Nerv-Stammzell-Differenzierung durch ein einstufiges kalt atmosphärischem Plasma Behandlung In-vitro-

Zusammenfassung

Dieses Protokoll soll detaillierte experimentelle Schritte von einer kalten atmosphärischen Plasmabehandlung auf neurale Stammzellen und Immunfluoreszenz-Erkennung für Differenzierung Verbesserung zu geben.

Zusammenfassung

Da die Entwicklung der physischen Plasmatechnologie, kalte atmosphärische Plasmen (CAPs) in Dekontamination, Krebsbehandlung, Wundheilung, Wurzelbehandlung, etc.weit untersucht wurden, bilden ein neues Forschungsgebiet benannt Plasmamedizin. Als eine Mischung aus elektrischen, chemischen und biologischen reaktiven Spezies, Kappen haben gezeigt, ihre Fähigkeiten, Nerv Stammzellen Differenzierung zu verbessern sowohl in Vitro und in Vivo und sind immer ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung von neurologischen Krankheiten in der Zukunft. Die viel spannende Nachricht ist, dass CAPs einstufige erkennen können und sicher geleitet, Differenzierung von neuronalen Stammzellen (NSCs) für den Transport der Gewebe. Wir zeigen hier die detaillierte experimentelle Protokoll mit einem selbstgebauten CAP Jet-Gerät um zu NSC Differenzierung in C17.2-NSCs und primäre Ratte neuronalen Stammzellen zu verbessern sowie Beobachtung durch das Schicksal der Zelle invertiert und Fluoreszenz-Mikroskopie. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz-Färbung Technologie wir fanden beide die NSCs Differential beschleunigt als die unbehandelte Gruppe zeigte, und ~ 75 % von den NSCs differenziert selektiv in Neuronen, die vor allem ältere, cholinerge und motor Neuronen.

Einleitung

Die gezielte Differenzierung von NSCs in einer bestimmten Linie für den Transport der Gewebe gilt als einer der vielversprechendsten Therapien für Neurodegenerative und Neurotraumatic Krankheiten¹. Zum Beispiel sind Catecholaminergic dopaminergen Neuronen vor allem in der Behandlung der Parkinson-Krankheit (PD) erwünscht. Traditionelle Methoden, um die gewünschten Zellen für den Transport vorzubereiten haben jedoch viele Nachteile, wie chemische Toxizität, Narbenbildung oder andere, die vor allem die Anwendungen der NSCs in regenerative Medizin²behindert. Daher ist es sehr notwendig, um eine neue und sichere Methode für NSC Differenzierung zu finden.

Plasma ist der vierte Zustand der Angelegenheiten, folgende Feststoff, Flüssigkeit und Gas und stellt mehr als 95 % der Fragen im ganzen Universum. Plasma ist elektrisch neutral mit ungebundenen positiven/negativen und neutralen Teilchen und wird in der Regel durch eine Hochspannungs-Entladung im Labor erzeugt. In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Anwendung von Plasma in der Biomedizin als die Entwicklung der kalten Atmosphärendruck-Plasma-Technologie weltweit große Aufmerksamkeit erregt. Dank dieser Technik stabiles Niedrigtemperatur-Plasma in der umgebenden Luft in der Atmosphäre ohne Bogen Bildung erzeugt werden kann und besteht aus verschiedenen reaktiven Spezies, wie reaktive Stickstoff-Spezies (RNS), reaktive Sauerstoffspezies (ROS), Ultraviolett (UV) Strahlung, Elektronen, Ionen und elektrisches Feld³. Kappen haben einzigartige Vorteile für Mikroorganismen-Inaktivierung, Krebstherapie, Wundheilung, Behandlung von Hautkrankheiten, Zellproliferation und Zelle Differenzierung^4,5,6,7. In früheren Arbeiten haben wir bewiesen, dass kalte atmosphärischem Plasma Jet die Differenzierung der NSCs in murinen neurale Stammzellen C17.2 (C17.2-NSCs) und primäre Ratte neuronalen Stammzellen verbessern kann Aussteller ein großes Potenzial zu einem mächtigen Werkzeug für die Regie Differenzierung von NSCs⁸. Obwohl der Mechanismus der CAP-Verbesserung der NSC Differenzierung noch nicht vollständig verstanden ist durch Kappen können keine erwies sich ein entscheidender Faktor in diesem Prozess sein. In dieser Arbeit wollen wir ein detailliertes experimentelle Protokoll mit einem Helium/Sauerstoff Atmosphärendruckplasma Jet für die Behandlung von NSCs in Vitro, Handy Vorbereitung und Vorbehandlung, Morphologie Beobachtung von inversen Mikroskop und Fluoreszenz-Mikroskopie Beobachtung der Immunfluoreszenz-Färbung.

