Diferenciación de células madre de nervio por un solo Plasma atmosférico frío tratamiento In Vitro

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar pasos experimentales detallados de un tratamiento de plasma atmosférico frío sobre las células madre neurales y detección de inmunofluorescencia para la mejora de la diferenciación.

Resumen

Como el desarrollo de la tecnología de plasma físico, frío atmosféricos plasmas (CAPs) han sido ampliamente investigados en descontaminación, tratamiento contra el cáncer, la cicatrización de heridas, tratamiento de conducto, etc., formando un nuevo campo de investigación llamado medicina del plasma. Siendo una mezcla de especies reactivas eléctricas, químicas y biológicas, casquillos han demostrado sus habilidades para mejorar la diferenciación de las células madre de nervio tanto en vitro y en vivo y se está convirtiendo en un camino prometedor para el tratamiento de la enfermedad neurológica en el futuro. La noticia más emocionante es que usando tapas de puede realizar un solo paso y dirigido con seguridad, diferenciación de las células madre neurales (NSC) para el transporte de tejido. Aquí demostramos el protocolo experimental detallado usando un dispositivo de tapa jet hecho a sí mismo para mejorar la diferenciación de la NSC en C17.2 NSCs y las células madre neurales primarios de rata, así como el destino de la célula por invertida y microscopía de fluorescencia. Con la ayuda de la inmunofluorescencia que manchaba la tecnología, encontramos tanto las NSCs mostró un ritmo acelerado de la diferencia que el grupo no tratado, y ~ 75% de las NSCs selectivamente diferenciado en neuronas, que son principalmente maduros, colinérgicos y motor neuronas.

Introducción

La diferenciación dirigida de NSC en un cierto linaje para el transporte de tejido es considerada uno de los más prometedores tratamientos para enfermedades de neurodegenerative y neurotraumatic¹. Por ejemplo, las neuronas dopaminérgicas catecolaminérgica se desean especialmente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP). Sin embargo, los métodos tradicionales para preparar las células deseadas para el transporte tienen muchos inconvenientes, tales como toxicidad química, formación de la cicatriz u otros, que dificulta en gran medida las aplicaciones de NSCs en medicina regenerativa². Por lo tanto, es muy necesario encontrar una manera novedosa y segura para la diferenciación de la NSC.

El plasma es el cuarto estado de materia, siguiente sólido, líquido y gas, y constituye más del 95% de casos en todo el universo. Plasma es eléctricamente hilo neutro positivos o negativos y partículas neutras y normalmente es generado por una descarga de alto voltaje en el laboratorio. En las últimas dos décadas, la aplicación de plasma en biomedicina ha atraído gran atención en todo el mundo como el desarrollo de la tecnología de plasma frío la presión atmosférica. Gracias a esta técnica, plasma de baja temperatura estable se puede generar en el aire en la atmósfera sin la formación de arco y consta de diversas especies reactivas, tales como las especies reactivas del nitrógeno (RNS), especies reactivas del oxígeno (ROS), ULTRAVIOLETA (UV) radiación, electrones, iones y campo eléctrico³. Tapas tienen ventajas únicas para la inactivación de microorganismos, terapia del cáncer, de heridas, tratamiento de enfermedades de la piel, la proliferación celular y diferenciación celular^4,5,6,7. En trabajos previos, hemos demostrado que chorro de plasma atmosférico frío puede mejorar la diferenciación de NSCs en células neuronales murinas C17.2 (C17.2-NSC) y las células madre neurales primarios de rata, exhibiendo un gran potencial para convertirse en una poderosa herramienta para la dirección diferenciación de NSCs⁸. Aunque el mecanismo de mejora de la tapa de la diferenciación del NSC no se entiende completamente sin embargo, NO generado por los casquillos ha demostrado para ser un factor clave en el proceso. En este trabajo, nuestro objetivo es proporcionar un protocolo experimental detallado del uso de un plasma de helio/oxígeno de presión atmosférica jet para el tratamiento de NSCs en vitro, preparación de la célula y tratamiento previo, observación de morfología por microscopio invertido, y observación de la microscopia de fluorescencia de la tinción de inmunofluorescencia.

