנה שדה (איור 2B). עבור דיוק רב שלבי לליטוגרפיה, יישר את המסכה עם סימני היישור על המחזיק.
    2. מקם את המצע בשקופית מיקרוסקופ והעברתו אל הבמה מיקרוסקופ. המתבנת של שקופיות זכוכית Bephore, להוסיף נייר שחור (למשל חילוף רדיד מ photomasks המודפס) בין מיקרוסקופ ושקופית Bephore כדי לספק רקע כהה ליתוגרפיה.
    3. להוסיף פילטר אדום לתוך הנתיב תאורה, המוקד על גבי משטח המצע ונווט אל האזור של המצע, אשר יהיו חשופים, למשל האזור בקצה של השריטה.
    4. הכנס בעל המסיכה, לחסום את ההארה ולשנות מסנן UV (איור 2C). בעוצמה האור נמוכה, פתח את התריס ולהשתמש למצלמה להתמקד במהירות את המסכה על המצע.
    5. לחסום את נתיב האור למצלמה, להאיר את המצע על עוצמת אור גבוהה הפעם החשיפה הרצויה.
    6. שייקח. את תגלי את ולהסיר בקפידה את מאגר רב ככל האפשר המצע ללא ייבוש זה.
    7. להוסיף 10-20 µL של ה-DNA רצף שאימצנו. מקם את המצע בקופסא רטובה כדי להגן עליו מפני התייבשות. דגירה הדנ א על המצע עבור 2 h (oligonucleotides-ריכוז micromolar) או מספר שעות/לילה (DNA kbp-ארוך-כ-100 nM ריכוז)-RT.
    8. הסר את ה-DNA של השבב, לשטוף אותו מספר פעמים עם 1 x PBS. על מנת לצמצם הבזבוז של DNA (במיוחד עבור קטעים ארוכים יותר), לאחסן את ה-DNA שנלקחו המצע ולעשות שימוש חוזר זה.
  3. צעד מרובת ליתוגרפיה
    הערה: עבור יישור מדויק של שניים או יותר חשיפות באזור אחד, לשמור את הדגימה על הבמה כדי למנוע אי-התאמות זוויתי. ודא שהשבב לא יתייבש. עבור המיקום של מספר מברשות DNA אזורים שונים על מצע, השתמש במה חשמליים לנסוע לאזור המיועד או השתמש מצע עם סימני יישור המתאים.
    1. לאחר החשיפה הראשונה (סעיף 3.2), דגירה DNA רצף וחישבו על המצע. חשוב כי כל אתרי קישור הנובע החשיפה הראשונה תפוסים. לכן, דגירה oligonucleotides (10 מיקרומטר) במשך כ-3 שעות-RT.
    2. לשתק גנים והחסרונות שכותרתו, למקם אותם על המצע למשך מספר שעות או למשך הלילה ב- RT, ולאחר מכן לשטוף את הדגימה ולהוסיף המיקס פסיבציה כבר שעתיים אחר-RT. להמשיך עם החשיפה הבאה.
    3. עבור חשיפות נוספות, חזור על השלבים הקודמים (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS התקנים

הערה: רצוי, עבודה בחדר נקי. הזיוף של מכשיר PDMS כדלקמן פרוטוקול סטנדרטי כמו שתואר על ידי מקדונלדס. et al. 30