Protokoll

(1) Zell-Kulturen und Predifferentiation

1. Neuronalen Stammzelle-Kultur und predifferentiation
   1. Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläsern vorzubereiten. Legen Sie eine sterile Deckglas (20 mm Durchmesser) in ein 12-Well-Platte. Bestreichen Sie das Deckglas mit Poly-D-Lysin, 0,1 % w/V, im Wasser (Table of Materials) für bessere Zelladhäsion auf den Deckgläsern indem Sie die nächsten Schritte.
      Hinweis: Optimale Bedingungen müssen für jede Zelllinie und Anwendung festgelegt werden.
      1. Aseptisch Beschichten der Oberfläche des Deckglases mit Poly-D-Lysin, 0,1 % w/V, im Wasser. Rock sanft um eine gleichmäßige Beschichtung der Oberfläche Deckglas zu gewährleisten.
      2. Nach der Kultivierung Übernachtung (12 h) bei 37 ° C, die Poly-D-Lysin-Lösung entfernen und spülen Sie die Oberfläche 3 X mit 1 mL sterilem Wasser.
      3. Trocknen Sie die Zellen mindestens 30 min vor der Aussaat sie.
2. Murine neurale Stammzellen C17.2 (C17.2-NSC) Kultur und predifferentiation
   1. Inkubieren Sie C17.2-NSCs in einem 25 cm² Kolben in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 5 % Pferd Serum (HS) und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 ° C und 5 % CO₂ für ~ 2-3 d.
   2. Wenn die Zellen Zusammenfluss von 85 % erreicht haben, entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit 1 mL PBS und fügen Sie 1 mL frisch Trypsin (0,25 %) in den Kolben. Lassen Sie es für 1 min; Fügen Sie 1 mL Kulturmedium zu Kolben und Pipette nach oben und unten mehrmals, um eine einzelne Zelle Aussetzung zu gewährleisten.
   3. Zählen Sie die Dichte der Zellen in der Suspension mit einer Hemocytometer. Berechnen Sie die erforderliche Menge Zellsuspension, eine endgültige Zellkonzentration von 2 x 10⁴ Zellen/mL zu geben.
   4. Samen C17.2-NSCs auf der beschichteten Deckgläsern in der 12-Well-Platte mit der Dichte von ~ 2 x 10⁴ -Zellen pro Bohrloch. Überprüfen Sie die Zelldichte unter dem Mikroskop.
      Hinweis: Ein besseres Ergebnis zu erzielen, muss die optimale Zelldichte vor dem Immunfluoreszenz-Test ermittelt werden.
   5. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C in einer Zelle Inkubator für 12 h zur Befestigung zu ermöglichen.
   6. Nach der Befestigung, waschen Sie die Zellen 2 X mit 1 mL PBS und pflegen die Zellen mit Differenzierung Medium bestehend aus DMEM/F12 mit Zuschlag von 1 % N2 für 48 h vor der Plasmabehandlung.
3. Primäre Ratte neuronalen Stammzelle-Kultur und predifferentiation
   1. Kultur die primäre Ratte NSC-Suspension in Ratte NSC Wachstumsmedium in unbeschichteten T25 Fläschchen bei einer Dichte von 5 x 10⁵ Zellen.
      Hinweis: Die primäre Ratte NSCs wurden isoliert nach dem Protokoll von Xie Et al. ⁹.
   2. Überprüfen Sie die Bildung von Neurospheres unter einem inversen Mikroskop. Sicherstellen Sie, dass die Morphologie der Neurosphären sphärischen und transparente mehrzelligen komplexe Exponate.
   3. Bei die Neurosphären einen Durchmesser von 3 mm oder größer erreichen, die Neurosphäre Aussetzung einer sterilen Zentrifugenröhrchen 15 mL und lasse Sie begleichen die Neurosphären durch die Schwerkraft.
   4. Entfernen des Überstands vorsichtig um den Neurosphären in einem minimalen Volumen des Mediums zu verlassen.
   5. Spülen Sie die Neurosphären 1 X mit 5 mL PBS und lassen die Neurosphären durch die Schwerkraft zu begleichen. Entfernen Sie den Überstand um eine minimale Menge an PBS zu verlassen.
   6. Fügen Sie eine angemessene Lautstärke von Mittel-und Differenzierung der Zelldichte, ~ 12-15 Neurosphären pro Milliliter einstellen. Die Differenzierung Medium für primäre Ratte NSCs besteht aus DMEM/F12, 2 % B27 und 1 % FBS.
   7. Samen 1 mL Neurosphäre Suspension auf jeder beschichteten Deckglas in der 12-Well-Platte.
      Hinweis: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Neurosphären gleichmäßig verteilt sind. Dieser Schritt ist entscheidend für ein besseres Ergebnis der Immunfluoreszenz.
   8. Die Platte in den Brutkasten und lassen Sie ihn 24 Stunden vor der Plasmabehandlung predifferentiate.