Protocolo

1. culturas y Predifferentiation de la célula

1. Predifferentiation y cultivo de células madre neuronales
   1. Preparar el cubreobjetos de poly-D-lisina-revestida. Poner un cubreobjetos estéril (20 mm de diámetro) en una placa de 12 pozos. Capa del cubierta de vidrio con poly-D-lisina, 0.1% w/v, en el agua (Tabla de materiales) para mejorar la adherencia de la célula en el cubreobjetos siguiendo los siguientes pasos.
      Nota: Las condiciones óptimas se deben determinar para cada línea celular y la aplicación.
      1. Cubra asépticamente la superficie del cubreobjetos con poly-D-lisina, 0.1% w/v, en el agua. Rock suavemente para asegurar un recubrimiento uniforme de la superficie del cubreobjetos.
      2. Después de cultivo durante la noche (~ 12 h) a 37 ° C, retirar la solución de poly-D-lisina y enjuague la superficie 3 x con 1 mL de agua estéril.
      3. Secar la células por lo menos 30 min antes de sembrarlos.
2. Predifferentiation y células neuronales murinas C17.2 (C17.2-NSC) cultura
   1. Incubar C17.2-NSC en un matraz de 25 cm² en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 5% de suero de caballo (TA) y 1% de penicilina/estreptomicina a 37 ° C y 5% CO₂ para d ~ 2-3.
   2. Cuando las células alcanzan el 85% de confluencia, quitarlo del medio, lavan las células con 1 mL de PBS y añadir 1 mL de tripsina fresco (0,25%) en el matraz. Dejar durante 1 minuto; Luego, añadir 1 mL de medio de cultivo y el matraz pipeta arriba y abajo varias veces para asegurar una suspensión unicelular.
   3. Contar la densidad de las células en la suspensión usando un hemocitómetro. Calcular el volumen requerido de la suspensión celular para obtener una concentración celular final de 2 x 10⁴ células/mL.
   4. Semilla C17.2-NSC en el cubreobjetos recubierto de la placa de 12 pozos con la densidad de 2 x 10⁴ células por pocillo. Comprobar la densidad de células bajo un microscopio.
      Nota: Para un mejor resultado, la densidad celular óptima debe ser determinada antes del experimento de inmunofluorescencia.
   5. Incube las células a 37 ° C en un incubador celular durante 12 h permitir el accesorio.
   6. Después de la fijación, se lavan las células 2 x con 1 mL de PBS y cultivar las células con medio de diferenciación que consiste en DMEM/F12 con suplemento de 1% N2 48 h antes del tratamiento de plasma.
3. Predifferentiation y cultura de célula madre neuronal primaria rata
   1. La suspensión primaria rata NSC en medio de crecimiento de rata NSC sin recubrimiento T25 los matraces en una densidad de 5 x 10⁵ células de cultivo.
      Nota: La rata principal NSC fue aislado siguiendo el protocolo de Xie et al. ⁹.
   2. Compruebe la formación de neuroesferas bajo un microscopio invertido. Asegúrese de que la morfología de las neuroesferas exhibe complejos multicelulares esféricos y transparentes.
   3. Cuando las neuroesferas alcanzan un diámetro de 3 mm o más grande, transfiera la suspensión desarrolló a un tubo de centrífuga estériles de 15 mL y dejar que las neuroesferas asentarse por gravedad.
   4. Quite el sobrenadante con cuidado para dejar las neuroesferas en un volumen mínimo de medio.
   5. Enjuague las neuroesferas 1 x con 5 mL de PBS y dejar que las neuroesferas asentarse por gravedad. Quite el sobrenadante para dejar un volumen mínimo de PBS.
   6. Añadir un volumen adecuado de medio de diferenciación para ajustar la densidad celular a neuroesferas ~ 12-15 por mililitro. El medio de la diferenciación de primario rata NSCs consiste en DMEM/F12, 2% B27 y 1% FBS.
   7. Sembrar 1 mL de la suspensión de desarrolló en cada cubreobjetos recubierto de la placa de la pozo 12.
      Nota: Agitar la placa suavemente para asegurar que las neuroesferas se distribuyen uniformemente. Este paso es vital para un mejor resultado de la inmunofluorescencia.
   8. Coloque la placa en la incubadora y deje que se predifferentiate durante 24 h antes del tratamiento de plasma.

2. preparación de los chorros de Plasma

1. Elija un tubo de cuarzo de mitad-abren con un diámetro interno de 2 mm y un diámetro exterior de 4 mm. insertar un cable de alta tensión con un diámetro de 2 mm en el tubo.
2. Inserte el tubo de cuarzo con el cable de alta tensión en una jeringa de 5 mL y utilice un soporte para montar dentro del centro de la jeringa. Ajuste la distancia entre el extremo sellado del tubo de cuarzo y la punta de la jeringa a 1 cm.
3. Conectar un tubo de goma de silicona de 1 m (con un diámetro interior de 12 mm) con el extremo abierto de la jeringa y, a continuación, conecte a la válvula de gas y medidor de caudal en secuencia.