  1. ייצור של תבניות הבסיס באמצעות פוטוליתוגרפיה
    1. לנקות סיליקון רקיק (76.2 מ מ קוטר, 525 עובי מיקרומטר) על ידי sonication ב אצטון עבור 5 דקות בעוצמה גבוהה ולשטוף עם אלכוהול איזופרופיל מים מיוננים. לאחר מכן מניחים את לחם הקודש על פלטה חמה ב 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    2. לחלופין, כדי לשפר את הידבקות של להתנגד כדי כשהפחד, להוסיף 2-3 מ"ל אדהזיה יזם, לסובב ב 3000 סל ד חום ס' 30 כשהפחד עד 120 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    3. להוסיף על 2-3 מ ל photoresist (ראה טבלה של חומרים). ספין כשהפחד 15 s 500 סל ד, ואז ב 3000 סל ד ל 30 s. זה אמור לגרום 20 מיקרומטר שכבה עבה של photoresist. תן את השכבה photoresist להירגע בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    4. על אופים טרום חשיפה, למקם את לחם הקודש על פלטה 50 º C למשך 2 דקות, ואז ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    5. המקום כשהפחד תחת photomask עם ה-blueprint של התאים. רצוי, להשתמש עם המסכה-aligner. Photomask יש רזולוציה של 64,000 dpi (ראה קובץ משלים עם מסכות ליתוגרפיה, משלים סעיף 5).
    6. לחשוף את לחם הקודש על 1 דקות עם אור UV (-קו 5-10 mW/cm2) דרך photomask.
    7. עבור העוגות לאחר חשיפה, למקם את לחם הקודש ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. תן וופל את תירגע ולהירגע לשעה בטמפרטורת החדר.
    8. המקום כשהפחד בצלחת עם מפתח למשך 3 דקות בעת בעדינות לזעזע את הספל. שוטפים את וופל עם אלכוהול איזופרופיל ומייבשים אותו עם אקדח חנקן. מקם את לחם הקודש על פלטה חמה ב 130 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  2. הכנה של המכשיר PDMS
    1. בסיס תערובת PDMS, PDMS אשפרה הסוכן 10:1 יחס, לשפוך אותם על כשהפחד במיכל סגור עד שכבה של-5 מ"מ הקימה מעל פרוסת סיליקון. כדי להשיג מכשיר PDMS של רק 1 מ מ עובי, במקום לסובב את המעיל וופל עם PDMS-100 סל"ד למשך 2 דקות.
    2. הכנס את המיכל אל תוך desiccator ולהחיל ואקום (כ-85 kPa) למשך כ- 30 דקות. לאחר מכן, מחממים את PDMS עד כ 70° C עבור 1-2 h בתנור.
    3. להפריד את המכשיר PDMS לחם הקודש. חותכים את PDMS לוחות כך כל תכשיט מכיל סט אחד של תאים. במקרה PDMS תהיה מחוברת מלכודת microfluidic, מנקבים חורים (1 מ מ קוטר) כמו כניסת ו עודפים בקצוות של הערוץ האספקה.
    4. את PDMS עם אלכוהול איזופרופיל מים מיוננים יבש ונקי זה עם אקדח חנקן. אחסן את PDMS האבק-חינם.

5. ביטוי גנים ממודר

הערה: ההליך הבא מתאר ההרכבה של בעל מדגם (איור 3) להסתכלות ביטוי גנים ממודר על מיקרוסקופ הפוך עם חממה כלוב עבור בקרת טמפרטורה. המחזיק נבנה באמצעות חומרים זמינים וכלים (מ מ 3.5-5 פלסטיק עבה פוליוויניל כלוריד (PVC), ברגים, אגוזים, התרגיל) והוא יכול להיות מותאם אישית כדי להתאים סוגים שונים של מיקרוסקופים. השלבים המתוארים 5.1 ו- 5.2 צריכה להתבצע כך שני החלקים של בעל מוכנות באותו זמן.