2. Vorbereitung des Plasma-Jets

1. Wählen Sie eine halboffene Quarzrohr mit einem Innendurchmesser von 2 mm und einem Außendurchmesser von 4 mm. Legen Sie einen Hochspannungs-Draht mit einem Durchmesser von 2 mm in das Rohr.
2. Einfügen Sie Quarzrohr mit dem Hochspannungs-Draht in eine 5 mL Spritze und verwenden Sie eine Halterung, um in der Mitte der Spritze zu montieren. Legen Sie den Abstand zwischen versiegelten Ende der Quarzrohr und der Spritze Spitze 1 cm.
3. Schließen Sie ein 1 m Silikon Kautschuk Rohr (mit einem Innendurchmesser von 12 mm) zum offenen Ende der Spritze und dann verbinden Sie es mit dem Durchflussmesser und Gasventil nacheinander.

3. Übernahme der Jets

1. Verbinden Sie die Schaltung, wie in Abbildung 1dargestellt. Verbinden Sie das Ausgabe-Kabel des Netzteils mit dem Plasmastrahl Gerät, und verbinden Sie dann die Spitze der Hochspannungs-Sonde mit dem Ausgabe-Draht um die Spannung zu erkennen. Verbinden Sie das andere Ende der Hochspannungs-Sonde auf dem Oszilloskop zum Aufzeichnen der Informationen der Ausgangsspannung. Überprüfen Sie die gesamte Schaltung und stellen Sie sicher, dass das Netzteil, das Oszilloskop und die Hochspannungs-Sonde alle geerdet sind.
2. Überprüfen Sie die Gasleitung. Stellen Sie sicher, den Gasschlauch an den Plasmastrahl Gerät angeschlossen wurde; dann öffnen Sie das Gasventil der Helium (Volumenanteil, 99,999 %) und Sauerstoff (Volumenanteil, 99,999 %) und den Gasstrom auf 1 L:0.01 L/min (He: O₂) festgelegt.
   Hinweis: Lassen Sie den Gasstrom für einige Minuten vor dem Einschalten der Stromversorgung zum ersten Mal.
3. Legen Sie den Puls Amplitude, Frequenz und Impulsbreite als 8 kV, 8 kHz und 1600 ns, beziehungsweise. Überprüfen Sie die Schaltung wieder und schalten Sie dann die Schaltfläche "Ausgabe", um ein Plasmastrahl zu erstellen.
   Vorsicht: Berühren Sie nicht die Hochspannungs-Leitung zu jeder Zeit.