3. adquisición de los chorros

1. Conecte el circuito como se muestra en la figura 1. Conecte el cable de salida de la fuente de alimentación para el dispositivo de chorro de plasma y, a continuación, conecte la punta de la sonda de alto voltaje con el cable de salida para detectar la tensión. Conecte el otro extremo de la sonda de alto voltaje en el osciloscopio para registrar la información de la tensión de salida. Controlar todo el circuito y que la fuente de alimentación, osciloscopio y la sonda de alto voltaje se basan.
2. Compruebe la línea de gas. Asegúrese de que el tubo de gas se ha conectado el dispositivo de chorro de plasma; a continuación, abra la válvula de gas del helio (fracción de volumen, 99.999%) y oxígeno (fracción de volumen, 99.999%) y ajuste el flujo de gas a 1 L:0.01 L/min (: O₂).
   Nota: Deje que el flujo de gas durante varios minutos antes de encender la fuente de alimentación por primera vez.
3. Establecer la amplitud de pulso, la frecuencia y la anchura de pulso como 8 kV, 8 kHz y 1600 ns, respectivamente. Vuelva a comprobar el circuito y, a continuación, gire el botón de salida para crear un chorro de plasma.
   PRECAUCIÓN: No toque el cable de alta tensión en cualquier momento.

4. plasma tratamiento de células madre neuronales

1. Establecer la distancia entre la boquilla de la jeringa y el agujero bien celular a 15 milímetros.
   Nota: La distancia se mide desde la parte inferior de la plataforma donde se coloca la placa de 12 pozos.
2. Tomar la placa de 12 pozos fuera de la incubadora y cambiar el medio de las células predifferentiated a 800 μl de medio fresco de diferenciación.
3. Las células se dividen en tres grupos: un grupo control sin tratar, una 60 s y O₂ (1%) gas flujo tratamiento grupo y un grupo de tratamiento de plasma s 60.
   Nota: No es ninguna pérdida obvia de líquido bajo la condición de tratamiento.
4. Coloque la placa de la pozo 12 bajo los chorros de plasma, asegúrese de que la boquilla de la jeringa se fija en el centro de cada agujero y dar el tratamiento correspondiente a los diferentes grupos mencionados en el paso 4.3.
   Nota: Los controles no tratados se mantuvieron en medio de la diferenciación a temperatura ambiente durante el procedimiento experimental para condiciones de tratamiento uniforme. El grupo de tratamiento y O₂ (1%) gas flujo fue tratado con sólo un He y flujo de gas O₂ (1%), sin generación de plasma. Todos los tratamientos deben realizarse por triplicado.

5. diferenciación de la célula de vástago nervios

1. Después del tratamiento, retire la cultura original y añadir 1 mL de nuevo medio de diferenciación a cada pocillo.
2. Incubar las células en la incubadora a 37 ° C y 5% CO₂ para 6 d. cambiar el medio cada día.
3. Comprobar el estado de diferenciación de los diferentes grupos diariamente bajo un microscopio óptico de contraste de fases invertido. Al azar seleccione por lo menos 12 campos y tomar fotos para grabar los cambios morfológicos.