  1. התחתון מחזיק הרכבה
    1. להכין שבב Bephore בסימן יישור (למשל שריטה) והדבק אותה על גבי בעל שבב באמצעות סרט דביק דו-צדדי (איור 3B). השבב צריך להיות גדול יותר מאשר המכשיר PDMS אשר יכסה את זה.
    2. לשתק אחד או מספר גנים על השבב (ראו סעיפים 2 ו- 3).
    3. להוסיף קצת גריז ואקום סביב החור המרכזי של בעל התחתון ולאחר מכן לחבר בעל שבב.
      הערה: בעל שבב עכשיו לאנאפוליס המחזיק התחתון של השמן, תוך שמירה על האפשרות של מיצוב מחדש של השבב במישור x-y.
  2. מחזיק העליון הרכבה
    1. להכין שבב PDMS דק עם תאים באמצעות ההליך ציפוי ספין בשלב 4.2.1. חותכים את PDMS קטן ככל האפשר, עוזב את ערוץ פתוח לצד אחד כדי לאפשר חילופי פסולת, קודמן מולקולות על ידי דיפוזיה.
    2. לנקות תגית כיסוי זכוכית (24 מ מ x 24 מ מ, 1.5 מס) ואת הישבן של השבב PDMS (הצד ללא תאים) עם חמצן פלזמה עבור 42 s (המופעל ב 200 W ו 0.8 mbar עם הדגימה בתוך כלוב פאראדיי).
    3. מקם את השבב PDMS במרכז השקופית זכוכית עם התאים כלפי מעלה. אופים את הזכוכית עם PDMS עבור h 1-70 מעלות צלזיוס.
    4. להוסיף קצת גריז ואקום סביב החור גדול של בעל העליון.
    5. לפני תחילת הניסוי, נקי השקופית זכוכית, PDMS את צ'יפ עם חמצן פלזמה עבור 42 s כדי לעבד את PDMS הידרופילית.
    6. מקם את השקופית זכוכית עם PDMS על גבי המחזיק העליונה ( איור 3C) והקש בעדינות הזכוכית אל השמן (איור 3C).
  3. מחזיק הרכבה
    1. להכין µL 100 של מערכת ללא תא ביטוי ולשמור אותו בקרח.
    2. בזהירות להסיר את החומר הממתן השבב, לשטוף אותו פעם אחת עם µL 10 של ביטוי נטולת תא מערכת. בשלב הבא, להוסיף µL 60 ללא תא ביטוי במערכת על גבי השבב, להסיר דבק סיליקון שני הקצוות של השבב (להסיר כבר ב- 3B איור).
    3. הוסף 20 µL של הביטוי מערכת PDMS. לאחר הנחת ה-droplet על גבי PDMS, לבדיקה מהירה במיקרוסקופ סטריאוסקופי התאים רטובות טוב וללא בועות אוויר. אם יש בועות אוויר, נסה לשטוף אותם עם שאר מערכת ללא תא הביטוי.
    4. להרכיב את שתי חתיכות של בעל וכדי ליישר צ'יימברס ומברשות דנ א, פועלים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי וכן לשתק המחזיק התחתון עם זרוע התפיסה, אז את שני הברגים והן wingnuts נגישות בקלות בשתי הידיים (איור 3D-F ).
    5. הכנס המחזיק העליון בעל תחתית ותביא אותו עד טיפות מערכת ללא תא ביטוי נתיך (איור תלת-ממד). בדוק באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי אם התאים ואת הסימן יישור נמצאות באזור דומה במישור x-y-, אחרת תעלה את מחזיק העליון והמיקום מחדש הזכוכית שקופיות על המחזיק העליון.
    6. מלמטה, לדפוק את wingnuts עד שהם ייגעו הצד התחתון של בעל. להדק היטב את wingnuts, תוך כדי יישור התאים ואת השבב ב x-y-המטוס באמצעות נקודת האחיזה בתחתית של בעל שבב (איור 3E). פעם במגע, להדק את wingnuts רק בעדינות (איור 3F).
      הערה: שלב זה דורש קצת ניסיון, תלוי הגדרת הניסוי. תחת המיקרוסקופ, דפוסי הפרעות הנובעות נוזל בין PDMS זכוכית ניתן לציין כי הכוח יישומית הוא קטן מדי, בעוד עוצמת קרינה פלואורסצנטית נמוכה יותר (מ- DNA מברשת או ביטוי חלבונים) במרכז רמזים תא ב גבוה מדי לחץ (ראה גם מידע משלים, סעיף 6).
    7. לרסס את הספוג במתחם אנטי-אידוי עם מים ולהוסיף המחזיק לתוך התיבה. ממלאים מזרק 5 מ עם דבק סיליקון שני ולהשתמש בו כדי לסגור את תיבת (איור 3G).
    8. להעביר את תיבת מיקרוסקופ מבוקרי טמפרטורה, תמונה המברשת הדנ א ואת התגובה במיקרוסקופ זריחה. גם ללא תאורה, ידי קרינה פלואורסצנטית המברשת DNA התפוגגות במערכת הביטוי ללא תא. למרות זאת, המברשת כישות פעילותה, ניתן להציג על ידי ביטוי גנים חוזרות ונשנות מן המברשת אותו.
      הערה: בעת שימוש שקופית מזכוכית Bephore במקום שבב סיליקון, המיקום (למעלה/למטה) של שבב PDMS ו- Bephore ניתן להחליף, מתן אפשרות לשימוש של מטרות במרחקים קטנים יותר עבודה.

6. מתמשכת ביטוי במכשירים Microfluidic

הערה: הגדרת הניסוי מורכב מחלקים שמוצג באיור 4A. פרטים על ההרכבה של השלב מבוקרי טמפרטורה אתם מקבלים את המידע המשלים (סעיף 7).