4. die Plasmabehandlung von neuronalen Stammzellen

1. Legen Sie den Abstand zwischen der Düse der Spritze und die Zelle gut Loch bis 15 mm.
   Hinweis: Der Abstand wird von der Unterseite der Plattform gemessen wo 12-Well-Platte platziert wird.
2. 12-Well-Platte aus dem Inkubator nehmen und das Medium der predifferentiated Zellen zu 800 µL frische Differenzierung Medium verändern.
3. Die Zellen in drei Gruppen unterteilen: einer unbehandelten Kontrollgruppe, eine 60 s He und O₂ (1 %) Gas Flow Behandlungsgruppe und 60 s Plasma Behandlungsgruppe.
   Hinweis: Es gibt keine offensichtliche Flüssigkeitsverlust unter der Voraussetzung der Behandlung.
4. Platzieren Sie 12-Well-Platte unter den Plasma-Jets zu, stellen Sie sicher, dass die Spritze Düse in der Mitte jedes Loch fixiert ist und geben Sie die entsprechenden Behandlung auf den verschiedenen Gruppen in Schritt 4.3 genannten.
   Hinweis: Die unbehandelten Kontrollen wurden während der Versuchsdurchführung, einheitliche Behandlung zu gewährleisten in Differenzierung Medium bei Raumtemperatur aufbewahrt. He und O₂ (1 %) Gas Flow Behandlungsgruppe wurde mit nur einem er behandelt und O₂ (1 %) Gasstrom ohne Plasmaerzeugung. Alle Behandlungen sollten in dreifacher Ausführung durchgeführt werden.

(5) neuronaler Stammzell-Differenzierung

1. Entfernen Sie nach der Behandlung die ursprüngliche Kultur und 1 mL neue Differenzierung Medium in jede Vertiefung.
2. Inkubieren Sie die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO₂ für 6 d. das Medium verändern jeden zweiten Tag.
3. Überprüfen Sie den Status der Differenzierung der verschiedenen Gruppen täglich unter einem Lichtmikroskop invertierten Phasenkontrast. Nach dem Zufallsprinzip wählen Sie mindestens 12 Felder aus und fotografieren Sie die morphologischen Veränderungen aufzeichnen.

6. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Spülen
   1. Die Proben aus dem Inkubator Zelle herausnehmen Sie und das Medium durch Absaugen. Spülen Sie die Zellen 1 X mit 1 mL PBS.
      Hinweis: Nach der Differenzierung sind die Zellen leicht abgenommen. Es ist notwendig, die PBS von der Seite der Kultur Brunnen zu vermeiden, waschen Sie die Zellen hinzufügen.
2. Fixierung
   1. Befestigen Sie die Zellen mit 500 µL 4 % Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur. Nach der Fixierung sanft spülen die Zellen 3 X mit 1 mL PBS, jeweils 5 min, die restlichen 4 % Paraformaldehyd zu entfernen.
      Hinweis: Der optimale Zeitpunkt für die Zelle Fixierung muss nach der Zelltypen ermittelt werden. Nach der Fixierung 1 mL PBS von der Seite der Kultur Brunnen und lassen Sie die Probe für 5 min auf dem Tisch. Verwenden Sie einen Labor-Shaker, nicht um zu einen minimalen Verlust von Zellen zu gewährleisten.
3. Permeabilisierung
   1. Die Proben mit 0,2 % permeabilize TritonX-100 mit PBS-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur. Spülen Sie nach Permeabilisierung die Zellen sanft mit 1 mL PBS für drei Mal 5 min.
      Hinweis: Der optimale Zeitpunkt für die Zelle Permeabilisierung muss laut Zelltypen ermittelt werden. Nach Permeabilisierung fügen Sie 1 mL PBS von der Seite der Kultur Brunnen, verlassen Sie die Probe für 5 min auf dem Tisch. Verwenden Sie einen Labor-Shaker nicht um den minimalen Verlust von Zellen zu gewährleisten.
4. Blockieren
   1. Jede Probe 1 mL 10 % Ziegenserum in PBS hinzu und lassen Sie die Probe auf den Tisch für 1 h, unspezifischen Wechselwirkungen zu blockieren.
      Hinweis: Verwenden Sie keinen Lab-Shaker, um zu verhindern, dass die Zellen von der Folie lösen. Eine Spülung ist nicht notwendig in diesem Schritt.
5. Inkubation mit primären Antikörper
   1. Verdünnen Sie den primären Antikörper mit Primärantikörper Verdünnungspuffer.
      Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, muss die endgültige Verdünnungsverhältnis des primären Antikörpers durch Pretest ermittelt werden. Die Verdünnungsverhältnissen von Anti-Nestin (für undifferenzierte Stammzellen), Anti-β-Tubulin III (Neuron), Anti-O4 (für Oligodendrozyt), Anti-NF200 (für Reifen Neuronen), Anti-ChAT (für cholinerge Neuronen), Anti-LHX3 (für Motoneuronen), Anti-GABA (für GABAergen Neuronen), Anti-Serotonin (für serotonerge Neuronen) und Anti-TH (für dopaminergen Neuronen) sind 1: 80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 und 1: 100,.
   2. Gelten Sie 300 µL verdünnter Primärantikörper für verschiedene Proben.
   3. Inkubieren Sie die Zellproben über Nacht bei 4 ° c
      Hinweis: Es wird empfohlen, primären Antikörper bei 4 ° C zur Verringerung der Hintergrund und unspezifische Färbung auszubrüten.
   4. Entfernen Sie die primären Antikörper und sanft spülen die Zellen 3 X mit 1 mL PBS.
6. Inkubation mit Sekundärantikörper
   1. Verdünnen Sie die Cy3 konjugiert oder Alexa Fluor 488-konjugierten Sekundärantikörper mit 3 % Ziegenserum in PBS.
      Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, muss die endgültige Verdünnungsverhältnis des sekundären Antikörpers durch Pretest ermittelt werden.
   2. Gelten Sie 300 µL der relevanten Sekundärantikörper, jedem Primärantikörper zu erkennen.
      Hinweis: Die nachfolgenden Schritte müssen durchgeführt werden, in der Dunkelheit Fluoreszenzlöschung zu verhindern.
   3. Inkubieren Sie die Zellprobe im Dunkeln für 2 h bei Raumtemperatur.
   4. Entfernen Sie die sekundäre Antikörper zu und spülen Sie die Zellen sanft mit 1 mL PBS für 10 min bei Raumtemperatur.
7. Nukleare Färbung
   1. Gelten Sie 500 µL Arbeitslösung Hoechst 33258 die Zellprobe einzutauchen.
   2. Inkubieren Sie die Zellprobe im Dunkeln für 8 min bei Raumtemperatur, die Kerne zu kennzeichnen.
   3. Spülen Sie sanft die Zellen 3 X mit 1 mL PBS, jeweils 10 min. vor Licht geschützt.
      Hinweis: Für einen minimalen Verlust von Zellen, die optimale waschen Bedingung muss empirisch ermittelt werden.
8. Montage
   1. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium in der Mitte der Objektträger.
   2. Aus den Deckgläsern (mit Beispielen) mit einer Pinzette nehmen Sie und positionieren Sie sorgfältig die Probe auf das Eindeckmittel. Vermeiden Sie Luftblasen.
   3. Entfernen Sie alle überschüssigen Eindeckmittel mit saugfähigem Papier.
9. Fluoreszenz-Mikroskopie-Beobachtung
   1. Beobachten Sie die Proben unter die Fluoreszenz-Mikroskopie für Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 und Cy3 mit Filtern ausgestattet. Für jede Probe nach dem Zufallsprinzip wählen Sie mindestens 8 bis 12 Felder und Aufnahmen mit einer Kamera aus.

Ergebnisse

Zellmorphologie wurde unter den inversen Mikroskop jeden Tag nach der GAP-Behandlung beobachtet. Abbildung 2 zeigt die gewöhnliche invertierten Phasenkontrast-Lichtmikroskop Bilder von der Zelldifferenzierung in beiden Zelllinien. Die Plasma-behandelten Gruppe weist auf eine beschleunigte Differenzierung-Rate und eine hohe Differenzierung-Verhältnis im Vergleich zu der Kontrolle und Gas Flow-Gruppe.

Diskussion

C17.2-NSCs ist eine Art verewigt neurale Stammzellen Linie von Neugeborenen Mauszellen zerebelläre Körnerschicht, entwickelt von Snyder u.a.^10,11. C17.2-NSCs können in Neuronen und Astrozyten, Oligodendrozyten und sind weit verbreitet in Neurowissenschaften¹². In unseren früheren Studie konnte CAPs die Differenzierung des C17.2-NSCs in Neuronen verbessern. Eine Proof of Principle Studie wurde auch durchgeführt mit primären Ratte NSCs...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A