6. tinción de inmunofluorescencia

1. Enjuague
   1. Tomar las muestras fuera de la incubadora de la célula y quitarlo del medio por la aspiración. Enjuague las células 1 x con 1 mL de PBS.
      Nota: Después de la diferenciación, las células son separadas fácilmente. Es necesario añadir PBS desde el lado de los pozos de la cultura para evitar el lavado de las células.
2. Fijación
   1. Fijar las células con 500 μl de paraformaldehído al 4% por 20 min a temperatura ambiente. Después de la fijación, enjuague suavemente las células de 3 x con 1 mL de PBS, 5 minutos cada uno, para eliminar lo residuos paraformaldehído al 4%.
      Nota: El momento óptimo para la fijación de la célula debe determinarse según los tipos de células. Después de la fijación, añadir 1 mL de PBS desde el lado de los pozos de la cultura y deja la muestra en la tabla por 5 min. No utilice un agitador de laboratorio, para asegurar una mínima pérdida de células.
3. Permeabilización
   1. Permeabilizar las muestras con 0.2% TritonX-100 en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de permeabilización, enjuague las células con 1 mL de PBS para tres veces, 5 minutos cada uno.
      Nota: Se determinará el momento óptimo para permeabilización de células según los tipos de células. Después de permeabilización, añadir 1 mL PBS desde el lado de los pozos de la cultura, deje la muestra en la tabla por 5 min. No utilice un agitador de laboratorio para garantizar la mínima pérdida de células.
4. Bloqueo
   1. Añadir 1 mL de suero de cabra 10% en PBS a cada muestra y deja la muestra en la tabla para 1 h de bloquear las interacciones no específicas.
      Nota: No utilice un agitador de laboratorio, para evitar que las células de extracción de la diapositiva. Un enjuague no es necesario en este paso.
5. Incubación con el anticuerpo primario
   1. Diluir el anticuerpo primario con tampón de dilución del anticuerpo primario.
      Nota: Para obtener resultados óptimos, debe determinarse la relación de la dilución final del anticuerpo primario por antes de la prueba. Las proporciones de dilución de nestina anti (para células madre no diferenciadas), anti-β-tubulina III (neurona), anti-O4 (de oligodendrocyte), anti-NF200 (de neuronas maduras), anti-ChAT (neuronas colinérgicas), anti-LHX3 (para las neuronas motoras), anti-GABA (para Las neuronas de GABAergic), anti-serotonina (para las neuronas serotonergic) y anti-TH (para las neuronas dopaminérgicas) son de 1: 80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 y 1: 100, respectivamente.
   2. Aplican 300 μL del diluido anticuerpos primarios a diferentes muestras.
   3. Incubar las muestras de células durante la noche a 4 ° C.
      Nota: Se recomienda incubar los anticuerpos primarios a 4 ° C para reducir el fondo y la tinción inespecífica.
   4. Quite los anticuerpos primarios y enjuague suavemente las células 3 x con 1 mL de PBS.
6. Incubación con el anticuerpo secundario
   1. Diluir los anticuerpos secundarios conjugados con Cy3 o conjugados con Alexa Fluor 488 utilizando suero de cabra 3% en PBS.
      Nota: Para obtener resultados óptimos, la relación de la dilución final del anticuerpo secundario debe ser determinada por la prueba preliminar.
   2. Aplicar 300 μL de anticuerpos secundarios relevantes para detectar cada anticuerpo primario.
      Nota: Todos los pasos posteriores deban realizarse en la oscuridad para evitar la fluorescencia que apaga.
   3. Incubar la muestra de células en la oscuridad durante 2 h a temperatura ambiente.
   4. Quite los anticuerpos secundarios y enjuague las células con 1 mL de PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente.
7. Tinción nuclear
   1. Aplicar 500 μl de solución de trabajo de Hoechst 33258 para sumergir la muestra de células.
   2. Incubar la muestra de células en la oscuridad durante 8 min a temperatura ambiente para los núcleos de la etiqueta.
   3. Enjuague suavemente las células de 3 x con 1 mL de PBS, 10 minutos cada uno, protegidos de la luz.
      Nota: Para una mínima pérdida de células, la condición de lavado óptima debe ser determinada empíricamente.
8. Montaje
   1. Coloque una gota de medio de montaje en el centro de la microslide.
   2. Retirar el cubreobjetos (con muestras) con unas pinzas y con cuidado, coloque la muestra sobre el medio de montaje. Evitar las burbujas de aire.
   3. Retire cualquier medio de montaje exceso con papel absorbente.
9. Observación de la microscopia de fluorescencia
   1. Observar las muestras en la microscopía de fluorescencia, equipado con filtros para Hoechst 33258 y Alexa Fluor 488 Cy3. Para cada muestra, seleccionar al azar por lo menos 8-12 campo y grabar imágenes con una cámara.

Resultados

Morfología de la célula se observó bajo el microscopio invertido cada día después del tratamiento de la tapa. La figura 2 muestra las imágenes de microscopio invertido de contraste de fase ordinaria de la diferenciación celular en ambas líneas celulares. El grupo tratado con plasma exhibe una tasa de diferenciación acelerada y una relación de alta diferenciación en comparación con el grupo de flujo de gas y control.

Discusión

C17.2-NSC es una especie de línea de células neuronales inmortalizadas de células de la capa granular cerebelosa de ratón neonatal, desarrollado por Snyder y otros^10,11. C17.2-NSC puede diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos y es ampliamente utilizado en Neurociencia¹². En nuestro estudio anterior, tapas podrían mejorar la diferenciación de NSCs C17.2 en neuronas. Un estudio de prueba de principio también llevó a ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A