  1. ביטוי נטולת תא ומערכת צינורות
    1. להכין את המערכת ללא תא ביטוי מדגם צינור (כ-200 µL). ניתן להוסיף חרוזי פוליסטירן המסומנת צבעי פלורסנט לצג מאוחר יותר קצב הזרימה דרך ערוץ האספקה.
    2. לחבר את הצינור על בקר לחץ. מקם את הצינור מאגר קרח גדול ששומר קר למשך 12 שעות. מילוי מחדש קרח במידת הצורך.
      הערה: כחלופה על בקר לחץ, מזרק משאבה מספק קצב זרימה מתמדת של ביטוי נטולת תא מערכת גם אם הזרימה התנגדות לשינויים, למשל עקב בועות אוויר, אשר עשוי לעזור לטווח ארוך ניסויים.
    3. לחבר את הצינור המכיל את המערכת ללא תא ביטוי PTFE אבובים (הקוטר הפנימי של 0.8 מ מ), אשר מגיעה לשלב מחוממת. לשבור את מחט מזרק (קוטר של 0.9 מ מ) לחתיכות 1-2 ס מ עם קצוות קהים, להכניס חתיכה אחת לאורך צינור PTFE. זה ישמש לאחר מכן מחבר PDMS. נסה לצמצם את אורך הצנרת בין הבמה לבין הצינור (איור 4C).
    4. לצנן את הצנרת PTFE, לסובב את זה סביב צינורות גומי גדול מחובר אליו מאגר של קרח מים, משאבה סחרור. . קשור אותם יחד עם דבק (איור 4C)
  2. מחזיק העליון הרכבה
    1. לנקות את הצד השטוח של השבב PDMS עם חמצן פלזמה (42 s) ומניחים אותו על שקופית מיקרוסקופ עם חורים הולם כניסת ו עודפים של PDMS (איור 4B). ניתן לקדוח החורים בכוס מראש עם כוס קידוח הראש. ודא כי המיקרו-התאים לא מתמודדים עם השקופית זכוכית.
    2. דבק דו צדדי חלות על הצד השטוח של בעל PDMS. מקל פיסת נייר שחור (למשל ממסכה ליתוגרפיה) בין האזור שבין שני החורים של בעל להימנע רקע זריחה מהקלטת דבק.
    3. מקל על השקופית זכוכית עם השבב PDMS עם בעלי.
    4. פינוק של PDMS, בעל PDMS עם הזכוכית המצורפת שקופית עם חמצן פלזמה בפלזמה מנקה (42 s).
    5. למרוח משחה ואקום סביב החור גדול בעל העליון והכנס בעל PDMS (איור 4B). בעל PDMS עכשיו לאנאפוליס המחזיק העליון, תוך שמירה על האפשרות של מיצוב מחדש בכיוונים x-y.
    6. לחבר את הצנרור PTFE עם מחבר מחט מזרק לים של שבב PDMS. כדי להקל את הגישה PDMS הכנסתם למחזיק העליון, הלוח פלסטיק העליון ניתן להסיר בקצרה יוכל לקחת את הצעד הבא.
    7. הכנס לגוש PTFE אבובים (כ 5 ס מ) עם מחבר מחט מזרק משקע החשמל (איור 4D).
    8. מיקום בעל PDMS המחזיק למעלה אז זה חופשי לנוע לכל הכיוונים. המקום בעל העליון באופן רופף לבמה מחוממת כמו דמות 4E ללא הידוק בכל wingnuts.
    9. עם המיקרוסקופ, נווט אל המיקום של התאים PDMS ובמרכז אותם שדה ראייה של המצלמה. אל תזיז את הבמה מנקודה זו.
    10. הסר המחזיק העליון עם PDMS הבמה.
  3. שלב מחוממת והחלק זכוכית Bephore
    1. הגדר את הטמפרטורה של השלב מחוממת 37 ° C
    2. מדביקים שקופית מזכוכית Bephore (מס ' 4) עם המברשות ג'ין לשלב מבוקרי טמפרטורה של המיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה באמצעות פעמיים בלוטות דבק צדדית, עם סימון יישור במרכז שדה ראייה של המיקרוסקופ. המיקום הזה סימן יישור מבטיחה כי התאים להיות הורדה בערך באותו האזור.
    3. לקחת תמונה בערוץ פלורסצנטיות המתאימים המברשת ג'ין ולסמן את מיקומו בתמונת המצלמה.
    4. להסיר את המאגר של המברשת ג'ין, אבל לא לתת לזה להתייבש. להוסיף 20 µL של חופש הביטוי מערכת התא - המברשת ג'ין ולהשתמש פינצטה כדי להסיר את המסגרת דבק סיליקון.
  4. הרכבה של ההתקנה microfluidic
    1. להוסיף לחץ הצינור הדגימה עד המערכת ללא תא ביטוי מילא את הצנרור PTFE, מופיע בחלק התחתון של המכשיר PDMS. בנוסף, פיפטה 10 µL של מערכת ביטוי נטולת תאים תאי-המיקרו-PDMS. ודא כי התאים חופשיים של בועות אוויר.
    2. בזהירות נמוך בעל העליון על גבי השקופית זכוכית ויישר את תאי-המיקרו עם המברשת ג'ין. לפני מארק PDMS ויישור להגיע אותו מישור מוקד, להשתמש את הברגים קטן בירכתי בעל PDMS דווקא ליישר את x-y-מיקום וכיוון של המכשיר PDMS עם המברשת ג'ין (איור 4E).
    3. החזק את המיקום והקש את PDMS על גבי השקופית זכוכית על ידי הידוק את wingnuts לאורך הברגים המחברים המחזיק למעלה על הבמה מיקרוסקופ (איור 4E).
    4. להגביר את הלחץ בצינור המכילה את הביטוי תא ללא מערכת ואת הצג הזרימה של חרוזים פלורסנט דרך ערוץ האספקה (flow המחירים בין 0.5 עד 5 µl לשעה מומלץ) (איור 4F). במידת הצורך, להגביר את הלחץ של PDMS על הזכוכית על ידי הידוק של wingnuts.

תוצאות

ליתוגרפיה בשני שלבים: איור 5 מראה התוצאה של תהליך בן שני שלבים ליטוגרפיה על משטח זכוכית עם דפוסים של גדילי דיס fluorescently שכותרתו חופפים.

הביטוי של חלבון פלואורסצנטי של מברשת ג'ין: איור 6 מדגים את הביטוי של החלב...

Discussion

ליתוגרפיה Bephore היא טכניקה חזקה ופסיביות לאימוביליזציה עם תבנית ה-DNA או RNA. ובכל זאת, הפרוצדורה כוללת מספר שלבים אשר - אם משתנה - עשוי להיות מקור לכישלון או מופחתת הביצועים של המערכת.

שלב חיוני בייצור שבבי Bephore הוא PEGylation של המצע, אשר מספק את התאימות של פני השטח. . הנה, הצעד ניקוי עם...

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

אנו להכיר בהכרת תודה תמיכה כספית עבור פרויקט זה על-ידי Stiftung של פולקסווגן (גרנט מס 89 883) המועצה האירופית למחקר (גרנט הסכם מס ' 694410 - AEDNA). טרשת נפוצה-S. מאשר תמיכה מאת DFG דרך GRK 2062.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate)Siegert WaferThickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold)Siegert WaferThickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4Menzel22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5Assistent24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-SilaneLaysan BioMW 5,000
Anhydrous tolueneSigma Aldrich (Merck)244511
StreptavidinThermo-Fisher ScientificS888
DNAIntegrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531SPCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System PromegaA9281Spin-column PCR clean-up kit
PURExpressNew England BiolabsE6800SCell-free expression system
PDMS Dow CorningSlygard 184
FluoSpheresThermo-Fisher ScientificF8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm)BolaS 1810-10
EpoCore 20micro resist technology GmbHPhotoresist
mr-Dev 600micro resist technology GmbHPhotoresist developer
Ti-PrimeMicroChemicalsAdhesion promoter
Two-component silicon gluePicodentTwinsil 
UV-protection yellow foilLithoprotect (via MicroChemicals)Y520E212
Equipment
Masks for photolithographyZitzmann GmbH64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscopeOlympusBX51Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objectiveOlympusLumPlanFlUsed with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objectiveOlympusLumPlanFlUsed with Olympus BX51, NA 0.5
CameraPhotometricsCoolsnap HQUsed with Olympus BX51
Ligtht sourceEXFOX-Cite 120QUsed with Olympus BX51
Inverted microscopeNikonTi2-EFluorescence imaging of gene expression
4x objectiveNikonCFI P-Apo 4x LambdaUsed with Nikon Ti2-E
CameraAndorNeo5.5Used with Nikon Ti2-E
Light sourceLumencorSOLA SM IIUsed with Nikon Ti2-E
Cage incubatorOkolabbold lineUsed with Nikon Ti2-E
Pressure ControllerElveflowOB1 MK3
NanoPhotometerImplenDNA concentration measurement
Plasma cleanerDienerFemto200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

References

  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
  3. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
  4. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
  5. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
  6. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  7. Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
  8. Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
  9. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
  11. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  12. Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
  13. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
  14. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
  15. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  16. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
  17. Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
  18. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  19. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
  20. van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
  21. Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
  22. Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
  23. Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
  24. Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
  25. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
  26. Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
  27. Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
  28. Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
  29. Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
  30. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140biochipsDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved